專利名稱：抗體的選擇性富集的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白、尤其是免疫球蛋白或具有Fe域的其他蛋白的純化方法。
現(xiàn)有技術(shù)生物分子(例如蛋白、聚核苷酸、多糖等)在作為藥物、診斷劑、食品添加劑、清潔劑等、研究試劑方面及對于許多其他應(yīng)用而言具有日益增加的商業(yè)重要性。通過自天然來源分離分子(例如在蛋白的情況下)通常不再能夠滿足對所述生物分子的需要，而需要使用生物技術(shù)制備方法。 蛋白的生物技術(shù)制備通常始于將DNA片段克隆至適合的表達(dá)載體中。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至適合的原核或真核表達(dá)細(xì)胞中且隨后選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞且表達(dá)所要蛋白。接著收集細(xì)胞或培養(yǎng)物上清液，且處理并純化其中所含的蛋白。在真核表達(dá)系統(tǒng)的情況下，即當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物(例如CHO或NSO細(xì)胞)時(shí)，在過去15年中細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中所要蛋白的濃度顯著增加，此可在表達(dá)步驟中達(dá)成。相比之下，在相同時(shí)期，在蛋白的后續(xù)純化中所用的色譜材料的結(jié)合能力僅略微增加。為此，迫切需要生物分子、尤其是蛋白的經(jīng)改良且最佳化的純化方法，所述方法可在大工業(yè)規(guī)模上進(jìn)行。在生物藥物(例如用作藥物的蛋白，例如治療性抗體)的情況下，除產(chǎn)物產(chǎn)率以夕卜，分離雜質(zhì)亦至關(guān)重要。方法依賴性雜質(zhì)與產(chǎn)物依賴性雜質(zhì)之間可加以區(qū)分。方法依賴性雜質(zhì)含有宿主細(xì)胞的組分，例如蛋白(宿主細(xì)胞蛋白，HCP)及核酸，且源于細(xì)胞培養(yǎng)(例如培養(yǎng)基的組分)或處理(例如鹽或溶解的色譜配位體)。產(chǎn)物依賴性雜質(zhì)為具有不同特性的產(chǎn)物分子變異體。這些變異體包括截短形式(例如前體及水解分解產(chǎn)物)，以及例如通過脫除氨基、不正確糖基化或誤連接二硫橋產(chǎn)生的經(jīng)修飾形式。產(chǎn)物依賴性變異體亦包括聚合物及聚集物。其他雜質(zhì)為污染物。此術(shù)語涵蓋具有化學(xué)、生物化學(xué)或微生物學(xué)性質(zhì)且不直接屬于制備方法的所有其他物質(zhì)。污染物的實(shí)施例包括可能以不需要的方式存在于細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒。在生物藥物的情況下，雜質(zhì)產(chǎn)生安全性問題。若通過注射或輸注將治療性蛋白直接給予血流中，如生物藥物中極常發(fā)生，則這些問題加劇。因此，宿主細(xì)胞組分可能引起過敏反應(yīng)或免疫病理學(xué)影響。此外，雜質(zhì)亦可能導(dǎo)致所給予的蛋白產(chǎn)生不需要的免疫原性，即其可能在患者體內(nèi)引發(fā)不需要的對治療劑的免疫反應(yīng)，從而可能造成危及生命的過敏性休克。因此，需要適合的純化方法，借助于所述方法可使所有非所需的物質(zhì)降至無害程度。另一方面，即使在生物藥物的情況下，仍不能忽視經(jīng)濟(jì)考慮因素。因此，所用制備及純化方法不應(yīng)損害由此制備的生物醫(yī)藥產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)生存力。作為蛋白的處理及加工步驟，(柱)色譜方法以及過濾及沉淀方法至關(guān)重要。因此，濃縮抗體的確切操作包括通過親和色譜純化的步驟。目前已知許多柱色譜方法及可用于這些方法的色譜材料。親和色譜基質(zhì)在工業(yè)純化各種物質(zhì)中用作固定相。經(jīng)固定的配位體可用于特定濃縮及純化對于所用特定配位體具有特定親和力的物質(zhì)。對于抗體(免疫球蛋白)的工業(yè)純化，尤其是單克隆抗體的純化，經(jīng)固定的蛋白A常常用于初始純化步驟。蛋白A為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的約41kDa的蛋白，其以高親和力(ICT8M-ICr12M人類IgG)結(jié)合于免疫球蛋白Fe區(qū)的CH2/CH3域。在蛋白A色譜中，移動相中具有蛋白A結(jié)合Fe區(qū)的免疫球蛋白或融合蛋白特異性結(jié)合于共價(jià)偶合至載體(例如瓊脂糖(Sepharose))的蛋白A配位體。金黃色葡萄球菌的蛋白A(野生型蛋白A)及經(jīng)遺傳修飾的重組蛋白A經(jīng)非共價(jià)相互作用而與抗體的恒定區(qū)(Fe片段)相互作用。此特異性相互作用可用于有效分離雜質(zhì)與抗體。通過改變pH,可刻意終止抗體與蛋白A配位體之間的相互作用且自固定相釋放或洗脫抗體。
