本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蘋果斑點(diǎn)落葉病是蘋果最主要真菌性病害之一，可通過向葉片釋放各類毒力因子和效應(yīng)因子影響植物代謝，使葉片出現(xiàn)過氧化物積累和細(xì)胞死亡。一系列研究表明，植物的抗病機(jī)制是病原菌侵入植物時(shí)，首先是位于細(xì)胞質(zhì)膜的受體激酶會(huì)在識(shí)別病原菌后激活下游MAPK等信號(hào)途徑使植物產(chǎn)生抗病性(PTI途徑)；由于植物的抗病性使得病原菌會(huì)進(jìn)化出一系列效應(yīng)因子來克服植物的抗病性；為了識(shí)別病原菌的效應(yīng)因子，植物也演化出一系列抗病基因(R基因)，激活抗病反應(yīng)(ETI途徑)，而miRNA是調(diào)控抗病基因的重要調(diào)控因子。

傳統(tǒng)方法采用藥劑防治病害會(huì)影響食品安全或造成環(huán)境污染。通過設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序的鑒定方法可篩選蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性資源，選育抗性蘋果品種是解決這一問題的最有效途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

本發(fā)明以感病品種‘金冠’為試材利用miRNA二代測(cè)序篩選出接種蘋果斑點(diǎn)落葉病Alternaria Alternariaf.spmali(ALT1)前后表達(dá)差異2倍以上的miRNA，獲得一個(gè)新的miRNA，將其命名為Md-miRLn12(SEQ ID NO:5)。由于蘋果感病品種葉片接種ALT1后Md-miRLn12及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄本Md-MIRLn12-277表達(dá)會(huì)明顯升高，但抗性品種無顯著變化；因此克隆比較了二者M(jìn)d-MIRLn12-277及其啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)抗性品種與感病品種Md-MIRLn12-277序列相同，但啟動(dòng)子區(qū)存在3個(gè)堿基不同，其中-1186bp SNP位點(diǎn)是決定Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子活性的位點(diǎn)。因此，發(fā)明人通過這個(gè)SNP位點(diǎn)開發(fā)了選育抗斑點(diǎn)落葉病蘋果品種的分子標(biāo)記。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，所述SNP分子標(biāo)記位于用于調(diào)控蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性的Md-miRLn12的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本Md-MIRLn12-277的啟動(dòng)子上，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該序列的378bp處堿基為T的蘋果品種對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病的抗性顯著高于此處堿基為G的蘋果品種。用于調(diào)控蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性的Md-miRLn12的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本Md-MIRLn12-277的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本發(fā)明還提供用于檢測(cè)所述與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的引物，包括正向引物F5’-AACACAGGGAGCACTTCTATTG-3’和反向引物R5'-GTCCGTTATTATACGAATAATTGG-3'。

本發(fā)明還提供所述與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記在鑒定蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性品種及感病品種中的應(yīng)用，包括以下步驟：

1)提取待測(cè)蘋果植株的基因組DNA；

2)以待測(cè)蘋果植株的基因組DNA為模板，利用所述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中378bp處的堿基為T，則待測(cè)蘋果植株屬于蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性品種；如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中378bp處的堿基為G，則待測(cè)蘋果植株屬于蘋果斑點(diǎn)落葉病感病品種。

具體可根據(jù)測(cè)序堿基差異和測(cè)序峰圖判斷不同蘋果栽培品種對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性?？剐云贩N中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處為T，測(cè)序峰圖為T單峰；中性品種中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處G和T同時(shí)存在，測(cè)序峰圖為G和T套峰；感病品種中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處為G，測(cè)序峰圖為G單峰。

本發(fā)明還提供含有所述引物的用于檢測(cè)蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性蘋果品種的試劑盒。

本發(fā)明還提供所述與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記在蘋果分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種用于調(diào)控蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性的Md-miRLn12的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本Md-MIRLn12-277，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。該基因編碼的成熟miRNA為Md-miRLn12(SEQ ID NO:5)。在蘋果斑點(diǎn)落葉病感病蘋果植株中抑制Md-miRLn12的表達(dá)，可提高感病品種對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病的抗性；同時(shí)，在蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性蘋果植株中過表達(dá)Md-miRLn12，可降低抗性品種對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病的抗病性。

