菜用大豆炭疽病菌特異性pcr檢測引物及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及菜用大豆炭疽病菌特異性PCR檢測引物及其檢測方法，專用于菜用大豆炭疽病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時(shí)可用于田間菜用大豆炭疽病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]菜用大豆又稱為毛豆，因味道鮮美、營養(yǎng)豐富而深受廣大消費(fèi)者的喜愛，正逐漸成為具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蔬菜之一，給城郊農(nóng)戶帶來較大的經(jīng)濟(jì)效益，也是我國南方部分省市春季主要栽培的出品創(chuàng)匯的農(nóng)產(chǎn)品之一，產(chǎn)品大量用于保鮮和速凍加工。然而在菜用大豆種植過程中尤其在結(jié)莢至收獲上市期間，由平頭炭疽菌iColletotrichum truncaturn(Schwein.) Andrus & ff.D.Moore]侵染引起的炭疽病在豆莢上嚴(yán)重發(fā)生，感病品種一般田塊株發(fā)病率為50%左右，顯莢發(fā)病率為30%左右，重病田塊株發(fā)病率達(dá)90%以上，顯莢發(fā)病率達(dá)50%以上，極大地影響了豆莢的商品性及其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是菜用大豆生產(chǎn)上的一種重要病害，并且其發(fā)生危害有日益嚴(yán)重的趨勢。菜用大豆炭疽病菌具有潛伏侵染的特性，在發(fā)病初期癥狀一般不明顯，常給病害的正確診斷造成極大的困難，在生產(chǎn)中常因病害診斷不準(zhǔn)確，未能達(dá)到實(shí)施“對癥下藥”的正確防治措施而致使病害造成慘重?fù)p失的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此建立菜用大豆炭疽病菌快速檢測體系，在發(fā)病早期對植株是否攜帶炭疽病菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測，這對于病害的準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)報(bào)、制定適時(shí)有效的防治措施、控制病害的傳播和流行(蔓延)以及減少病害造成的經(jīng)濟(jì)損失都具有重要的理論和實(shí)際意義。
[0003]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用聚合酶反應(yīng)(polymerase chain react1n,PCR)擴(kuò)增技術(shù)對植物病原菌進(jìn)行特異、靈敏的快速分子檢測的成功例子已越來越多。國內(nèi)外已有研究人員利用真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS (internal transcribed spacer)基因?yàn)椴≡鷻z測靶標(biāo)，開發(fā)出了灰霉菌、疫霉菌、枯萎病菌、鏈格孢等不同病原真菌的特異性檢測引物，并利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，達(dá)到病原菌快速、準(zhǔn)確的檢測和鑒定。真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列以中性的方式進(jìn)化，速度與物種形成的進(jìn)程相仿，ITS在種內(nèi)相當(dāng)保守，而在種間表現(xiàn)出一定的變異，是區(qū)分種或種下階元的理想分子標(biāo)記。炭疽病菌傳統(tǒng)的分類鑒定和檢測主要基于形態(tài)學(xué)特征及致病性測定和生理生化特征等，這種鑒定方法耗時(shí)較長、程序繁瑣、靈敏度低，而且還要求鑒定者具有良好的經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)背景知識，難以滿足病害防控中快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測要求，很容易錯(cuò)過病害防治的最佳時(shí)期，而基于PCR方法的分子鑒定只要求工作者有簡單的分子操作技能。目前，尚未見有關(guān)菜用大豆炭疽病菌(C
分子檢測鑒定方法。本發(fā)明通過對炭疽菌屬(CoWe1iricAiM?)的ITS序列進(jìn)行比對分析，設(shè)計(jì)出I對可用于特異性檢測菜用大豆炭疽病菌的引物，為菜用大豆炭疽病菌的準(zhǔn)確鑒定和快速檢測提供技術(shù)和方法，有利于及早有效地采取防治措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中對菜用大豆炭疽病菌檢測和鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征，方法耗時(shí)長、程序繁瑣、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)、準(zhǔn)確度低，難以做到對病害發(fā)生的及時(shí)監(jiān)測和控制病原菌的傳播、流行的問題，提供了一種菜用大豆炭疽病菌特異性PCR檢測引物及其檢測方法，利用本發(fā)明所述的PCR檢測引物和檢測方法檢測菜用大豆炭疽病菌準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于操作、檢測時(shí)間短且結(jié)果可靠。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
