本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及SSR引物，具體涉及一套基于近緣種基因組開發(fā)的柿樹炭疽病菌SSR引物對及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：柿子在我國已有3000多年的栽培歷史，因其味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值而廣受人們喜愛。柿樹炭疽病是柿樹上非常重要的一種病害，是由哈銳炭疽菌(Colleotrichumhorii)引起的，該病在世界主要柿生產(chǎn)國家均有發(fā)生。在我國的富平尖柿和廣西水柿子上發(fā)生較重，對我國柿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了重大的經(jīng)濟損失。柿樹炭疽病為害的逐年加重與該病菌與柿樹的長期協(xié)同進化，以及與當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境的適應(yīng)密不可分，深入分析柿樹炭疽病菌的遺傳多樣性以及遺傳分化可以了解該病原菌的適生性與遺傳進化，對于柿樹炭疽病的有效防控具有十分重要的意義。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析以及輔助育種工作中。AFLP、ISSR、RAPD等標(biāo)記均是采用無基因組序列信息的標(biāo)記，盡管有一定的實用性，但隨機性強，穩(wěn)定性差。與其它分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記，由于其多態(tài)性高、共顯性、操作簡便、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點而廣泛用于遺傳結(jié)構(gòu)分析的研究。但柿樹炭疽病菌剛剛作為一個新的物種哈銳炭疽菌從膠孢炭疽菌中分離出來，其基因組尚未測序完成，EST數(shù)據(jù)庫也未建立，所以本發(fā)明嘗試從其近緣種膠孢炭疽菌的基因組中開發(fā)可用于哈銳炭疽菌的SSR引物，為深入研究柿樹炭疽病菌的遺傳結(jié)構(gòu)提供有力工具。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一套基于近緣種基因組開發(fā)的柿樹炭疽病菌SSR引物對及其應(yīng)用。本發(fā)明利用膠孢炭疽菌的基因組為基礎(chǔ)通過MISA軟件尋找SSR，開發(fā)了30對SSR引物，經(jīng)過6株不同柿樹炭疽病菌的篩選，得到了15對具有多態(tài)性的SSR引物，可用于柿樹炭疽病菌的遺傳結(jié)構(gòu)分析。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：基于近緣種基因組開發(fā)的柿樹炭疽病菌SSR引物對，所述柿樹炭疽病菌SSR引物對共有15對，其核苷酸序列如下：第1對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；第2對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；第3對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；第4對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；第5對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；第6對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；第7對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；第8對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；第9對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；第10對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示；第11對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示；第12對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示；第13對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示；第14對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.27和SEQIDNO.28所示；第15對引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.29和SEQIDNO.30所示。