本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體上攜帶含有Md-miRLn12的模擬靶標(biāo)串聯(lián)序列(STTM，序列如SEQ ID NO:6所示)的表達(dá)盒。

攜帶有所述目的基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463頁；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供Md-miRLn12在調(diào)控蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性中的應(yīng)用，利用基因工程的手段，通過抑制Md-miRLn12在蘋果斑點(diǎn)落葉病感病蘋果植株中的表達(dá)，從而提高感病植株對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病的抗性。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將合成的Md-miRLn12的模擬靶基因串聯(lián)序列(STTM，序列如SEQ ID NO:6所示)構(gòu)建到pFGC5941載體上(NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)之間)，采用農(nóng)桿菌(GV3101)介導(dǎo)的方法，在感病蘋果品種中瞬時(shí)表達(dá)，可提高轉(zhuǎn)基因植株的抗病性。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明可以有效解決藥劑防治蘋果斑點(diǎn)落葉病病害影響食品安全或造成環(huán)境污染等問題，通過設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序的鑒定方法，解決了選育抗性品種的問題，并且可以篩選蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性資源，同時(shí)也解決了果樹轉(zhuǎn)基因，雜交技術(shù)較難，耗時(shí)長(zhǎng)且不方便鑒定的問題。本發(fā)明提供的方法快速、靈敏，準(zhǔn)確性高，簡(jiǎn)便，能夠應(yīng)用于蘋果屬植物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1接種ALT1后1小時(shí)、2小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，Md-miRLn2分別在抗性品種‘寒富’和感病品種‘金冠’表達(dá)變化，以不接菌表達(dá)量作為對(duì)照(0小時(shí))。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2在感病品種‘金冠’中沉默Md-miRLn12可以增強(qiáng)感病品種抗病性。其中，A：載體示意圖；B：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)感病品種‘金冠’組培苗4天后接菌，接種48小時(shí)后通過Northern檢測(cè)Md-miRLn12表達(dá)量；C：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)感病品種‘金冠’組培苗4天后接菌，接種48小時(shí)后檢測(cè)發(fā)病率及病癥；WT代表不進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’組培苗；SC代表劃傷不進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’組培苗；EV代表pFGC5941空載進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’組培苗；STTM-Md-miRLn12代表沉默Md-miRLn12的pFGC5941載體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’組培苗。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2在抗病品種‘寒富’中過表達(dá)Md-miRLn12可以降低抗病品種抗病性。其中，A：載體示意圖；B：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)抗性品種‘寒富’組培苗4天后接菌，接種48小時(shí)后通過Northern檢測(cè)Md-miRLn12表達(dá)量；C：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)抗性品種‘寒富’組培苗4天后接菌，接種48小時(shí)后檢測(cè)發(fā)病率及病癥；WT代表不進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)‘寒富’組培苗；SC代表劃傷不進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)‘寒富’組培苗；EV代表pFGC5941空載進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)‘寒富’組培苗；OE-Md-miRLn12代表過表達(dá)Md-miRLn12的pFGC5941載體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)‘寒富’組培苗。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中感病品種‘金冠’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子和抗性品種‘寒富’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列比較結(jié)果。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中分別將抗性品種‘寒富’和感病品種‘金冠’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子融合GUS后，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’和‘寒富’蘋果組培苗，接菌前后的GUS染色及GUS活性檢測(cè)結(jié)果。其中，A：分別將抗性品種‘寒富’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子和感病品種‘金冠’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子分別融合GUS載體示意圖；B：分別將抗性品種‘寒富’和感病品種‘金冠’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子融合GUS后農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’和‘寒富’蘋果組培苗4天后接菌，接種48小時(shí)后進(jìn)行GUS染色及GUS活性檢測(cè)。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中分別將突變-1186bp處的抗性品種‘寒富’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子和感病品種‘金冠’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子融合GUS后，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’和‘寒富’蘋果組培苗，接菌前后的GUS染色及GUS活性檢測(cè)結(jié)果。其中，A：分別將突變-1186bp處的抗性品種‘寒富’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子和感病品種‘金冠’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子融合GUS載體示意圖；B：分別將突變-1186bp處的抗性品種‘寒富’和感病品種‘金冠’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子融合GUS后農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’和‘寒富’蘋果組培苗4天后接菌，接種48小時(shí)后進(jìn)行GUS染色及GUS活性檢測(cè)。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中35種蘋果品種Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列(1563bp)PCR擴(kuò)增電泳圖。其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-35分別為‘寒富’、‘Ⅱ8-19’、‘斯塔克矮金冠’、‘雞冠’、‘蜜金’、‘紅夏’、‘斯塔克金矮生’、‘柳玉’、‘國帥’、‘列湟特加拿大’、‘喬雅爾’、‘60-4-4’、‘白羅斯馬林’、‘早金冠’、‘初笑’、‘青葡1號(hào)’、‘女游擊隊(duì)員’、‘金沙以拉木’、‘拿破侖’、‘美爾塔什’、‘莫斯科透明’、‘富士’、‘早生鶴之卵’、‘理想’、‘克龍謝爾透明’、‘紅金’、‘瑞光’、‘榮冠’、‘花嫁’、‘黃魁’、‘伏帥’、‘嘎啦’、‘檳子’、‘麻姑’、‘金冠’。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中根據(jù)測(cè)序峰圖分析，判斷不同蘋果栽培品種對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病的抗性。其中，上圖代表抗性品種，中間圖代表中性品種，下圖代表感病品種?？剐云贩N中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處為T，測(cè)序峰圖為T單峰；中性品種中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處G和T同時(shí)存在，測(cè)序峰圖為G和T套峰；感病品種中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處為G，測(cè)序峰圖為G單峰。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例4中熒光定量PCR檢測(cè)35個(gè)蘋果栽培品種在接菌ALT1后1小時(shí)、2小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，Md-miRLn12與Md-MIRLn12-277的表達(dá)量。抗性品種中，接菌ALT1后Md-miRLn12與Md-MIRLn12-277的表達(dá)量較低；感病品種中，接菌ALT1后Md-miRLn12與Md-MIRLn12-277的表達(dá)量較高。以不接菌表達(dá)量作為對(duì)照(0小時(shí))。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1 Md-miRLn12的發(fā)現(xiàn)

