本發(fā)明涉及真菌病原分子檢測技術領域，尤其涉及一種用于檢測光滑假絲酵母菌的環(huán)介導等溫擴增試劑盒及使用方法。

背景技術：

近年來，隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物和免疫抑制劑等的廣泛應用，器官移植、骨髓移植、導管插管等的普遍開展，尤其是艾滋病等的流行，致使真菌尤其是念珠菌引起的深部感染機會日益增多。

念珠菌是一種芽生的酵母狀真菌。已知可以致病的常見念珠菌有：白念、熱帶、近平滑、克魯斯、星狀、季也蒙和光滑念珠菌等八種。這些菌不僅廣泛存在于自然界里，而且也可寄生在正常人體皮膚、口咽、胃腸道、肛門和陰道粘膜上而不發(fā)生疾病，是一種典型的條件致病菌。

念珠菌感染是由念珠菌屬，尤其是白念珠菌引起的一種真菌性廣譜病變。該病病原菌既可侵犯皮膚、粘膜和指(趾)甲等引起的淺部念珠菌病，又能累及內臟、系統(tǒng)甚至播散導致深部念珠菌感染。隨著免疫受損或低下人群的不斷擴大。機會性念珠菌病繼續(xù)增多，迄今仍是醫(yī)學真菌領域研究的熱點。

光滑假絲酵母菌是屬于白念珠菌的一種，該真菌既可侵犯皮膚、粘膜和指(趾)甲等引起的淺部念珠菌病，又能侵入內臟，導致深部念珠菌感染。光滑假絲酵母菌也是口腔黏膜的重要病原真菌，由其引起的口腔感染占艾滋病患者口腔念珠菌感染的14％。有研究表明，光滑假絲酵母菌是分離自尿液的第2位常見病原真菌和引起外陰陰道念珠菌病(VVC)最常見的非白念珠菌。從VVC患者病灶部位分離的念珠菌中，光滑假絲酵母菌占34.5％。與其他非白念珠菌相比，光滑假絲酵母菌感染的病死率最高，為40％-70％，腫瘤患者和骨髓移植患者發(fā)生的光滑假絲酵母菌血癥的病死率分別高達50％和100％。

目前臨床應用的光滑假絲酵母菌的檢測方法可以分為三大類：形態(tài)學方法、血清學方法、分子生物學方法。

形態(tài)學方法需要培養(yǎng)光滑假絲酵母菌而該真菌的培養(yǎng)周期一般需要數天甚至數周；菌種鑒定也較困難，需要交給具有豐富的經驗的專業(yè)技術人員判斷，而這限制了病情的早期診斷，易貽誤最好的治療時機。

血清學方法包括抗原檢測和抗體檢測。念珠菌的抗原成分復雜，與自然界中的多種物質，如血紅蛋白、白蛋白、血透用硝酸纖維膜、多糖類免疫調節(jié)劑、細菌、其他真菌、類風濕因子等存在廣泛的交叉，抗原檢測易導致假陽性結果；念珠菌感染患者多合并有免疫抑制，抗體反應低下，可能導致假陰性的結果。而且，機體產生抗體反應需要一定的時間，因此抗體檢測不能用于早期診斷。

分子生物學技術的發(fā)展為深部真菌感染的早期診斷創(chuàng)造了條件，目前應用于臨床診斷的主要是PCR技術。包括以PCR為基礎衍生出的多種技術：包括反轉錄PCR(RT-PCR)、多重PCR、巢式PCR、RAPD技術、實時熒光定量PCR等。然而，PCR操作過程比較復雜，需要專業(yè)人員操作，并不是所有醫(yī)院都具有該專業(yè)技術人員。另外，PCR儀價格昂貴，擴增時間長。因此，在科學研究和生產實踐中均需要一種快速簡便、容易普及、安全可靠且適用于現場操作的試劑盒及使用方法。