1.通過測定菜用大豆炭疽病菌(Colle to trichum trunca turn)和其它炭疽病菌(Colle to trichum spp)的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因，對炭疽菌屬不同種間ITS基因序列進(jìn)行比對分析，設(shè)計(jì)出對菜用大豆炭疽病菌具有特異性擴(kuò)增作用的I對引物，即特異PCR檢測引物的序列為:
上游引物 CTFl:5’ - CCCTGAAAAGGACGTCTCC -3’，
下游引物 CTRl:5’_ GCTAGAGTCCCTCCGAATCC -3’ ；
對菜用大豆炭疽病菌特異性擴(kuò)增出426bp的產(chǎn)物。
[0006]2.菜用大豆炭疽病菌特異分子檢測方法的建立
(I)提取待測樣品基因組DNA。
[0007]用于檢測豆莢中存在菜用大豆炭疽病菌時(shí)，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下:向1.0 mg豆莢組織中加入0.5 mo I/L NaOH 30 μ?，將組織充分磨碎成糊后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，12，000 rpm離心6 min，取上清液5 μ? 加入0.1 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)495μ?混合均勻，取1.0 μ?作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。
[0008](2)以步驟(I)提取的DNA為模板，利用CTF1/CTR1這一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μ?，包括2Xrai7 PCR Master Mix (北京天根生化科技有限公司)12.5μ?，10_01/1的0^1/01?1引物各1.(^1^2.0\105?200 ng DNA模板，用無菌超純水補(bǔ)足至25KL;擴(kuò)增參數(shù)為:95 °C預(yù)變性5 min, 94 °C變性30 s，58 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸10 min。
[0009](3)取步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.0 μ?用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，電壓為4-5V/cm,電泳40min后經(jīng)溴化乙錠染色于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及其片段大小對結(jié)果進(jìn)行判斷，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出約426bp的產(chǎn)物，即可判斷所述的檢測樣品中存在菜用大豆炭疽病菌，否則所述的檢測樣品中未存在菜用大豆炭疽病菌。
[0010]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和有益效果:
1.特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高:本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribedspacer, ITS)序列種內(nèi)的保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了對菜用大豆炭疽病菌具有特異擴(kuò)增作用的PCR引物，并已經(jīng)對不同地理來源的菜用大豆炭疽病菌和攜帶菜用大豆炭疽病菌的豆莢組織進(jìn)行了測試驗(yàn)證，只有菜用大豆炭疽病菌和攜帶該病菌的豆莢中能特異性地?cái)U(kuò)增出一條426bp的電泳條帶，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物具有很強(qiáng)的特異性和準(zhǔn)確性。
[0011]2.靈敏度高:病原菌傳統(tǒng)的檢測方法是通過分離、純化和形態(tài)學(xué)鑒定等步驟，這種傳統(tǒng)方法的成功需要發(fā)病組織中積累到足夠量的病原體才能成功。而本發(fā)明將設(shè)計(jì)的特異引物與ITS基因通用引物(ITS1/ITS4)聯(lián)合起來進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增后，對菜用大豆炭疽病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)到lfg，比常規(guī)PCR檢測提高了 10000倍； 3.實(shí)用性好:菜用大豆炭疽病菌的快速檢測，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的菜用大豆炭疽病菌的檢測方法一般是在豆莢出現(xiàn)癥狀后，借助其發(fā)病癥狀，對病原菌進(jìn)行分離、純化、鑒定等一系列繁瑣的過程，所需時(shí)間較長，給快速而精確地檢測病原物增加了難度，傳統(tǒng)的方法由于不能在病害發(fā)病前期及時(shí)進(jìn)行田間的病原菌動(dòng)態(tài)的監(jiān)測和檢測，時(shí)常給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的防治延誤時(shí)機(jī)。本發(fā)明可對豆莢中是否攜帶菜用大豆炭疽病菌進(jìn)行檢測，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出426bp的電泳條帶，說明植物組織中存在菜用大豆炭疽病菌，因此本發(fā)明可用于菜用大豆炭疽病顯癥之前的早期監(jiān)測，可為確定病害防治最佳時(shí)期和防治策略的制定提供科學(xué)依據(jù)，因此本發(fā)明具有較好的實(shí)用性；