以感病品種‘金冠’為試材篩選接種蘋果斑點(diǎn)落葉病Alternaria Alternariaf.spmali(ALT1)前后表達(dá)差異2倍以上的miRNA，與miRBase(http://www.mirbase.org/)和蘋果基因組(https://www.rosaceae.org/)中比對(duì)，獲得一個(gè)新的miRNA，將其命名為Md-miRLn12(SEQ ID NO:5)，并獲得Md-miRLn12初級(jí)轉(zhuǎn)錄本初級(jí)轉(zhuǎn)錄本Md-MIRLn12-277(SEQ ID NO:4)由于蘋果感病品種葉片接種ALT1后Md-miRLn12及其Md-MIRLn12-277表達(dá)會(huì)明顯升高，但抗性品種無顯著變化；因此克隆比較了二者M(jìn)d-MIRLn12-277及其啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)抗性品種與感病品種Md-MIRLn12-277序列相同，但啟動(dòng)子區(qū)存在3個(gè)堿基不同。通過GUS染色及GUS活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，證明Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子-1186bp SNP位點(diǎn)是決定Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子活性的位點(diǎn)?？衫眠@個(gè)SNP位點(diǎn)開發(fā)出選育抗斑點(diǎn)落葉病蘋果品種的分子標(biāo)記。

具體方法如下：

1、植物總RNA提取

(1)蘋果‘金冠’各組織樣品取1g在液氮中快速研磨，然后轉(zhuǎn)入裝有預(yù)熱的CTAB(700μL)的2mL離心管中，震蕩混勻后65℃水浴30min，每10min顛倒混勻一次；

(2)加入700μL CI(氯仿/異戊醇體積比＝24:1)，顛倒混勻1min；

(3)4℃13000rpm 10min；

(4)取上清，加入等體積的CI，顛倒混勻1min；

(5)4℃13000rpm 10min；

(6)將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)裝有0.1倍體積的3M/L Na₂AC的離心管中，再加入等體積的異丙醇，-70℃存放1小時(shí)以上。