上述柿樹炭疽病菌SSR引物對的開發(fā)方法，包括以下步驟：(1)通過NCBI網(wǎng)站下載柿樹炭疽病菌的近緣種膠孢炭疽菌的全基因組序列；(2)采用MISA軟件對步驟(1)下載的全基因組序列進行SSR位點搜索，選擇單核苷酸重復(fù)次數(shù)≥10次、二核苷酸重復(fù)次數(shù)≥6次、三核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5次、四核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5次、五核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5次和六核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5次的SSR位點；(3)利用PRIMER5軟件進行SSR引物設(shè)計，引物設(shè)計的原則為：引物序列長度為18-22bp，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度150-350bp，GC含量40％-60％，退火溫度50-65℃，上、下游引物的退火溫度值相差不大于4℃；(4)SSR引物篩選與多樣性分析：提取6株不同地理來源的柿樹炭疽病菌菌株的DNA，對步驟(3)設(shè)計的SSR引物對進行引物有效性篩選，若6株柿樹炭疽病菌均有與預(yù)計擴增產(chǎn)物大小相同的擴增條帶出現(xiàn)，而且擴增條帶為多態(tài)性條帶，則該引物對為有效引物；篩選得到的有效引物即為柿樹炭疽病菌SSR引物對。根據(jù)上述柿樹炭疽病菌SSR引物對的開發(fā)方法，其中，步驟(1)中所述的膠孢炭疽菌為ColletotrichumgloeosporioidesNaragc5。上述柿樹炭疽病菌SSR引物對在柿樹炭疽病菌遺傳多樣性、品種鑒定及親緣關(guān)系研究上的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明創(chuàng)新性地以柿樹炭疽病菌的近緣種——膠孢炭疽菌的基因組為基礎(chǔ)給尚未完成基因組測序的哈瑞炭疽菌進行SSR引物設(shè)計，經(jīng)過6株不同柿樹炭疽病菌的篩選，得到了15對具有多態(tài)性的SSR引物；本發(fā)明開發(fā)的柿樹炭疽病菌引物對是穩(wěn)定存在的新標(biāo)記，可用于柿樹炭疽病菌的遺傳多樣性分析，同時還可以用于柿樹炭疽病菌品種鑒定及親緣關(guān)系研究上，對柿樹炭疽病的有效防控具有十分重要的意義。附圖說明圖1引物對1、16、18和5的PCR擴增結(jié)果；圖2引物對2、21、15和29的PCR擴增結(jié)果；圖3引物對3、4、25和28的PCR擴增結(jié)果；圖4引物對6、19、20和23的PCR擴增結(jié)果；圖5引物對7、24、8和9的PCR擴增結(jié)果；圖6引物對17、22、10和27的PCR擴增結(jié)果；圖7引物對26、11、13和14的PCR擴增結(jié)果；圖8引物對12和30的PCR擴增結(jié)果；圖923株柿樹炭疽病菌的聚類分析圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1：柿樹炭疽病菌的獲得2014年從柿子主產(chǎn)區(qū)采集發(fā)病的葉片，采用組織分離法分離獲得柿樹炭疽病菌，并單孢分離進行純化，即得到柿樹炭疽病菌。本發(fā)明共分離得到了23株柿樹炭疽病菌(見表1)。具體操作如下：采集發(fā)病的柿樹葉片，切取葉片的小塊病組織(病健交界處)，將病組織放入75％酒精中2-3秒，撈出后放入5％次氯酸鈉中滅菌2-3分鐘(枝條組織塊大且粗糙，需滅菌3-5分鐘，以防污染)；再用無菌水沖洗三次；用滅過菌的吸水紙吸干病組織的水分，然后將病組織接入PDA培養(yǎng)平板，25℃黑暗條件下進行培養(yǎng)。(4)菌株保存：柿樹炭疽病菌長出1周后進行單孢分離，在顯微鏡下挑取單個孢子放入PDA平板置25℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，3天后長出菌落轉(zhuǎn)接于2mL離心管內(nèi)保存于4-8℃冰箱。表1本發(fā)明分離得到的23株柿樹炭疽病菌菌株菌株編號分離時間分離部位采集地點12014葉片廣西恭城22014葉片廣西恭城32014葉片廣西恭城42014葉片廣西恭城52014葉片廣西恭城62014葉片廣西恭城72014葉片廣西恭城82014葉片廣西恭城92014葉片廣西恭城102014葉片廣西恭城112014葉片廣西平樂122014葉片湖北荊州132014葉片未知142014葉片未知152014葉片山東青州162014葉片廣西富平172014葉片廣西富平182014葉片浙江富陽192014葉片浙江湖源202014葉片浙江湖源212014葉片浙江千島湖222014葉片浙江千島湖232014葉片浙江千島湖實施例2：柿樹炭疽病菌DNA的提取采用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取柿樹炭疽病菌基因組DNA，具體操作如下：(1)將保存的柿樹炭疽病菌菌株轉(zhuǎn)入液體PDA中培養(yǎng)3天，挑出菌絲塊用濾紙吸干水分，放入研缽中加入液氮研磨成粉狀，得到菌絲粉；取50mg菌絲粉于1.5mlEP管中，加入900μl2％CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液和90μl10％SDS(十二烷基苯磺酸鈉)，混勻后置于55-60℃水浴1h；(2)12000rpm/min離心5min，取上清液，加等體積的酚\氯仿\異戊醇(25:24:1)抽提1次；(3)12000rpm/min離心5min，吸取上清液，加等體積氯仿抽提1次；(4)12000rpm/min離心5min，吸取上清液，加0.1×體積的3MNaAC溶液和2×體積的冰無水乙醇過夜沉淀基因組DNA；(5)用預(yù)冷的70％乙醇洗滌兩次，然后置37℃下干燥；(6)干燥后的DNA用100μlddH2O溶解(含50μg/mlRNase)，37℃靜置1h后置-20℃冰箱中備用。實施例3：SSR引物的開發(fā)(1)登陸NCBI網(wǎng)站，選擇genome數(shù)據(jù)庫，進行炭疽病菌基因組數(shù)據(jù)檢索，找到柿樹炭疽病菌的近緣種膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesNaragc5)的全基因組，下載該膠孢炭疽菌的全基因組數(shù)據(jù)，包括所有的scaffold或contig。