4.操作簡便、快速:應(yīng)用本發(fā)明方法，對待測樣品基因組DNA進(jìn)行提取、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，整個(gè)檢測過程采用DNA快速提取方法，操作簡單，無需對病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，大大縮短了檢測時(shí)間，一般整個(gè)檢測過程可在6小時(shí)內(nèi)完成。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明所要檢測的菜用大豆炭疽病菌的特異PCR擴(kuò)增圖，圖中:泳道M為2000bp DNA Marker，泳道1-5為菜用大豆炭疽病菌，泳道6-13分別為桃炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、毀滅炭疽菌、菜豆炭疽病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉菌和番茄早疫病菌，泳道14為陰性對照。
[0013]圖2為本發(fā)明菜用大豆炭疽病菌的靈敏性檢測擴(kuò)增結(jié)果圖，圖2-a為單重PCR對菜用大豆炭疽病菌的靈敏性檢測結(jié)果，圖2-b為巢式PCR對菜用大豆炭疽病菌的靈敏性檢測結(jié)果，圖中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道I為100 ng,泳道2為10 ng,泳道3為Ing,泳道4為100 pg,泳道5為10 pg，泳道6為I pg，泳道7為100 fg，泳道8為10 fg，泳道9為I fg，泳道10為100 ag，泳道11為10 ag，泳道12-14為陰性對照。
[0014]圖3為本發(fā)明發(fā)病組織的檢測結(jié)果圖，圖中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道1_5為自然發(fā)病的豆莢，泳道6-7為健康豆莢，泳道8為陰性對照，泳道9為陽性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，或已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。
[0016]實(shí)施例1:PCR檢測引物序列的設(shè)計(jì)及引物對菜用大豆炭疽病菌的特異性擴(kuò)增 1.引物的設(shè)計(jì)與合成
本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是菜用大豆炭疽病菌高效特異性PCR檢測引物的設(shè)計(jì)及其檢測方法的建立。為了獲得菜用大豆炭疽病菌的特異PCR檢測引物序列，以來源于我國福建、海南、浙江和廣東等不同省份的16株菜用大豆炭疽病菌和多個(gè)炭疽屬近緣種以及常見的幾種病原真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下:取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中(菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜)，加入900 μ? 2%CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取液(2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 ；20 mmol/L EDTA,pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和90 μ? SDS (十二烷基苯磺酸鈉)【注:CTAB，SDS需60°C預(yù)熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60°C水浴Ih (DNA釋放至緩沖液中)，12000 r.min 1離心15 min ;取上清液700 μ?，加等體積酸、氯仿、異戊醇(25:24:1 )，輕輕振蕩混勾，12000 r.min1離心9 min ;取上清液500 μ?，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r.min 1離心5 min ;取上清液350 μ?,加入1/10體積3 mol.L 1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20°C沉淀30 min, 12000 r.min 1離心5 min ;棄去上清液，加入7(Κ)μ? 70%冰乙醇進(jìn)行洗滌(稍離心；傾掉上清液)，在超凈工作臺(tái)上晾干無酒精味，加入 30~60 μ? TE (10 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0)溶液進(jìn)行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度并稀