(7)4℃10000rpm 20min，然后棄上清并將液體吹干；

(8)加入70％乙醇清洗沉淀2次；

(9)10000rpm離心15min，棄上清并將離心管倒扣在吸水紙上晾干，最終溶解在80μL無菌水中。

總RNA中DNA的去除：

(1)在1.5mL PCR管中加入以下成分：

(2)按照以上體系混勻后37℃處理30min；加入100μL無RNase水(0.1％DEPC處理后的水)；加入等體積CI混勻；

(3)4℃ 10000rpm離心20min；取上清加入等體積CI顛倒混勻，4℃ 10000rpm離心20min；

(4)取上清，2.5倍體積的無水乙醇，-70℃沉淀2h；4℃，10000rpm離心20min；棄上清，沉淀吹干后加入75％乙醇清洗，10000rpm離心5min；

(5)低溫下吹風(fēng)機(jī)吹干沉淀，然后溶于30-50μL DEPC水或無RNase水中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm處吸光度計(jì)算RNA濃度。

2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及步驟

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：

RNA 2μg

特異性莖環(huán)引物(10μM) 1μL

DEPC水 補(bǔ)足至12μL

冰上加樣并混勻，短暫離心，70℃5min，然后馬上置于冰上5min。

反應(yīng)體系如下：

輕彈混勻，短暫離心，42℃1h，70℃10min。

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物冷卻后放入-80℃冰箱保存或直接用于PCR反應(yīng)。

3、熒光定量反應(yīng)體系

設(shè)計(jì)Md-miRLn12特異引物(F：tgcactagcgtgtttgaacaag，R：acatcgtatcgtgaag)，用SYBR Green熒光定量預(yù)混液(TIANGEN,FP121221)在Applied Biosystems 7500進(jìn)行熒光定量，PCR反應(yīng)程序如下：95℃，15mins；95℃10sec，60℃30sec，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果利用2^-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(Livak and Schmittgen,2001)。

接種蘋果斑點(diǎn)落葉病病原(ALT1)后，Md-miRLn2分別在抗性品種‘寒富’和感病品種‘金冠’表達(dá)變化見圖1。

實(shí)施例2用于調(diào)控蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性的基因Md-miRLn12的獲得

合成Md-miRLn12的模擬靶基因串聯(lián)序列(STTM，序列如SEQ IDNO:6所示)構(gòu)建到pFGC5941載體上(NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)之間)，用來沉默內(nèi)源Md-miRLn12。農(nóng)桿菌介導(dǎo)(GV3101)的瞬時(shí)表達(dá)感病品種‘金冠’蘋果組培苗葉片，4d后接種ALT1，2d后檢測(cè)結(jié)果表明，Md-miRLn12表達(dá)量降低，葉片發(fā)病率顯著降低并且病癥較輕。說明在感病品種‘金冠’中沉默Md-miRLn12可以增強(qiáng)感病品種抗病性(圖2)。

將Md-miRLn12初級(jí)轉(zhuǎn)錄本Md-MIRLn12-277序列構(gòu)建到pFGC5941載體上，用來過表達(dá)Md-miRLn12。農(nóng)桿菌介導(dǎo)(GV3101)的瞬時(shí)表達(dá)抗性品種‘寒富’組培苗葉片，4天后接菌ALT1，接種48小時(shí)后檢測(cè)表明，Md-miRLn12表達(dá)上升的同時(shí)，發(fā)病率上升并且病癥嚴(yán)重。說明在抗病品種‘寒富’中過表達(dá)Md-miRLn12可以降低抗病品種抗病性(圖3)。

具體方法如下：

1、miRNA Northern法檢測(cè)

合成5’端修飾地高辛標(biāo)記的Md-miRLn12和U6探針(Md-miRLn12_probe：AGGGAGCAAATCTTGTTCAAA；U6_probe：CTCGATTTATGCGTGTCATCCTTGC)。取60μg RNA(CTAB提取)加入2×loading buffer，95℃5min，然后4℃冷卻，上樣于15％聚丙烯酰胺凝膠(含7M尿素)，1×TBS buffer中100V電泳3h；1×TBS buffer中300mA，4℃電轉(zhuǎn)于尼龍膜上；1200mJ紫外交聯(lián)2mins，利用地高辛雜交檢測(cè)試劑盒(Mylab corporation)進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗膜和信號(hào)檢測(cè)。