技術實現要素：

本發(fā)明針對現有技術中存在的技術問題，提供了一種用于檢測光滑假絲酵母菌的LAMP引物組合物、基于上述引物組合物的光滑假絲酵母菌檢測試劑盒以及試劑盒的使用方法。所述LAMP引物組合物包括正向外引物F3，反向外引物B3，正向內引物FIP和反向內引物BIP。光滑假絲酵母菌檢測試劑盒使用所述LAMP引物組合物。該試劑盒操作方法簡便，不需要復雜的儀器，也不需要特殊的試劑。反應時間快速高效，45-60min即可獲得結果。結果的鑒定方法非常簡便，既能夠直接肉眼觀察反應液渾濁度，也可以加入熒光染料SYBGreen或熒光指示劑Syto9。本發(fā)明適用于現場檢測。

為了實現上述技術目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

一種用于檢測光滑假絲酵母菌的LAMP引物組合物，包括：

正向外引物F3：5’-GAGACAAGCAATTCAAATCAAGGA-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-CGGCATCACCAGTACTCTTG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向內引物FIP：5’-TGGGTCGTCTTCTGAAGGAACATCATCCAAAGAAAAGATTCAATGCTGTT-3(SEQ ID NO:3)

反向內引物BIP：5’-TCCAGAGGTGGTTGTGGTAACACTGCTACCCACAAGTTTCAAACC-3’(SEQ ID NO:4)。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測光滑假絲酵母菌的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測光滑假絲酵母菌的LAMP引物組合物。

優(yōu)選地，引物組合物中正向外引物F3濃度為50μM，反向外引物B3濃度為50μM，正向內引物FIP濃度為50μM，反向內引物BIP為50μM。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括Bst DNA聚合酶，dNTP，10×Isothermal Amplification反應緩沖液，MgSO4，H₂O，顯色劑。

進一步地，Bst DNA聚合酶的濃度為8U/μL，dNTP濃度為12mM，MgSO₄濃度為150mM。

進一步地，所述顯色劑為熒光染料SYBGreen或熒光指示劑Syto 9。

另一方面，本發(fā)明還提供一種檢測光滑假絲酵母菌的方法，檢測方法使用用于檢測光滑假絲酵母菌的LAMP引物組合物。

進一步地，檢測光滑假絲酵母菌的方法包括以下步驟：

步驟一：將待檢測樣品煮沸后離心，吸取上清，得到樣品DNA；

步驟二：在PCR管中依次加入引物組合物，樣品DNA，dNTP，10×Isothermal Amplification反應緩沖液，MgSO4水溶液，Bst DNA聚合酶和H₂O，得到反應液；

步驟三：將帶有反應液的PCR管60～65℃反應45～60min；

步驟四：根據PCR管反應液渾濁程度判斷擴增結果。

此外，本發(fā)明還提供了另一種檢測光滑假絲酵母菌的方法，包括以下步驟：

步驟一：將待檢測樣品煮沸后離心，吸取上清，得到待檢樣品DNA；

步驟二：在PCR管中依次加入引物組合物，光滑假絲酵母菌DNA，dNTP，10×Isothermal Amplification反應緩沖液，MgSO₄水溶液，Bst DNA聚合酶和 H₂O，得到反應液；

步驟三：將帶有反應液的PCR管放入水浴鍋反應；

步驟四：向PCR管反應液內加入熒光染料SYBGreen或熒光指示劑Syto 9，根據熒光強度判斷擴增結果。

為了進一步優(yōu)化上述檢測光滑假絲酵母菌的方法，本發(fā)明所提供的技術措施還包括：

步驟一中待測樣品可以為真菌培養(yǎng)物、疑似病變組織或組織滲出液，煮沸時間為10min，離心速度為10000g/min；

步驟二中反應液的反應體系為：1μL待檢樣品DNA，4μL 12mM dNTP，2.5μL 10×Isothermal Amplification反應緩沖液，1μL 150mM MgSO₄水溶液，1μL Bst DNA聚合酶和14.5μL H₂O；

