胃癌新型分子標志物krt18p55的檢測及其應用
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及一種胃癌新型分子標志物長鏈非編碼 RNA-KRT18P55的檢測試劑盒。
【背景技術】：
[0002] 長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，IncRNA)是一類位于細胞核或細胞質(zhì)結(jié)構 類似mRNA、長度大于200個核苷酸的不具有可讀框的轉(zhuǎn)錄本。LncRNA原先被認為是基因組 轉(zhuǎn)錄的"噪音"，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，沒有生物學功能。然而，近些年的研究表明， IncRNA具有空間和時間特異性，可在多種層面（表觀遺傳學、選擇性剪接和調(diào)節(jié)mRNA降解 等）調(diào)芐基因的表達，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核 內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，從而在細胞分化、生長、新陳代謝過程及腫瘤發(fā)生中起著至 關重要的作用。目前已有較多IncRNA被證實在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、結(jié)直腸 癌、膀胱癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。
[0003] 全球癌癥統(tǒng)計中，胃癌發(fā)病率列居前位，中國又是胃癌高發(fā)大國。盡管診斷技術在 不斷提高，以手術治療為主的綜合治療手段越來越豐富，但胃癌依舊是全球主要癌癥致死 性疾病之一。而且，現(xiàn)有的腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度與特異 性并不高，雖然CA72-4對胃癌具有較高特異性，但通常也只有在胃癌的III-IV期才出現(xiàn)增 高。因此，尋找可靠的生物標志物作為早期診斷依據(jù)和可靠的治療靶點成為當務之急。
[0004] 近年來，關于IncRNA與胃癌關系的研究開始引起發(fā)明人的注意。目前研究顯示， IncRNA可以作為致癌或者抑癌分子參與胃癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移。值得注意的是，IncRNA表達 水平上的差異或胃癌特異型IncRNA的表達，可作為腫瘤診斷的新型分子標志物。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 發(fā)明目的：
[0006] 本發(fā)明提供一種胃癌新型分子標志物長鏈非編碼RNA-KRT18P55的檢測試劑盒， 解決了現(xiàn)有的腫瘤標志物在胃癌中的敏感度與特異性不高的問題。
[0007] 技術方案：
[0008] 評估胃癌發(fā)生與診斷相關的分子標志物lncRNA-KRT18P55,其特征在于： lncRNA-KRT18P55 的基因序列為 SEQ ID No. 1。
[0009] 所述分子標志物lncRNA-KRT18P55的用途，其特征在于：用于制備檢測胃癌發(fā)生 與診斷的試劑盒。
[0010] 上述檢測胃癌發(fā)生與診斷的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：
[0011] ⑴從胃組織中抽提總RNA ;所用試劑：TRIzol、三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇、無酶 水；
[0012] (2)以總RNA為模板將lncRNA-KRT18P55逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ;所用試劑：Takara公司 反車專錄試劑盒：gDNA Eraser、5X gDNA Eraser Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、5X PrimerScript Buffer 2、RT Primer Mix、RNase Free dH20；
[0013] (3)將cDNA實時定量PCR;所用試劑：lncRNA-KRT18P55實時熒光定量PCR特異性 引物、GAPDH內(nèi)參實時熒光定量PCR特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水；
[0014] lncRNA-KRT18P55上游特異性引物序列為SEQID No.2,下游特異性引物序列為 5￡〇10如.3;6六?011作為內(nèi)源性對照，其上游特異性引物序列為5￡〇10如.4，下游特異性 引物序列為SEQID No. 5。
[0015] 試劑盒為熒光定量PCR檢測試劑盒，所述引物用于SYBR Green、Taqman探針、分子 信標、雙雜交探針、符合探針的檢測。
[0016] 試劑盒中的PCR反應液為熒光定量PCR反應液，反應液里含有熒光染料。
[0017] 熒光定量PCR反應液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer緩沖液；熒光染料為SYBR Green II，Taq酶為熱啟動酶。
[0018] 優(yōu)點及效果：
[0019] 本發(fā)明提出了一種胃癌新型分子標志物長鏈非編碼RNA-KRT18P55的檢測試劑 盒，具有如下優(yōu)點：
[0020] 本發(fā)明提供一條在人胃癌組織中顯著高表達的IncRNA，該基因被命名為：角 蛋白18假基因55〇?5抑^1118口8611(1(^6116 55，10?1'18?55)，其轉(zhuǎn)錄區(qū)域位于17號染色 體反義鏈2660301bp到26634408bp之間，其基因全長為1950bp。通過實時熒光定量 PCR，lncRNA-KRT18P55在97例人胃癌組織中相對于其配對正常胃組織顯著高表達，且 lncRNA-KRT18P55的表達水平與97名患者胃癌勞倫分型（Lauren分型）發(fā)生顯著相關。因 此，lncRNA-KRT18P55有望成為胃癌發(fā)生與診斷評估的新型標志物與治療靶點。
[0021] 利用本發(fā)明的檢測制劑可以檢測lncRNA-KRT18P55在胃組織中的表達水平，為胃 癌發(fā)生與診斷評估提供有力的分子生物學基礎，具有深遠的臨床意義和推廣性。
【附圖說明】：
[0022] 圖1為實時熒光定量PCR分析lncRNA-KRT18P55在97對胃癌組織與正常胃組織 中的表達差異（_ A A Ct值比較）。
[0023] 圖2為實時熒光定量PCR分析lncRNA-KRT18P55在97對胃癌組織與正常胃組織 中的表達差異（2 ACt值比較，*P〈0. 05 ;**P〈0. 01)。
【具體實施方式】：