2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

(1)取一管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，冰上完全溶解后輕輕懸浮細(xì)胞。

(2)加入5-10μL植物表達(dá)載體質(zhì)粒，輕輕混勻，冰上放置30min。

(3)液氮中冷激1min。

(4)37℃熱激5min，冰上放置2min。

(5)加入500μL YEP培養(yǎng)基，于28℃ 140rpm振蕩培養(yǎng)4-6h。

(6)室溫4000rpm離心3min，去除約400μL上清液，用剩余的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。

(7)將細(xì)菌涂布在加有抗生素(50mg/L Km，20mg/L Rif)的固體YEP培養(yǎng)基上。

(8)將平板于28℃倒置培養(yǎng)(24-48h)。

3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)

蘋果‘金冠’、‘寒富’組培苗苗培養(yǎng)于25℃，50％濕度的光照培養(yǎng)箱中，晝夜長(zhǎng)度保持為16-8h，光照強(qiáng)度為200μmol·m-²·s-¹。待植株5-6片真葉展開時(shí)對(duì)每個(gè)單株編號(hào)并取一片真葉保存后進(jìn)行農(nóng)桿菌注射。農(nóng)桿菌注射方法參見Bai等(Bai et al.2011)。

(1)預(yù)培養(yǎng)：YEP 2ml(50mg/L Km，20mg/L Rif)，農(nóng)桿菌菌斑或甘油菌28℃，180rpm培養(yǎng)過夜。

(2)本培養(yǎng)：YEP培養(yǎng)基4ml(加對(duì)應(yīng)的抗生素和10μM乙酰丁香酮)，加入1/50體積的菌液(80μL)，28℃180rpm培養(yǎng)12-16h。

(3)室溫10000rpm，1min離心，除去培養(yǎng)基，用1-2ml懸濁液懸浮菌體(可以渦旋震蕩)。

取10μL菌液加入990μL懸濁液中，用分光光度計(jì)測(cè)定OD₆₀₀，將菌體懸濁液調(diào)整至OD₆₀₀＝1.0。室溫靜置2-5h。

懸濁液：(10mM MES-KOH(pH5.2)，10mM MgCl₂,100μM乙酰丁香酮)。

(4)菌液使用前渦旋震蕩或用槍吸打懸浮菌體，用沒有針頭的1ml注射器吸取菌液。

(5)避開葉脈，用注射器針在葉片上開小孔后，用裝有菌液的注射器壓住小孔，另一只手的手指在葉片反方向壓住小孔，慢慢用力，將菌液注射入葉片中，注射好的部分的顏色會(huì)變淺。每個(gè)葉片注射1-2個(gè)孔。

(6)4天觀察。

實(shí)施例3感病品種和抗性品種Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列的克隆及啟動(dòng)活性比較

ALT1接種蘋果‘寒富’和‘金冠’組培苗葉片，接菌48小時(shí)后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感病品種‘金冠’Md-miRLn12及Md-MIRLn12-277表達(dá)上升，而抗性品種‘寒富’Md-miRLn12及Md-MIRLn12-277均表達(dá)較低。故克隆了Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)感病品種‘金冠’和抗性品種‘寒富’存在三個(gè)SNP差異位點(diǎn)，分別是-1506bp(C-T)，-1186bp(G-T)和-175bp(A-G)。(圖4)

分別將抗性品種‘寒富’和感病品種‘金冠’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子融合GUS后，分別構(gòu)建到載體pCAMBIA1305上，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’和‘寒富’蘋果組培苗葉片，檢測(cè)結(jié)果表明，感病品種Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子具有較強(qiáng)啟動(dòng)子活性，而抗性品種Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子活性較弱。(圖5)