步驟三中將帶有反應液的PCR管放入60～65℃的水浴鍋中，反應時間為45-60min；

步驟四中加入的顯色劑為2μL。

本發(fā)明提供了一種光滑假絲酵母菌環(huán)介導等溫擴增試劑盒及使用方法，相對于現有技術，具有如下技術效果：本發(fā)明基于環(huán)介導等溫擴增技術LAMP法，在光滑假絲酵母菌的特異內源性基因處設計了四條特異性引物，具有很強的品系特異性，且非常穩(wěn)定，保證了反應的順利進行。整個操作過程簡便，即使非專業(yè)人員也能獨立完成反應。反應過程中不需要復雜的儀器，只需要一臺水浴鍋就能完成。相比傳統(tǒng)PCR擴增需要1-2h，本發(fā)明擴增只用45-60min即可完成，擴增產量可達10⁹-10¹⁰個拷貝，肉眼觀察反應液渾濁程度就能判斷結果，此外還可以加入熒光染料SYBGreen或Cyto9觀察顏色變化。而且，本發(fā)明的方法靈敏度高，最低檢測限可達到100個拷貝，在感染初期就能進行檢測。

附圖說明

圖1是實施例一的檢測結果圖；1：陽性對照；2-5：待檢樣品；6：陰性對照。

圖2是實施例二的顯色檢測結果圖；1：陽性對照；2-5：待檢樣品；6：陰性對照。

圖3是實施例3的擴增檢測結果圖；1：陽性對照；2-5：待檢樣品；6：陰性對照。

圖4實施例四的擴增檢測結果圖；1：陽性對照；2-7依次為：105cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10¹cfu/ml、10cfu/ml的樣品DNA；8：陰性對照。

圖5實施例五的擴增檢測結果圖；1-20依次為：白假絲酵母菌(ATCC 66027)、熱帶假絲酵母菌(ATCC 66029)、熱帶假絲酵母菌(分泌物)、熱帶假絲酵母菌(糞便)、熱帶假絲酵母菌(尿液)、克柔假絲酵母菌(ATCC 6258)、克柔假絲酵母菌(痰液)、克柔假絲酵母菌(血液)、近平滑假絲酵母菌(ATCC 22019)、近平滑假絲酵母菌(糞便)、近平滑假絲酵母菌(引流液)、近平滑假絲酵母菌(痰液)、光滑假絲酵母菌(ATCC MYA-2950)、光滑假絲酵母菌(血液)、光滑假絲酵母菌(尿液)、季也蒙假絲酵母菌(血液)、季也蒙假絲酵母菌(痰液)、挪威假絲酵母菌(尿液)、都柏林假絲酵母菌(分泌物)、紅酵母菌(分泌物)。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種光滑假絲酵母菌環(huán)介導等溫擴增試劑盒及使用方法，該檢測試劑盒具有操作簡便、反應快速高效、特異性和靈敏度高、最低檢測限可達到100個拷貝、鑒定方法多樣等優(yōu)點。

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。

實施例一：

本實施例提供了一種光滑假絲酵母菌的LAMP檢測試劑盒和檢測方法。試劑盒中包括引物液、預混液、DNA聚合酶和對照。引物液包括50μM正向外引物F3、50μM反向外引物B3、50μM正向內引物FIP和50μM反向內引物BIP，引物序列如下：

正向外引物F3：5’-GAGACAAGCAATTCAAATCAAGGA-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-CGGCATCACCAGTACTCTTG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向內引物FIP：5’-TGGGTCGTCTTCTGAAGGAACATCATCCAAAGAAAAGATTCAATGCTGTT-3(SEQ ID NO:3)

反向內引物BIP：5’-TCCAGAGGTGGTTGTGGTAACACTGCTACCCACAAGTTTCAAACC-3’(SEQ ID NO:4)；

預混液包括12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反應緩沖液：150mM MgSO4水溶液，體積比為8:5:2；DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μl；對照包括陽性對照和陰性對照，陽性對照含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液。