除蛋白A作為親和配位體以外，目前已知許多結(jié)合于Fe片段的其他分子。因此， 使用蛋白A的個(gè)別域替代完整蛋白(8)。已知與蛋白A的B域確切不同的蛋白變異體，其適合結(jié)合含F(xiàn)e片段的分子(16，17)。這些不同變異體基本上不同在于突變，所述突變已插入以提高穩(wěn)定性或結(jié)合親和力。這些B域的突變體通常稱作Z域或蛋白Z。除蛋白A或蛋白G以外，多種肽亦適合選擇性結(jié)合于Fe片段(14)?，F(xiàn)今對Fe片段的親和配位體的極大關(guān)注使得吾人推測會發(fā)現(xiàn)更多親和配位體。然而，親和色譜及尤其是經(jīng)常使用的蛋白A色譜花費(fèi)高，且確切而言，當(dāng)發(fā)酵槽中產(chǎn)物濃度增加且有大量產(chǎn)物時(shí)，可進(jìn)行的色譜純化方法有所限制。關(guān)鍵點(diǎn)為裝載量、循環(huán)數(shù)、處理時(shí)間、池體積及緩沖液的量。因此，將來需要替代性純化方法。包括親和色譜及親和色譜的替代方法的常規(guī)純化策略的一般概述可見于以下文章中(7，10)。新近親和色譜方法不使用恒定固定的親和配位體，而是始于與標(biāo)靶蛋白混合的溶解親和配位體(11)。該親和配位體帶有融合標(biāo)記或融合蛋白，可能使該親和配位體固定于固相上，該固定發(fā)生于第二步驟中。在下一步驟中，如在常規(guī)親和色譜中，標(biāo)靶蛋白與配位體在適合條件下分離且因此自柱洗脫。在此所述的本發(fā)明使用親和沉淀替代親和色譜來純化生物分子。此方法在較大規(guī)模使用時(shí)確實(shí)顯示具有極大潛力(1，2)。親和沉淀為最有效的蛋白沉淀方法(2)。蛋白自溶液中沉淀一般為經(jīng)常使用的熟知方法。因此，許多蛋白已通過蛋白混合物進(jìn)行硫酸銨沉淀而自溶液中分離。在此沉淀期間，大分子(例如蛋白)自溶液移出且轉(zhuǎn)化為粒子。視粒子與溶液之間的密度差異及粒子直徑而定，此步驟導(dǎo)致沉淀。然而，此沉淀通常非特異地發(fā)生。因此，為更選擇性地濃縮分子(例如蛋白)，開發(fā)出親和沉淀。親和沉淀是利用親和分子與標(biāo)靶分子的選擇性結(jié)合。親和分子可為例如蛋白、肽、寡核苷酸或小化學(xué)分子。親和沉淀在兩種原理之間有所區(qū)別，這兩種原理為第一級親和沉淀及第二級親和沉淀(7)。在第一級親和沉淀中，親和分子與標(biāo)靶分子均具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，使得兩個(gè)分子之間有可能形成網(wǎng)絡(luò)，且形成在特定尺寸下沉降的親和復(fù)合物。在第二級親和沉淀中，使用例如親和巨型配位體(AML)。在此類型的沉淀中，親和分子結(jié)合于可刺激性物質(zhì)(通常為聚合物)?？纱碳ば晕镔|(zhì)因環(huán)境條件改變(例如PH值或溫度變化)而改變其溶解特征，且發(fā)生沉淀。不同于第一級親和沉淀，不需要雙官能親和分子或雙官能標(biāo)靶分子。在普遍使用的親和沉淀中，目前親和配位體偶合至聚合物或其他介質(zhì)(15)。含F(xiàn)e片段的分子的親和沉淀已描述于許多研究中。目前最常見應(yīng)用的特征為使用所謂的“智慧型聚合物(smart polymer)”?！爸腔坌途酆衔铩?或刺激反應(yīng)性“智能”聚合物或親和巨型配位體)為可對外部影響(物理或化學(xué)刺激)作出反應(yīng)而改變特性的聚合物。這些刺激可為例如PH值或溫度變化(12-13)。通常，智慧型聚合物對其刺激作出反應(yīng)而在溶液中沉淀。在上清溶液進(jìn)行所要分離之后，通過適合條件可使此沉淀逆轉(zhuǎn)。智慧型聚合物可與多種生物分子結(jié)合，從而使得可用于各種應(yīng)用的聚合物/生物分子系統(tǒng)大量積聚。這些生物分子的實(shí)施例包括蛋白、寡核苷酸及糖。另一形式的親和沉淀為最近公開的“親和浸沒(affinity sinking)”方法。在此形式的親和沉淀中，使用連接分子骨架使許多親和配位體彼此結(jié)合。此繼而使得有可能形 成沉淀所需的網(wǎng)絡(luò)。