當(dāng)突變-1186bp(G-T)時(shí)，抗性品種Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子活性恢復(fù)；感病品種Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子-1186bp處的G突變成抗性品種的T后融合GUS，分別構(gòu)建到載體pCAMBIA1305上，分別農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)‘金冠’蘋果組培苗葉片，4天后接菌，接種48小時(shí)后檢測(cè)表明，感病品種Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子則活性下降。證明抗性品種Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子-1186bp處(T-G)的堿基替換導(dǎo)致其活性下降。(圖6)

GUS染色方法如下：

蘋果植株放入含有0.2M NaH₂PO₄·2H₂O，0.2M NaH₂PO₄·12H₂O，100mM X-Gluc和10％甲醇的GUS染色液中，37℃孵育兩天，70％乙醇脫色過夜后觀察染色情況。

GUS活性檢測(cè)方法如下：

(1)取新鮮的植物組織100mg左右，用液氮將生物材料急速冷凍，然后采用液氮研磨的方式在研缽里磨碎組織。如果不立即研磨，可以先將液氮冷凍處理的植物組織儲(chǔ)存于-80℃冰箱。

(2)將研磨破碎的組織轉(zhuǎn)到EP管里，并立即加入1ml的GUS提取緩沖液，充分混勻。

(3)12 000rpm，4℃離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一潔凈的EP管，冰上放置待用。

(4)取7個(gè)EP管，分別加入0μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl的BSA標(biāo)準(zhǔn)液，用水補(bǔ)至相同體積20μl。加入980μl的考馬斯亮藍(lán)G250溶液，充分混勻，冰上靜置5min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定595nm處的吸收值。以蛋白濃度(mg/ml)對(duì)吸收值A(chǔ)595做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5)取待測(cè)蛋白樣品10μl，加10μl水，加入980μl的考馬斯亮藍(lán)G250溶液，充分混勻，冰上靜置5min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定595nm處的吸收值。代入公式，求出蛋白樣品的濃度。

(6)取100μl蛋白上清，加入400μl 37℃預(yù)熱的GUS提取緩沖液里，再加入500μl MUG底物，37℃溫浴。在0min、15min、30min、45min和60min分別取混合反應(yīng)物200ul加入到800ul反應(yīng)終止液，室溫避光保存。

(7)用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)365nm、發(fā)射波長(zhǎng)455nm下，狹縫10nm時(shí)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值。

(8)以熒光強(qiáng)度值對(duì)反應(yīng)時(shí)間作曲線，求出單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化。

(9)用單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化除以參加反應(yīng)的蛋白量，求出單位質(zhì)量的蛋白單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化。

實(shí)施例4 SNP引物的開發(fā)與利用

本實(shí)施例中的蘋果屬35個(gè)蘋果品種采自遼寧省興城市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家果樹種質(zhì)資源圃長(zhǎng)勢(shì)一致葉片。

1、基因組DNA提取

(1)1g葉片液氮研磨，轉(zhuǎn)入一個(gè)2.0mL離心管中，加入800μl2×CTAB(2％CTAB，10mM Tris-HCl，1.4M NaCl，1％PVP)，稍振蕩混勻，放于65℃水浴中20-40min，期間輕搖幾次。

(2)降至室溫后，加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24:1)，室溫12000rpm離心10分鐘。

(3)取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24:1)，12000rpm離心10分鐘。

(4)上清中加入2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30min。

(5)12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗兩次，晾干沉淀，溶于適量雙蒸水中。

(6)若需要，按100μl加1μl RNA酶比例進(jìn)行去RNA處理，37℃30分鐘。用CI抽提一遍。

再用乙醇沉淀，沉淀溶于適量雙蒸水中。

(7)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm處吸光度計(jì)算DNA濃度。

2、Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列克隆

根據(jù)蘋果基因組(https://www.rosaceae.org/)Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列(MDC008796.277)設(shè)計(jì)引物。

使用的引物序列如下：

上游引物：5’-AACACAGGGAGCACTTCTATTG-3’

下游引物：5’-GTCCGTTATTATACGAATAATTGG-3’

上述引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix(Dye)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,CW0682A)。

PCR反應(yīng)程序如下：

94℃預(yù)變性3min；94℃40s，61℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸2min。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)：根據(jù)目標(biāo)片段大小制作1％瓊脂糖凝膠，0.1％TAE電泳緩沖液，70-110v電壓電泳約15min，溴化乙啶染色，紫外燈下檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小，結(jié)果見圖7。