使用上述試劑盒按以下方法對待測樣品進行檢測：

將帶檢樣品煮沸后離心，吸取上清，即為待測樣品DNA；在200μL PCR管配制反應體系：各引物液1.8μL，反應液15.2μL，DNA聚合酶1μL，待檢DNA1～6μL，用H₂O補齊到25μL。設置陽性對照反應時，用光滑假絲酵母菌的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA；將配制好的PCR管混勻后離心，并于60～65℃反應45-60min；通過觀察PCR管內產物是否渾濁來判斷擴增結果。

圖1是本實施例的檢測結果圖。圖1中陽性對照1的PCR管內產物渾濁，陰性對照6的PCR管內產物澄清，待測樣品2、3的PCR管內產物渾濁，表明待測樣品2、3中含有光滑假絲酵母菌；待測樣品4、5的PCR管內產物澄清，表明待測樣品4、5中不含光滑假絲酵母菌。

實施例二：

本實施例提供了一種含熒光染料的光滑假絲酵母菌的LAMP檢測試劑盒和檢測方法。試劑盒中包括引物液、預混液、DNA聚合酶、對照和熒光染料。引物液包括50μM正向外引物F3、反向外引物B3、正向內引物FIP、50μM反向內引物BIP，引物序列如下：

正向外引物F3：5’-GAGACAAGCAATTCAAATCAAGGA-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-CGGCATCACCAGTACTCTTG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向內引物FIP：5’-TGGGTCGTCTTCTGAAGGAACATCATCCAAAGAAAAGATTCAATGCTGTT-3(SEQ ID NO:3)

反向內引物BIP：5’-TCCAGAGGTGGTTGTGGTAACACTGCTACCCACAAGTTTCAAACC-3’(SEQ ID NO:4)；

預混液包括12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反應緩沖液：150mM MgSO4水溶液，體積比為8:5:2；DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μl；對照包括陽性對照和陰性對照，陽性對照含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液；熒光染料為SYBGreen。

用上述試劑盒按以下方法對待測樣品進行檢測：

將帶檢樣品煮沸后離心，吸取上清，即為待測樣品DNA；在200μL PCR管配制反應體系：各引物液1.8μL，反應液15.2μL，DNA聚合酶1μL，待檢DNA1～6μL，用H₂O補齊到25μL。設置陽性對照反應時，用光滑假絲酵母菌的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA；將配制好的PCR管混勻后離心，并于60～65℃反應45-60min；向上述反應管中再加入2μL顯色劑，混勻，若顯現黃綠色為陽性，橙色為陰性。

圖2是實施例二的顯色檢測結果圖。圖2中陰性對照6顯現橙色，陽性對照1顯現黃綠色，待測樣品2、3的PCR管顯黃綠色，表明待測樣品2、3中含有光滑假絲酵母菌；待測樣品4、5的PCR管顯橙色，表明待測樣品4、5中不含光滑假絲酵母菌。

實施例三：

本實施例提供了一種含熒光指示劑的光滑假絲酵母菌的LAMP檢測試劑盒和檢測方法。試劑盒中包括引物液、預混液、DNA聚合酶、對照和熒光指示劑。引物液包括50μM正向外引物F3、反向外引物B3、正向內引物FIP、50μM反向內引物BIP，引物序列如下：

正向外引物F3：5’-GAGACAAGCAATTCAAATCAAGGA-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-CGGCATCACCAGTACTCTTG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向內引物FIP：5’-TGGGTCGTCTTCTGAAGGAACATCATCCAAAGAAAAGATTCAATGCTGTT-3(SEQ ID NO:3)

反向內引物BIP：5’-TCCAGAGGTGGTTGTGGTAACACTGCTACCCACAAGTTTCAAACC-3’(SEQ ID NO:4)；

預混液包括12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反應緩沖液：150mM MgSO4水溶液，體積比為8:5:2；DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μl；對照包括陽性對照和陰性對照，陽性對照含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液；熒光指示劑為Syto9。