(2)采用MISA軟件對步驟(1)下載的全基因組序列進行SSR位點搜索，其具體過程為：將基因組數(shù)據(jù)整理成FASTA格式，下載安裝Perl語言，運行MISA程序以識別和定位基因組序列中的SSR，參數(shù)設(shè)置如下：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)次數(shù)至少為10、6、5、5、5和5；經(jīng)過SSR位點搜索，共發(fā)現(xiàn)單核苷酸重復(fù)序列1981個，二核苷酸重復(fù)序列1146個，三核苷酸重復(fù)序列1700個，四核苷酸重復(fù)序列174個，五核苷酸重復(fù)序列98個，六核苷酸重復(fù)序列69個。(3)根據(jù)分析到的SSR，利用PRIMER5軟件進行SSR引物設(shè)計，選擇重復(fù)較多的二核苷酸或三核苷酸重復(fù)序列，在重復(fù)序列兩側(cè)設(shè)計上下游引物，其引物設(shè)計的原則為：引物序列長度為18-22bp，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度150-350bp，GC含量40％-60％，退火溫度50-65℃，上、下游引物的退火溫度值相差不大于4℃。本發(fā)明一共設(shè)計得到30對SSR引物對(具體見表2)，它們分布于基因組的不同scaffold中，其中二核苷酸重復(fù)序列25個，重復(fù)單元均大于等于18個，三核苷酸重復(fù)序列5個，重復(fù)單元均大于等于13個，PCR產(chǎn)物長度為160-330bp。設(shè)計的引物送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表2本發(fā)明所設(shè)計的30對SSR引物實施例4：SSR引物篩選從分離得到的23株柿樹炭疽病菌菌株中選取6株不同柿樹炭疽病菌菌株(其菌株編號分別為：1、3、4、5、9和11)，按照實施例2所述的方法提取其基因組DNA，以分別以提取得到的基因組DNA為模板對實施例3設(shè)計的30對SSR引物對進行篩選(結(jié)果見圖1-圖8)。PCR擴增反應(yīng)體系(25μl)：2.5μl10×PCR反應(yīng)緩沖液，1.5μl2.5mMMgCl2，0.5μl2.5mMdNTPs，0.2μl5U/μlTaqDNA聚合酶，0.5μl10μM引物，0.5μl模板DNA，加無菌超純水至25μl。PCR擴增條件：95℃變性30S，95℃變性30S，55-60℃退火30S，72℃延伸30S，30個循環(huán)，72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物檢測：PCR產(chǎn)物用3％瓊脂糖凝膠電泳，75V電泳5h，用0.5μg/ml溴化乙錠溶液染色，然后用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相并記錄結(jié)果。表3本發(fā)明設(shè)計得到的15對具有多態(tài)性的SSR引物對引物對編號總條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)性比率(％)12210022210032210042210054410062210072210083267922100102210011221001222100133310014221001533100由圖1-圖8可知，30對SSR引物對均可對柿樹炭疽病菌進行有效擴增，至少可有效擴增出1株，其中6株柿樹炭疽病菌均可擴增出條帶的SSR引物對有16對，占所設(shè)計引物的53.33％，6株柿樹炭疽病菌均可擴增出條帶且為多態(tài)性條帶的SSR引物對有15對(見表3)，占所設(shè)計引物的50.00％(見表3和圖1-8)。因此，本研究成功開發(fā)出15對SSR引物可用于柿樹炭疽病菌的遺傳結(jié)構(gòu)分析。實施例5：柿樹炭疽病菌SSR引物對的應(yīng)用在SSR引物篩選的基礎(chǔ)上，從15對多態(tài)性引物中隨機選用6對SSR引物對(其引物對編號分別為：1、6、7、10、11和14)對本發(fā)明分離得到的23株柿樹炭疽病菌(見表1)進行了PCR擴增，其中PCR擴增反應(yīng)條件、PCR擴增條件和擴增產(chǎn)物檢測方法同實施例4。結(jié)果顯示，6個SSR引物對擴增出的條帶均為多態(tài)性條帶，且條帶清晰。將擴增條帶進行進一步處理，出現(xiàn)條帶的為1，沒有的記為0，依次記錄下來整理得到[0,1]矩陣圖，經(jīng)過聚類分析軟件NTsys-pc2.02分析，得到所有菌株之間的親緣關(guān)系樹狀圖(見圖9)，結(jié)果表明23株柿樹炭疽病菌聚類為21個分支，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性；遺傳距離為0.7，23個菌株可被分為4個組，第一組為1、9、18、21和22等5個菌株，第二組為10；第三組為12、20和23等3個菌株；第四組為2、3、4、5、6、7、8、11、13、14、15、16、17和19等14個菌株。由此說明，本發(fā)明從膠孢炭疽菌中開發(fā)的SSR可成功用于柿樹炭疽病菌的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系研究中。