一種鑒定或輔助鑒定馬鈴薯薯形的方法及其專用的引物對(duì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定或輔助鑒定馬鈴薯薯形的方法及其 專用的引物對(duì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯是世界第三大、我國(guó)第四大糧食作物，因其具有耐寒、耐貧瘠、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適 應(yīng)性廣、營(yíng)養(yǎng)全面等優(yōu)點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，對(duì)于保障我國(guó)及世界的糧食安全具有重 要意義。塊莖形狀即薯形是馬鈴薯的重要農(nóng)藝性狀之一，也是鑒別品種特征的重要依據(jù)之 一。不同的消費(fèi)習(xí)慣和加工產(chǎn)品對(duì)薯形的要求不同，如東北地區(qū)消費(fèi)者偏好圓薯形品種，而 中原和南方地區(qū)消費(fèi)者偏好長(zhǎng)薯形品種；一般炸條要求長(zhǎng)薯形品種，而炸片需要圓薯形品 種。因此，選育特定薯形的品種滿足不同消費(fèi)者和加工需求，對(duì)于促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)全面發(fā)展 具有重要意義。
[0003] 傳統(tǒng)育種主要依賴于表型選擇?？墒黔h(huán)境條件、基因型、基因環(huán)境互作等多種因素 會(huì)影響表型選擇的準(zhǔn)確性。培育一個(gè)優(yōu)良品種往往需要七、八年甚至十幾年時(shí)間。分子標(biāo) 記輔助選擇技術(shù)可大大提高選擇準(zhǔn)確性和育種效率，從而加速馬鈴薯育種進(jìn)程。而獲得易 于操作且與特定性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記是進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇的前提。馬鈴薯栽培品種是 高度雜合的四倍體（2n = 4x = 48)作物，遺傳背景狹窄、染色體高度雜合、遺傳重組頻率高 且存在嚴(yán)重的自交衰退現(xiàn)象，開發(fā)分子標(biāo)記困難。而自然界中絕大多數(shù)馬鈴薯以二倍體形 式存在，相對(duì)于四倍體，二倍體染色體數(shù)目較少，遺傳背景相對(duì)簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行遺傳分析和 操作。同時(shí)，馬鈴薯單倍型基因組序列框架圖已經(jīng)完成，覆蓋了馬鈴薯95%以上的基因，為 馬鈴薯分子標(biāo)記的開發(fā)提供了資源。基于上述馬鈴薯遺傳特性，研究者大多利用二倍體材 料開發(fā)標(biāo)記，再將開發(fā)的標(biāo)記應(yīng)用到四倍體材料中。但是，在將二倍體中開發(fā)的標(biāo)記應(yīng)用到 四倍體材料過程中也會(huì)出現(xiàn)一些問題，由于四倍體馬鈴薯在減數(shù)分裂過程中，有四條同源 染色體發(fā)生配對(duì)，而且高度異質(zhì)的遠(yuǎn)緣雜種常導(dǎo)致在一個(gè)遺傳位點(diǎn)存在多種等位基因組合 形式，致使染色體發(fā)生交換重組而出現(xiàn)標(biāo)記與性狀偏分離、篩選準(zhǔn)確率低等問題。因此，二 倍體材料中開發(fā)的標(biāo)記應(yīng)用到四倍體材料中并不十分順利。
[0004] 到目前為止，已有幾十個(gè)馬鈴薯性狀被標(biāo)記，如包括抗晚疫病、抗青枯病、抗病毒 病等的抗性性狀，包括炸片顏色、塊莖休眠、薯肉顏色等的品質(zhì)性狀以及耐旱性、耐凍性等 的抗逆性狀。但目前可用于馬鈴薯薯形育種的標(biāo)記很少，可用于四倍體馬鈴薯薯形育種的 標(biāo)記更少，且目前所開發(fā)的薯形標(biāo)記在應(yīng)用于薯形篩選時(shí)，準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較差，篩選效率 低，實(shí)際應(yīng)用效果差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯薯形的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯薯形的方法包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)馬 鈴薯的同源染色體上的目標(biāo)基因的第805位脫氧核糖核苷酸是否為C、第896位脫氧核糖核 苷酸是否為T和第1146位脫氧核糖核苷酸是否為A :
[0007] 1)若待測(cè)馬鈴薯的至少一條同源染色體上的目標(biāo)基因的第805位脫氧核糖核苷 酸為C，且所述待測(cè)馬鈴薯的至少一條同源染色體上的目標(biāo)基因的第896位脫氧核糖核苷 酸為T，且所述待測(cè)馬鈴薯的至少一條同源染色體上的目標(biāo)基因的第1146位脫氧核糖核苷 酸為A，則待測(cè)馬鈴薯為或候選為圓薯形馬鈴薯；
[0008] 2)若待測(cè)馬鈴薯的同源染色體上的目標(biāo)基因不滿足上述條件，則待測(cè)馬鈴薯為或 候選為長(zhǎng)薯形馬鈴薯；
[0009] 所述目標(biāo)基因的序列如序列表中序列3所示。
[0010] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)馬鈴薯的同源染色體上的目標(biāo)基因的第805位脫氧核 糖核苷酸是否為C、第896位脫氧核糖核苷酸是否為T和第1146位脫氧核糖核苷酸是否為 A的方法為直接測(cè)序。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯薯形的引物對(duì)。