用上述試劑盒按以下方法對待測樣品進行檢測：

將帶檢樣品煮沸后離心，吸取上清，即為待測樣品DNA；在200μL PCR管配制反應體系：各引物液1.8μL，反應液15.2μL，DNA聚合酶1μL，待檢DNA 1～6μL，用H₂O補齊到25μL。設置陽性對照反應時，用光滑假絲酵母菌的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA；將配制好的PCR管混勻后離心，并于LineGene 9640qPCR儀上60～65℃反應45-60min；根據是否出現“S”型擴增曲線判斷擴增結果，若顯現“S”型擴增曲線則為陽性，若沒有顯現“S”型擴增曲線則為陰性。

圖3是實施例3的擴增檢測結果圖。圖3中陰性對照6顯現“直線”擴增曲線，陽性對照1顯現“S”型擴增曲線，待測樣品2、3顯現“S”型擴增曲線，表明待測樣品2、3中含有光滑假絲酵母菌，待測樣品4、5顯現“直線”擴增曲線，表明待測樣品4、5中不含光滑假絲酵母菌。

實施例四：

本實施例提供了一種含熒光指示劑的光滑假絲酵母菌的LAMP檢測試劑盒和檢測方法。試劑盒中包括引物液、預混液、DNA聚合酶、對照和熒光指示劑。引物液包括50μM正向外引物F3、反向外引物B3、正向內引物FIP、50μM反向內引物BIP，引物序列如下：

正向外引物F3：5’-GAGACAAGCAATTCAAATCAAGGA-3’(SEQ ID NO:1)；

反向外引物B3：5’-CGGCATCACCAGTACTCTTG-3’(SEQ ID NO:2)；

正向內引物FIP：5’-TGGGTCGTCTTCTGAAGGAACATCATCCAAAGAAAAGATTCAATGCTGTT-3(SEQ ID NO:3)

反向內引物BIP：5’-TCCAGAGGTGGTTGTGGTAACACTGCTACCCACAAGTTTCAAACC-3’(SEQ ID NO:4)；

預混液包括12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反應緩沖液：150mM MgSO4水溶液，體積比為8:5:2；DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μl；對照包括陽性對照和陰性對照，陽性對照含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液；熒光指示劑為Syto9。

用上述試劑盒按以下方法對待測樣品進行檢測：

將濃度為10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10¹cfu/ml、10cfu/ml的帶檢菌液煮沸后離心，分別吸取上清，即為待測樣品DNA；恒溫檢測反應：在200μL PCR管配制反應體系：引物液1.8μL，反應液15.2μL，DNA聚合酶1μL，熒光指示劑Syto91μL，待檢DNA1～6μL，用ddH2O補齊到25μL；設置陽性對照反應時，用光滑假絲酵母菌的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA；將配制好的PCR管混勻后離心，并于LineGene 9640qPCR儀上60～65℃反應45-60min；根據是否出現“S”型擴增曲線判斷擴增結果，若顯現“S”型擴增曲線則為陽性，若沒有顯現“S”型擴增曲線則為陰性。

圖4實施例四的擴增檢測結果圖；1：陽性對照；2-7依次為：105cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10¹cfu/ml、10cfu/ml的樣品DNA；8：陰性對照。本發(fā)明的試劑盒的靈敏度的結果可以達到10²cfu/ml的濃度，相比較泰普生物科學(中國)有限公司的光滑假絲酵母菌核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)(國械注準20153400930)檢測光滑假絲酵母菌的靈敏度10³copies/ml，說明本發(fā)明的試劑盒及方法靈敏度明顯高于PCR方法的靈敏度，能檢測出更低含量的樣品。