SEQUENCELISTING<110>河南省林業(yè)科學(xué)研究院<120>基于近緣種基因組開發(fā)的柿樹炭疽病菌SSR引物對及其應(yīng)用<130>1<160>30<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>1ttcctcccatcttcagcg18<210>2<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>2gacaaggcaaggcaccac18<210>3<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>3ccactggctgtgcttactt19<210>4<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>4gaattggcgcatctttga18<210>5<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>5ccctcctcactgggtcat18<210>6<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>6ggcgtatggtggtgttctat20<210>7<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>7tctttgtccaacggtgtcg19<210>8<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>8cggtggcgtttctactgg18<210>9<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>9tatctggcggccatcttc18<210>10<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>10aggagcggcaatgacgag18<210>11<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>11cagtcgtgtcgtgctcat18<210>12<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>12gaggcacagtgacggaga18<210>13<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>13caagacgacgatgtgccg18<210>14<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>14ggcgttgggtagcattag18<210>15<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>15gacttgggaagacgctgag19<210>16<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>16cggtgtaatgtcggttctg19<210>17<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>17atgagggatgcgatgacg18<210>18<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>18tggactagggcaacgattt19<210>19<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>19gcaagcattgagccataa18<210>20<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>20acgagcgttccataggtt18<210>21<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>21cccgtctggtcttgtctt18<210>22<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>22ggtttactttatcgtccgtag21<210>23<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>23gcaagcattgagccataa18<210>24<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>24acgagcgttccataggtt18<210>25<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>25gtaagaggaatctggacgaa20<210>26<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>26ggaagcgagtgaaacgag18<210>27<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>27ggcgggttgatgaggtta18<210>28<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>28ccagggacagaagcaggag19<210>29<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>29ggaatcgctatccaaacg18<210>30<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>30atcttccgcactcagcat18當(dāng)前第1頁1 2 3