專利名稱：褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法以及專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培 養(yǎng)方法以及專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
W\iNilaparvata lugens Stal是我國及東南亞國家水稻生產(chǎn)上的一種重要遠(yuǎn)距離
遷飛性害蟲，嚴(yán)重威脅我國水稻的安全生產(chǎn)，在我國每年發(fā)生面積約1300-2000萬hm2， 約占水稻種植面積的50%，年均損失稻谷10-15億kg。種植抗蟲品種和使用化學(xué)殺蟲劑 是控制褐飛虱為害最為經(jīng)濟(jì)有效的防治方法，但由于抗蟲品種的大面積種植以及化學(xué)殺 蟲劑的大量使用，導(dǎo)致田間褐飛虱新致害性的出現(xiàn)和抗藥性的產(chǎn)生。研究表明，同翅目 昆蟲，如飛虱、蚜蟲、葉蟬等體內(nèi)普遍存在共生菌，這些共生菌與寄主昆蟲互惠互利、 協(xié)同進(jìn)化，在昆蟲的生長發(fā)育、繁殖過程中起著十分重要的作用。褐飛虱共生菌是一種 類酵母菌(yeast-like symbiotes，簡稱YLS)，隸屬于子囊菌亞門核菌綱的假絲酵母屬 (Candida)，通常存在于腹部脂肪體內(nèi)，呈長梭形、桿狀、卵形和球狀，營芽孢生殖， 并以卵母細(xì)胞垂直傳遞的方式直接傳給子代。這些共生菌在褐飛虱致害性變異、胚胎腹 節(jié)分化、體內(nèi)留醇類物質(zhì)代謝、氨基酸和維生素合成與供給、氮素循環(huán)和蛋白質(zhì)合成等 過程中起重要的作用。褐飛虱體內(nèi)共生菌種群存在多樣性和動態(tài)變化以及在外界逆境條 件下共生菌可以發(fā)生遺傳變異。取食抗蟲品種以及農(nóng)藥、高溫、抗生素等方法處理褐飛 虱導(dǎo)致體內(nèi)共生菌數(shù)量顯著下降。共生菌遺傳基因的易變性使其遺傳背景容易發(fā)生變化 或突變。在褐飛虱適應(yīng)抗蟲品種、形成新致害性種群的過程中，共生菌的遺傳物質(zhì)可能 已發(fā)生了變異。此種變異可能導(dǎo)致褐飛虱對水稻抗性品種致害性發(fā)生改變。因此，在褐 飛虱致害性變異過程中，類酵母共生菌可能起著比寄主本身更為重要的作用。由于類酵 母共生菌屬于單細(xì)胞生物，在進(jìn)行基因工程改造時比對宿主昆蟲進(jìn)行操作要方便的多。 因而利用基因工程方法轉(zhuǎn)化類酵母共生菌，降低其在宿主營養(yǎng)及生殖方面所起的作用， 不僅可以降低褐飛虱的發(fā)生率，找出產(chǎn)生褐飛虱致害性的變化位點，而且可以減少植物 病毒的傳播。建立褐飛虱類酵母共生菌離體培養(yǎng)技術(shù)為轉(zhuǎn)化類酵母共生菌遺傳學(xué)背景， 使其在與抗蟲水稻品種的互作中，遺傳學(xué)背景不易發(fā)生變化，為延長抗蟲水稻品種的田 間使用壽命等試驗的進(jìn)一步開展奠定了基礎(chǔ)。由于類酵母共生菌和宿主褐飛虱相互融 合，采用分離宿主脂肪體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法很難排除來自蟲體內(nèi)環(huán)境的污染，昆蟲體 內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)在褐飛虱(Socho等，1981)和煙草竊蠹(Noda等，1996) 上雖有報道，但兩者均采用蟲體進(jìn)行培養(yǎng)的方法，易造成污染，也未提及具體的培養(yǎng)基 配方，且不能獲得體外繼代培養(yǎng)共生菌的目的。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種褐飛虱類酵母共生菌的 離體培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基的技術(shù)方案，該發(fā)明能夠獲得褐飛虱體外繼代培養(yǎng)的類酵母共生菌菌株，為研究褐飛虱適應(yīng)抗蟲品種過程中類酵母共生菌的遺傳學(xué)背景以及改造 共生菌控制褐飛虱的為害提供基礎(chǔ)。所述的培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于包括以下重量 配比的組份