[0024] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的說明：
[0025] 本發(fā)明提供一條在人胃癌組織中顯著高表達的IncRNA，該基因被命名為：角蛋白 18假基因55(keratin 18pseudogene 55, KRT18P55)，其轉(zhuǎn)錄區(qū)域位于17號染色體反義鏈 2660301bp到26634408bp之間，其基因全長為1950bp。通過實時熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)，在 97名接受胃癌根治性手術患者的胃癌組織及其配對正常胃組織樣本中，lncRNA-KRT18P55 在胃癌組織中的表達量相對于其配對正常胃組織顯著上升（P〈〇. 01)。
[0026]通過 SPSS 17. 0 (SPSS Inc，Chicago, IL，USA)軟件的非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U及Kruskal 1-Wall is)，將上述97對胃癌組織及其配對正常組織熒光定量PCR結(jié)果與97 名患者的臨床病理資料相結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA-KRT18P55的表達水平與胃癌的勞倫分型 (Lauren分型）顯著相關（P = 0. 032)。因此，lncRNA-KRT18P55有望成為胃癌發(fā)生與診斷 評估的新型分子標志物及治療靶點。
[0027] 在胃癌組織中高表達的新型分子標志物lncRNA-KRT18P55的基因序列為SEQ ID No. 1〇
[0028] 在上述發(fā)現(xiàn)的基礎上，本發(fā)明提供了所述lncRNA-KRT18P55在制備評估胃癌發(fā)生 與診斷試劑盒中的用途。
[0029] 胃癌新型分子標志物lncRNA-KRT18P55可用于制備檢測胃癌發(fā)生與診斷試劑盒， 應用于評估胃癌的發(fā)生與診斷，以給患者及時地治療、有效地干預措施，提高患者的生存質(zhì) 量。
[0030] 上述檢測胃組織中l(wèi)ncRNA-KRT18P55表達量的試劑盒，該試劑盒包括：
[0031] (1)從胃組織中抽提總RNA;所用試劑：TRIzol(LifeTechnologies公司；貨號： 15596-026)、三氯甲烷、異丙醇、75 %乙醇、無酶水；
[0032] (2)以總RNA為模板將lncRNA-KRT18P55逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ;所用試劑：Takara公司 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser ;貨號：RR047A) :gDNA Eraser、5X gDNA Eraser Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、5X PrimerScript Buffer 2、RT Primer Mix、RNase Free dH20。
[0033] (3)將cDNA實時定量PCR;所用試劑：lncRNA-KRT18P55實時熒光定量PCR特異性 引物、GAPDH內(nèi)參實時熒光定量PCR特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料（Takara公 司；SYBR? Premix Ex Taq? II ;貨號：RR820A)、無酶水。
[0034] 特異性引物對包括上游引物和下游引物，lncRNA-KRT18P55上游特異性引物序列 為SEQ ID No. 2,下游特異性引物序列為SEQ ID No. 3;GAPDH作為內(nèi)源性對照，其上游特異 性引物序列為SEQ ID No. 4,下游特異性引物序列為SEQ ID No. 5。（特異性引物序列由上 海生工生物工程有限公司設計并合成）。
[0035] 試劑盒為熒光定量PCR檢測試劑盒，所述引物用于SYBR Green、Taqman探針、分子 信標、雙雜交探針、符合探針的檢測。
[0036] 試劑盒中的PCR反應液為熒光定量PCR反應液，并包含熒光染料。
[0037] 熒光定量PCR反應液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer緩沖液；熒光染料為SYBR Green II，Taq酶為熱啟動酶。
[0038] 實施例1
[0039] 制備檢測患者胃組織中l(wèi)ncRNA-KRT18P55試劑盒（50次反應）
[0040]
[0041] 實施例2
[0042] 胃組織中l(wèi)ncRNA-KRTl8P55的檢測
[0043] 1.胃癌組織的保存：收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科2009-2010年間接 受胃癌根治術患者胃癌組織及其配對的正常胃組織97對。置于1. 5ml的RNase/DNase-free 離心管中，經(jīng)液氮桶轉(zhuǎn)移至-80°C深低溫冰箱保存。
[0044] 2?胃組織總RNA的提?。喝∥赴┙M織及其配對的正常胃組織50-100mg于RNase/ DNase-free離心管（Axygen公司，1.5ml)中，加入TRIzol lml于離心管中將組織剪碎并 勻漿。冰上靜置5min后，每管加入200ul/mlTRIz〇l氯仿，用手劇烈震蕩15-30s后，靜置 5min，4°C 12000g 離心 15min ;取上層水相 500ul 加入新 1. 5ml 的 RNase/DNase-free 離心 管（Axygen公司，1. 5ml)中，加入預冷的異丙醇500ul/mlTRIzol輕柔混勾后，靜置lOmin， 4°〇 1200(^離心1〇111；[11;棄上清，加入75%1^&86?代6(11120稀釋的乙醇11111混勾，4°0 850(^ 離心5min，盡量棄上清，室溫干燥lOmin，加入適量RNase Free dH20溶解RNA ;提取的總 RNA 使用 Nanophotometer P_Class(Implen GmbH，Munich，Germany)測定濃度及純度， 0D260/280 比值在 1. 80-2. 0 之間，-80°C保存。
[0045] 3. lncRNA-KRT18P55 逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA :
[0046] i?在 RNase/DNase-free PCR 管（Axygen 公司，200 y 1)中配置去 DNA 反應液，體 系為10 y 1如下：
[0047]
[0048] (注：加入的RNA體積由RNA的濃度確定，x = 1 y g/RNA濃度，此步驟使用的試劑 為Takara公司的PrimeScript?RTreagent Kit with gDNA Eraser;貨號：RR047A)。
[0049] 將裝有配置好反應液的PCR管放入PCR儀（ GeneAmp? PCR System 9700)中 42°C孵