實施例五：

用實施例二的鑒定方法分別對分離純化的白假絲酵母菌(ATCC 66027)、 熱帶假絲酵母菌(ATCC 66029)、熱帶假絲酵母菌(分泌物)、熱帶假絲酵母菌(糞便)、熱帶假絲酵母菌(尿液)、克柔假絲酵母菌(ATCC 6258)、克柔假絲酵母菌(痰液)、克柔假絲酵母菌(血液)、近平滑假絲酵母菌(ATCC 22019)、近平滑假絲酵母菌(糞便)、近平滑假絲酵母菌(引流液)、近平滑假絲酵母菌(痰液)、光滑假絲酵母菌(ATCC MYA-2950)、光滑假絲酵母菌(血液)、光滑假絲酵母菌(尿液)、季也蒙假絲酵母菌(血液)、季也蒙假絲酵母菌(痰液)、挪威假絲酵母菌(尿液)、都柏林假絲酵母菌(分泌物)、紅酵母菌(分泌物)進行鑒定。

圖5實施例五的擴增檢測結果圖；1-20依次為：白假絲酵母菌(ATCC 66027)、熱帶假絲酵母菌(ATCC 66029)、熱帶假絲酵母菌(分泌物)、熱帶假絲酵母菌(糞便)、熱帶假絲酵母菌(尿液)、克柔假絲酵母菌(ATCC 6258)、克柔假絲酵母菌(痰液)、克柔假絲酵母菌(血液)、近平滑假絲酵母菌(ATCC 22019)、近平滑假絲酵母菌(糞便)、近平滑假絲酵母菌(引流液)、近平滑假絲酵母菌(痰液)、光滑假絲酵母菌(ATCC MYA-2950)、光滑假絲酵母菌(血液)、光滑假絲酵母菌(尿液)、季也蒙假絲酵母菌(血液)、季也蒙假絲酵母菌(痰液)、挪威假絲酵母菌(尿液)、都柏林假絲酵母菌(分泌物)、紅酵母菌(分泌物)。鑒定結果顯示白假絲酵母菌(ATCC 66027)、熱帶假絲酵母菌(ATCC 66029)、熱帶假絲酵母菌(分泌物)、熱帶假絲酵母菌(糞便)、熱帶假絲酵母菌(尿液)、克柔假絲酵母菌(ATCC 6258)、克柔假絲酵母菌(痰液)、克柔假絲酵母菌(血液)、近平滑假絲酵母菌(ATCC 22019)、近平滑假絲酵母菌(糞便)、近平滑假絲酵母菌(引流液)、近平滑假絲酵母菌(痰液)、季也蒙假絲酵母菌(血液)、季也蒙假絲酵母菌(痰液)、挪威假絲酵母菌(尿液)、都柏林假絲酵母菌(分泌物)、紅酵母菌(分泌物)反應管無“S”型曲線，即無擴增；光滑假絲酵母菌(ATCC MYA-2950)、光滑假絲酵母菌(血液)、光滑假絲酵母菌(尿液)顯現“S”型擴增曲線，即有擴增。

綜上所述，實施例一至實施例三的光滑假絲酵母菌的LAMP檢測試劑盒均可以從帶檢樣品中檢測出光滑假絲酵母菌。實施例四將本發(fā)明的試劑盒與商品化的光滑假絲酵母菌核酸檢測試劑盒進行了靈敏度比較，結果表明，本發(fā)明的靈敏度高于商品化試劑盒，檢測下限可以達到10²cfu/ml的濃度。實施例五驗證了本 發(fā)明試劑盒的特異性，結果表明，本發(fā)明試劑盒能夠特異的檢測光滑假絲酵母菌核酸，不會與其他真菌發(fā)生交叉反應。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。

<110> 上海速創(chuàng)診斷產品有限公司

<120> 一種用于檢測光滑假絲酵母菌的LAMP引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和使用方法

<160> 4

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 1

gagacaagc aattcaaatca agga 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 2

cggcatcacc agtactcttg 20

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向內引物FIP

<400> 3

tgggtcgtct tctgaaggaa catcatccaa agaaaagatt caatgctgtt 50

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向內引物BIP

<400> 4

tccagaggtg gttgtggtaa cactgctacc cacaagtttc aaacc 45