L 一天冬氨酸10 - 50mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物10 — 100mg/L、L 一天冬酰氨 酸 10 — 50 mg/L、L 一丙氨酸 10 — 50 mg/L、B 一丙氨酸 10 — 50 mg/L、L 一胱氨酸一 氫氧化物 1 一 5 mg/L、L 一谷氨酸 10 — 100 mg/L、L-谷酰氨酸 10 — 100 mg/L、L 一 氨基乙酸 10 — 100 mg/L、L 一組氨酸 100 — 500 mg/L、L 一異亮氨酸 1 一 10 mg/L、 L 一亮氨酸1 一 10 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物50 — 100 mg/L、L 一甲硫氨酸1 一 10 mg/L、L 一脯氨酸 10 - 50 mg/L、L 一苯丙氨酸 10 — 50 mg/L、DL 一絲氨酸 50 — 150 mg/L、L 一酪氨酸 1 一 10 mg/L、L 一色氨酸 5 — 50 mg/L、L 一蘇氨酸 10 — 50 mg/L、 L 一纈氨酸5 - 50 mg/L、葡萄糖10 — 100 mg/L、鏈霉素硫酸鹽5 — 50 mg/L、蘋果酸 50 - 100 mg/L、α 一酮戊二酸 10 — 50 mg/L、琥珀酸 1 一 10 mg/L、反丁烯二酸 1 一 10 mg/L、核黃素 0.001 - lmg/L、泛酸鈣 0.001 — lmg/L、葉酸 0.001 — lmg/L 和煙酸 0.001 — lmg/L。所述的培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于包括以下重量 配比的組份
L 一天冬氨酸20 - 40mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物20 — 80mg/L、L 一天冬酰氨酸 20 - 40mg/L、L 一丙氨酸 20 — 40 mg/L、B 一丙氨酸 20 — 40 mg/L、L 一胱氨酸一氫 氧化物2 - 4 mg/L、L 一谷氨酸20 — 80 mg/L、L 一谷酰氨酸20 — 80 mg/L、L-氨基 乙酸 20 - 80 mg/L、L 一組氨酸 200 — 400 mg/L、L 一異亮氨酸 2 — 8 mg/L、L 一亮氨 酸2 — 8 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物60 — 90 mg/L、L 一甲硫氨酸2 — 8mg/L、L 一 脯氨酸 20 - 40 mg/L、L 一苯丙氨酸 20 — 40 mg/L、DL 一絲氨酸 60 — 140 mg/L、L 一 酪氨酸 2 — 8 mg/L、L 一色氨酸 10 — 40 mg/L、L 一蘇氨酸 20 — 40 mg/L、L 一纈氨 酸10— 40 mg/L、葡萄糖20 — 80 mg/L、鏈霉素硫酸鹽10 — 40 mg/L、蘋果酸60 — 90 mg/L、α 一酮戊二酸 20 — 40 mg/L、琥珀酸 2 — 8 mg/L、反丁烯二酸 2 — 8 mg/L、核 黃素 0.005 - 0.5 mg/L、泛酸鈣 0.005 — 0.5mg/L、葉酸 0.005 — 0.5mg/L 和煙酸 0.005 — 0.5mg/L。所述的培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于包括以下重量 配比的組份
L 一天冬氨酸25 - 35mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物30 — 70mg/L、L 一天冬酰氨 酸 25 — 35mg/L、L 一丙氨酸 25 — 35 mg/L、B 一丙氨酸 25 — 35 mg/L、L 一胱氨酸一 氫氧化物2 - 3 mg/L、L 一谷氨酸30 — 70 mg/L、L 一谷酰氨酸30 — 70 mg/L、L-氨 基乙酸 30 - 70 mg/L、L 一組氨酸 250 — 350 mg/L、L 一異亮氨酸 3 — 7 mg/L、L 一 亮氨酸3 - 7 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物70 — 80 mg/L、L 一甲硫氨酸3 — 7mg/L、 L 一脯氨酸 25 - 35 mg/L、L 一苯丙氨酸 25 — 35 mg/L、DL 一絲氨酸 70 — 130 mg/L、 L 一酪氨酸 3 - 7 mg/L、L 一色氨酸 20 — 30 mg/L、L 一蘇氨酸 25 — 35 mg/L、L 一纈 氨酸20 - 30 mg/L、葡萄糖30 — 70 mg/L、鏈霉素硫酸鹽20 — 30 mg/L、蘋果酸70 — 80 mg/L、α 一酮戊二酸 25 — 35 mg/L、琥珀酸 3 — 7 mg/L、反丁烯二酸 3 — 7 mg/L、核黃素 0.01 — 0.1 mg/L、泛酸鈣 0.01 — 0.1mg/L、葉酸 0.01 — O.lmg/L 和煙酸 0.01 — O.lmg/L。所述的專用培養(yǎng)基離體培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的方法，其特征在于包括 以下工藝步驟