親和配位體與網(wǎng)絡(luò)形成物的結(jié)合可以以非共價(jià)方式與共價(jià)方式進(jìn)行。此方法最近描述于專利 “Compositions and methods for purifying and crystallizingmolecules of interest”中(6)。在此方法中，首先將含有抗體的溶液與共價(jià)結(jié)合于交聯(lián)劑的親和配位體混合。未觀察到沉淀。僅在隨后添加配位離子或分子之后，方產(chǎn)生沉淀。在第二種類似應(yīng)用中，親和配位體連接于生物素結(jié)合蛋白，該生物素結(jié)合蛋白與介質(zhì)抗生物素蛋白形成網(wǎng)絡(luò)(9)。美國專利7，083，943描述如下親和沉淀其中標(biāo)靶蛋白的結(jié)合域連接于骨架域，該骨架域的氨基酸序列預(yù)期可有助于發(fā)生沉淀的趨勢。Chen及Hoffman (15)描述IgG與聚(N-異丙基丙烯酰胺)-蛋白A結(jié)合物的親和沉淀。然而，抗體與未經(jīng)修飾的蛋白A的沉淀尚未證實(shí)有效?，F(xiàn)有技術(shù)中所述的方法的一個(gè)缺陷為，在第一級親和沉淀期間，沉淀僅可能經(jīng)由交聯(lián)分子達(dá)成；或在第二級親和沉淀中，需要可刺激性物質(zhì)。最為熟知的親和沉淀的其他缺陷一方面為a)位阻，其中標(biāo)靶蛋白的結(jié)合受高分子親和巨型配位體的結(jié)合的限制；b)已沉淀的聚合物復(fù)合物的再溶解較緩慢；c)雜質(zhì)的非特異性共沉淀，此一般需要第二沉淀步驟；d)使親和蛋白與聚合物或與交聯(lián)劑結(jié)合的額外步驟(2-5)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及利用具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合蛋白的親和沉淀，其完全不需要額外的融合蛋白或連接分子。親和蛋白本身足以用于沉淀，且不需要固定相。在此所用的發(fā)明內(nèi)容亦可較容易地回收親和蛋白。本發(fā)明尤其涉及一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有Fe域的其他蛋白(標(biāo)靶蛋白)的方法，其包括以下步驟a.制備含有標(biāo)靶蛋白的溶液；b.在允許發(fā)生結(jié)合的條件下引入確切具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Fe結(jié)合蛋白；c.自液相分離沉淀物；d.解除標(biāo)靶蛋白與Fe結(jié)合蛋白的結(jié)合。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種方法，其中Fe結(jié)合蛋白為蛋白A或蛋白G的Fe結(jié)合域的二聚體。優(yōu)選地，該二聚體的兩個(gè)單體經(jīng)由二硫橋彼此連接。
在另一方面中，本發(fā)明涉及一種方法，其中二聚體為均二聚體，其單體具有SEQ IDNO: I、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7 或與 SEQ ID NO: I 的不同之處在于 1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)氨基酸的序列。在另一方面中，所用Fe結(jié)合蛋白相對于標(biāo)靶蛋白的比率為0. 5-20。步驟a.中溶液的PH值優(yōu)選為5. 5-8。優(yōu)選地，步驟d.中的結(jié)合解除在2-4. 5的pH值進(jìn)行。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種由2個(gè)相同亞單元組成的Fe結(jié)合蛋白，所述亞單元具有序列 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7 或與 SEQ ID NO: I 的不同之處在于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)氨基酸的序列，該兩個(gè)亞單元經(jīng)由共價(jià)鍵彼此連接。優(yōu)選地，該共價(jià)鍵為二硫鍵。


圖I a 二聚體的SDS-PAGE。為顯示經(jīng)由半胱氨酸達(dá)成的二聚，在施用于SDS-PAGE 之前添加碘乙酰胺或碘乙酰胺與二硫蘇糖醇
~與0. 6 y mo I碘乙酰胺混合的重組Z- 二聚體