[0012] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯薯形的引物對(duì)由序列表中序列1所示 的DNA分子和序列表中序列2所不的DNA分子組成。
[0013] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯薯形的PCR試劑。
[0014] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯薯形的的PCR試劑包括上述引物對(duì)。
[0015] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯薯形的試劑盒。
[0016] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯薯形的試劑盒包括上述引物對(duì)或上述 PCR試劑。
[0017] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒的新用途。
[0018] 本發(fā)明提供了上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè) 馬鈴薯為圓薯形馬鈴薯還是長(zhǎng)薯形馬鈴薯中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒在選育或輔助選育圓 薯形馬鈴薯和/或長(zhǎng)薯形馬鈴薯中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯為圓薯形馬鈴薯 還是長(zhǎng)薯形馬鈴薯的方法。
[0021] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)馬鈴薯為圓薯形馬鈴薯還是長(zhǎng)薯形馬鈴薯的 方法包括如下步驟：
[0022] (1)用上述引物對(duì)對(duì)待測(cè)馬鈴薯進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0023] (2)用Afl II內(nèi)切酶對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到酶切產(chǎn)物；
[0024] (3)檢測(cè)所述酶切產(chǎn)物的大??；
[0025] 若酶切產(chǎn)物含有大小為700bp和200bp的片段；則待測(cè)馬鈴薯為或候選為圓薯形 馬鈴薯；
[0026] 若酶切產(chǎn)物僅含有大小為900bp的片段；則待測(cè)馬鈴薯為或候選為長(zhǎng)薯形馬鈴 薯。
[0027] 上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的模板為待測(cè)馬鈴薯的基因組DNA ;所述PCR擴(kuò)增的退 火溫度為60 °C。
[0028] 上述方法或上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒或上述應(yīng)用中，所述圓薯形 馬鈴薯為塊莖的最大縱軸的長(zhǎng)度與最大橫軸的長(zhǎng)度的比值I < 1. 4的馬鈴薯；所述長(zhǎng)薯形 馬鈴薯為塊莖的最大縱軸的長(zhǎng)度與最大橫軸的長(zhǎng)度的比值I多1. 4的馬鈴薯；
[0029] 所述縱軸為匍匐莖生長(zhǎng)方向；
[0030] 所述橫軸為垂直于匍匐莖生長(zhǎng)方向。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0032] 1)彌補(bǔ)目前馬鈴薯薯形標(biāo)記不足及表觀選擇準(zhǔn)確性差、篩選效率低、工作量大的 問題。
[0033] 2)利用本發(fā)明開發(fā)的標(biāo)記，在苗期就可以根據(jù)馬鈴薯的DNA進(jìn)行鑒定，從而確定 其薯形，可節(jié)省人力物力，縮短育種周期。
[0034] 本發(fā)明以馬鈴薯二倍體材料，基于馬鈴薯基因組相關(guān)序列信息，結(jié)合分離群體分 組分析法（BSA)提供了一種鑒定或輔助鑒定馬鈴薯薯形的方法并開發(fā)了一個(gè)可用于馬鈴 薯薯形輔助選擇的分子標(biāo)記1137-CAPSVI，可對(duì)馬鈴薯塊莖形狀進(jìn)行準(zhǔn)確、方便、快速的篩 選。通過實(shí)驗(yàn)證明：利用分子標(biāo)記1137-CAPSVI對(duì)四倍體薯形材料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與表 型鑒定結(jié)果的吻合度達(dá)80%以上，其中對(duì)圓薯形的吻合度達(dá)90 %以上，選擇準(zhǔn)確率高，穩(wěn) 定性好，而且在苗期就能對(duì)后代進(jìn)行選擇，不受植物生長(zhǎng)階段及環(huán)境條件影響，可有效加速 馬鈴薯薯形育種進(jìn)程，降低育種成本。
【附圖說明】
[0035] 圖1為部分試驗(yàn)材料的基因組DNA的電泳檢測(cè)。
[0036] 圖2為PCR產(chǎn)物經(jīng)Aflll酶切后的電泳圖。其中，M:Marker ;P1 :320-02 ;P2 : 10618-01 ;RB :圓形混池；LB :長(zhǎng)形混池。
[0037] 圖3為四倍體材料薯形鑒定結(jié)果頻率分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 下述實(shí)施例中的長(zhǎng)薯形親本材料10618-01和圓薯形親本材料320-02均在文獻(xiàn) "Zhang Yong-fei，Genetic analysis of pigmented tuber FLesh in potato, 2009'，中公 開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜花卉研究所獲得。
[0041] 下述實(shí)施例中的LB固體培養(yǎng)基的配方（1L):胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、 瓊脂15g，加入蒸餾