1)取褐飛虱在溫度25-30°C，相對濕度70-90%，光照時間10-16小時，光照強(qiáng)度 6000-8000 LUX下，用感蟲水稻品種進(jìn)行飼養(yǎng)；
2)將上述飼養(yǎng)的褐飛虱雌成蟲在羽化后24-72h內(nèi)取出，于75%酒精中消毒1-5分 鐘后，解剖腹部取出卵巢，并將卵巢用無菌水沖洗后浸沒于75%酒精中；
3)取30-50頭上述得到的卵巢，用75%酒精消毒后，于-196°C液氮中快速勻漿，得 到勻漿液；
4)在步驟3)得到的勻漿液中加入5-15ml無菌水，配置成溶液，經(jīng)孔徑0.1-0.45μιη 的millipor濾膜過濾后待用，為溶液I ；
5)將上述的專用培養(yǎng)基的各組分按所述的比例稱量后，溶解于水中，經(jīng)孔徑 0.1-0.45μιη的millipor濾膜過濾滅菌后待用，為溶液II ；
6)稱取瓊脂，將瓊脂與水按重量比為16-22 1000混合后，加熱、熔化，高壓滅菌 待用；
7)取溶液I、溶液II各Iml注入高溫滅菌的平皿中，再倒入冷卻至50-60°C步驟 6)制得的瓊脂5-lOml中，使三者均勻混合，然后接種褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌，在溫 度25-30°C，濕度80-100%條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)。所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟1) 中褐飛虱在人工智能培養(yǎng)箱中用養(yǎng)蟲籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度27-28°C，相對濕度 75-85%，光照時間12-14小時，光照強(qiáng)度7000-8000 LUX，所用感蟲水稻品種為感蟲 TNl品種。所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟2)中 褐飛虱雌成蟲在羽化后30-60h內(nèi)取出。所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟4)中 勻漿液中加入8-10ml無菌水，用孔徑0.2-0.35μιη的millipor濾膜過濾。所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟5)中 專用培養(yǎng)基的各組分按所述的比例稱量后，溶解于水中，經(jīng)孔徑0.2-0.35μιη的millipor濾 膜過濾。所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟6)中 瓊脂與水按重量比為18-20 1000混合。所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟7)中 褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌在溫度27-28°C，濕度80-90%條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)。上述的一種褐飛虱類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，設(shè)計合理，運用本發(fā)明的培 養(yǎng)方法，從褐飛虱體內(nèi)分離到兩株類酵母菌株，為進(jìn)一步研究類酵母共生菌的遺傳學(xué)背 景，類酵母共生菌與寄主褐飛虱之間相互利用營養(yǎng)關(guān)系以及改造共生菌以控制褐飛虱的 為害提供基礎(chǔ)。并且本發(fā)明中涉及的專用培養(yǎng)基配伍合理，為離體繼代培養(yǎng)褐飛虱類酵 母共生菌提供必要的營養(yǎng)基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法也為其他同翅目昆蟲體內(nèi)類酵母共生菌的分離培養(yǎng)提供了技術(shù)支撐。