—I與0. 3y mol DTT及碘乙酰胺混合的重組Z- 二聚體
~純的重組Z- 二聚體
4科姆比標(biāo)記物(Kombi marker)
~與0. 2 y mol碘乙酰胺混合的重組Z- 二聚體
6與0. I y mol DTT及0. 2 y mol碘乙酰胺混合的重組Z- 二聚體
~純的重組Z- 二聚體圖2 :使用Z- 二聚體進(jìn)行的親和沉淀。作為第一步驟，使蛋白Z氧化。在第二步驟中，向含有抗體(mAB)的溶液中添加Z- 二聚體，這使得抗體選擇性沉淀；圖3 :在酸性條件下分離Z 二聚體與抗體的離子交換色譜的UV圖(實(shí)驗(yàn)2)。220nm下的UV色譜圖以紅色顯示，280nm下的UV色譜圖以藍(lán)色顯示，且緩沖液B (20mM磷酸鹽，3MNaCl)的遞增含量以綠色顯示；圖4 :實(shí)驗(yàn) 2 的 SDS-PAGE
~經(jīng)純化的抗體
~~2蛋白Z 二聚體
權(quán)利要求
1.一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有Fe域的其他蛋白(標(biāo)靶蛋白)的方法，所述方法包括以下步驟 a.制備含有該標(biāo)革巴蛋白的溶液； b.在允許發(fā)生結(jié)合的條件下引入確切具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Fe結(jié)合蛋白； c.自液相分離沉淀物； d.解除該標(biāo)革巴蛋白與該Fe結(jié)合蛋白的結(jié)合。
2.權(quán)利要求I的方法，其特征在于該Fe結(jié)合蛋白為蛋白A或蛋白G的Fe結(jié)合域的二聚體。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于該Fe結(jié)合域包含或含有序列SEQID NO: I至SEQ IDNO: 11 之一。
4.權(quán)利要求2或3的方法,其特征在于該二聚體的兩個(gè)單體由二硫橋連接在一起。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于該二聚體為均二聚體，其單體具有序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 7 或與 SEQ ID NO: I 不同之處在于 I、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)氨基酸的序列。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用該Fe結(jié)合蛋白相對于該標(biāo)靶蛋白的摩爾比為0. 5-20。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟a.中該溶液的pH為5.5-9，優(yōu)選為6-8。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟d.中的結(jié)合解除在2-4.5的pH發(fā)生。
9.一種Fe結(jié)合蛋白，其由2個(gè)相同亞單元組成,所述亞單元具有序列SEQ ID NO: 1>SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7 或與 SEQ ID NO: I 不同之處在于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸的序列，其中該兩個(gè)亞單元經(jīng)由共價(jià)鍵連接在一起。
10.權(quán)利要求9的Fe結(jié)合蛋白，其特征在于該共價(jià)鍵為二硫鍵。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有Fc域的其他蛋白(標(biāo)靶蛋白)的方法，其包括以下步驟e.制備含有標(biāo)靶蛋白的溶液；f.在允許發(fā)生結(jié)合的條件下引入精確具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Fc結(jié)合蛋白；g.自液相分離沉淀物；h.解除標(biāo)靶蛋白與Fc結(jié)合蛋白的結(jié)合。
文檔編號C07K14/31GK102791728SQ201180012227
公開日2012年11月21日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者D.安布羅修斯, M.迪特爾勒, M-K.霍耶, P.多伯西恩 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司