3、目的片段瓊脂糖凝膠回收

使用AXYGEN公司回收試劑盒，方法參照說明書。

(1)切取含有目的DNA片斷的瓊脂糖，盡量切除多余凝膠，加入3個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化。

(2)加0.5個(gè)Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻。

(3)將混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管(2ml離心管)中，12,000×g離心60s，倒掉收集管中的廢液，重復(fù)操作一次。

(4)將制備管置回2ml離心管，加入500μl Buffer W1,12,000×g離心30s，倒掉收集管中的廢液。

(5)將制備管置回2ml離心管，加入700μl Buffer W2,12,000×g離心30s，倒掉收集管中的廢液。以同樣的方法再用700μl Buffer W2,12,000×g離心60s。

(6)將制備管置回2ml離心管中，12,000×g離心60s。

(7)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在制備膜中央加25-30μl已加熱至65℃的Eluent或去離子水，室溫靜置1min。12,000×g離心60s洗脫DNA。

送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示目的片段均為1563bp。

4、Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN(Lynnon BioSoft)和BioEdit等軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析和測(cè)序峰圖分析，判斷不同蘋果栽培品種對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性?？剐云贩N中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處為T，測(cè)序峰圖為T單峰；中性品種中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處G和T同時(shí)存在，測(cè)序峰圖為G和T套峰；感病品種中，Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列-1186bp處為G，測(cè)序峰圖為G單峰。(表1，圖8)

表1

感病品種‘金冠’和抗性品種‘寒富’Md-MIRLn12-277啟動(dòng)子序列比較結(jié)果見圖4。從圖4可知，兩條序列共有3個(gè)堿基不同，其中378bp處堿基是與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，此處堿基為T的蘋果品種對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病的抗性顯著高于此處堿基為G的蘋果品種。

采用熒光定量PCR法，設(shè)計(jì)如下引物，檢測(cè)了35個(gè)蘋果栽培品種中Md-miRLn2與Md-MIRLn12-277接菌ALT1后表達(dá)量，與品種抗斑點(diǎn)落葉病能力相符?？剐云贩N中，接菌ALT1后Md-miRLn12與Md-MIRLn12-277的表達(dá)量較低；感病品種中，接菌ALT1后Md-miRLn12與Md-MIRLn12-277的表達(dá)量較高(圖9)。

熒光定量PCR使用的引物：

Md-miRLn12頸環(huán)引物：5’-GTCACATCGTATCGTGAAGCTGCGCAGCTGATGTGACAGGGAGCA-3’

Md-miRLn12熒光定量引物：F 5’-TGCACTAGCGTGTTTGAACAAG-3’和R 5’-ACATCGTATCGTGAAG-3’

內(nèi)參5srRNA頸環(huán)引物：5’-GTCACATCGTATCGTGAAGCTGCGCAGCTGATGTGACTGGATTGG-3’

5srRNA熒光定量引物：F 5’-TGCACTAGCGTGTAGAGGAACC-3’和R 5’-ACATCGTATCGTGAAG-3’

Md-miRLn12初級(jí)轉(zhuǎn)錄本Md-MIRLn12-277熒光定量引物：

F 5’-TGCCGTGACCAAAGCCACATAC-3’

R 5’-TACTCTCTCTCCGTAAATCCATTGG-3’。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 與蘋果斑點(diǎn)落葉病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130> KHP161118679.3

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1563

<212> DNA

<213> 蘋果

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> n為c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (378)..(378)

<223> n為g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1388)..(1388)

<223> n為a或g

<400> 1

aacacaggga gcacttctat tgatttcaaa tcttagggac cacttctatt gatttnaaat 60

cttagtgact aaagtgagga gttatgcaaa tctcaaaggc cattttggtt aaaaagcctt 120

gaaaatattt gttaatacta cctttcatca tcaattgagg actttgaaaa tatttttttg 180

gggaaataag tcaaaataat tatttttgaa atctaaattt gctaaaatga ttagtctttc 240

aatatgtcgt caatatttag tctttcaata tgtcatcgat atttagcctt tcaatatgtc 300

gttgatatat aattttgatc agtttagcaa atgagatttg atttctaatc attttagccc 360

accttcctca gattgttntg gttgtatata gaaattatga tccaatataa atgagaattc 420

aaaaactaga actactgaac cagtttgatc ggatgaatat ctagaaatgg agatcaagtt 480

aaattaccat ataaaccaaa attttatgtt aatgtatgat gaacatcaaa attataattt 540

acatatataa gcctttgcta cggctagagt taacttatgc tacaagtaag aattctactg 600

taatacattg gaaaatgtaa actgccattt gaactccagt tgaaattaac cctctgaact 660

attttttttt gttaagttaa cctcctgaac tatttgaaat aagccagttg accccttgtt 720

ggtagatttc atctactatt tcatcaaatt caaaggaaga ttagtctttt cttcatcaat 780

tcttacttgt caactataac caacaatgta attatgacat gtgaaaacgg acaatgtaaa 840

catttgattt ttttatgttt cctcagtatg ttatatattt ttgaattaat ttgtgtccat 900

gtgtcaaaat tttattggcg gttatagctg acaagtaaca attaatgatg aaatgactaa 960

tttgtccttg aatttgatag aattgattcc gcaatctaac ggtaatgggt taattgactg 1020

attttaaata gttcgggggg ttaatttacc aaaaaaatag tttaaagggg gtcaaattca 1080

actgggatga tagttcaggg tcaaaccgca ctttacccac attggaatac attgatgcag 1140

agcttccgcc gatcgataga tcttttgtga acgtatttaa actcagttcg gtcatgcaat 1200

tccaagaaat gtatagattg gagcatatac cagatcaagt gcaagtgcaa ctactttatc 1260

cagataacaa atataaacga gtaatgctac atttattatc tacttgtatc ataatttata 1320

tgattcgcaa acgtatgtga atcatctctc tattagaaaa atgaacaaat aaataggtaa 1380

gaataatntt tttttaatat aaattcatca ttcatttaca ccgcatcgtc acatgcgacg 1440

tttcaatcag tcaacttatc acatagattc ttaatataat tctatcgtgg tcaaataaaa 1500

aagcaatgtg aaatcgatca atggaattat aaattccttc caattattcg tataataacg 1560

gac 1563

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacacaggga gcacttctat tg 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtccgttatt atacgaataa ttgg 24

<210> 4

<211> 1582

<212> DNA

<213> 蘋果

<400> 4

gacacttcaa ttattggaca gttcgtttct tcttggaaac gtcctgcaat ctgagtcaac 60

ccacagagcg aagtaaataa ataaaatgga gcatttctgc tcaccatcgt tgatatggtg 120

aatgtcgtta tacagctaat catttgtcat gtgttatttc atttaatttt agtgaacttt 180

catattaaat gttatttttt taaattaaaa aaaataacca aagttaaata aaatgacacg 240

tagtagataa ttaagtttac gataaaatta agatggtgaa caaaaatact ctctaaataa 300

aagtgtattt gaaaggtctt ctaacaacgg caacaacaac tacaaaataa taacaatgaa 360

agcgtagtgg gcgacctcaa caaacaaacc tttggtcctt tttcgtttca tgattccatt 420

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gcaaatttgc agtccctctt tcgggttata tttttttatg agtggttgta gagagtcaag 1260

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tttacggaga gagagtaaaa taatctagct tgatgagaaa ctgaggatgt tatgtaagtt 1500

gtttcttcgc gactcggagt ttcagcacac atatatacaa ctcaacgaac gtgttgacca 1560

aataaaaaac acaacgagtt ga 1582

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 蘋果

<400> 5

uuugaacaag auuugcuccc u 21

<210> 6

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaacttgttc tcataaacga gggagttgtt gttgttatgg tctaatttaa atatggtcta 60

aagaagaaga ataaacttgt tctcataaac gagggagttg ttgttgttat ggtctaattt 120

aaatatggtc taaagaagaa gaataaactt gttctcataa acgagggagt tgttgttgtt 180

atggtctaat ttaaatatgg tctaaagaag aagaataaac ttgttctcat aaacgaggga 240