圖1為褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的形態(tài)(箭頭所指，放大100倍)； 圖2分別為顯微鏡下褐飛虱類酵母共生菌的培養(yǎng)菌株形態(tài)；
圖3分別為顯微鏡下褐飛虱類酵母共生菌的培養(yǎng)菌株另一形態(tài)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例1 一種培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基的成分及配比
L 一天冬氨酸10mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物50mg/L、L 一天冬酰氨酸50 mg/L、 L—丙氨酸30mg/L、B—丙氨酸10mg/L、L 一胱氨酸一氫氧化物5 mg/L、L 一谷氨酸 10mg/L、L 一谷酰氨酸 100 mg/L、L 一氨基乙酸 10 mg/L、L 一組氨酸 300 mg/L、L -異亮氨酸lmg/L、L 一亮氨酸5 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物100 mg/L、L 一甲硫氨酸 5 mg/L、L 一脯氨酸 50 mg/L、L 一苯丙氨酸 10 mg/L、DL —絲氨酸 100 mg/L、L 一酪 氨酸10mg/L、L—色氨酸5mg/L、L 一蘇氨酸50 mg/L、L 一纈氨酸50mg/L、葡萄糖 10mg/L、鏈霉素硫酸鹽17.5 mg/L、蘋果酸50 mg/L、α 一酮戊二酸50mg/L、琥珀酸 lmg/L、反丁烯二酸10 mg/L、核黃素0.5mg/L、泛酸鈣0.001mg/L、葉酸lmg/L和煙酸 0.25mg/L。
實施例2 一種培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基的成分及配比 L 一天冬氨酸15mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物10mg/L、L 一天冬酰氨酸18mg/L、 L 一丙氨酸10 mg/L、B—丙氨酸30mg/L、L-胱氨酸一氫氧化物1 mg/L、L 一谷氨酸 50mg/L、L 一谷酰氨酸 40 mg/L、L-氨基乙酸 75 mg/L、L 一組氨酸 100 mg/L、L -異亮氨酸5mg/L、L 一亮氨酸10 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物50 mg/L、L 一甲硫氨酸 lmg/L、L 一脯氨酸 30 mg/L、L 一苯丙氨酸 25 mg/L、DL —絲氨酸 50 mg/L、L 一酪 氨酸5mg/L、L 一色氨酸25.5mg/L、L 一蘇氨酸30 mg/L、L 一纈氨酸25mg/L、葡萄 糖10mg/L、鏈霉素硫酸鹽25mg/L、蘋果酸75 mg/L、α 一酮戊二酸40mg/L、琥珀酸 3.5mg/L、反丁烯二酸 5 mg/L、核黃素 0.001mg/L、泛酸鈣 0.5mg/L、葉酸 0.01mg/L 和 煙酸 0.1mg/L。
實施例3 一種培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基的成分及配比 L 一天冬氨酸50mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物100mg/L、L 一天冬酰氨酸10mg/L、 L 一丙氨酸50 mg/L、B—丙氨酸50mg/L、L 一胱氨酸一氫氧化物3 mg/L、L 一谷氨 酸 100mg/L、L 一谷酰氨酸 25 mg/L、L 一氨基乙酸 100 mg/L、L 一組氨酸 500 mg/L、 L 一異亮氨酸10mg/L、L 一亮氨酸lmg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物60 mg/L、L 一甲硫 氨酸10mg/L、L 一脯氨酸10 mg/L、L 一苯丙氨酸50 mg/L、DL —絲氨酸150 mg/L、 L 一酪氨酸lmg/L、L—色氨酸50mg/L、L 一蘇氨酸10 mg/L、L 一纈氨酸5mg/L、葡 萄糖100mg/L、鏈霉素硫酸鹽50mg/L、蘋果酸100 mg/L、α 一酮戊二酸25mg/L、琥珀酸10mg/L、反丁烯二酸lmg/L、核黃素lmg/L、泛酸鈣O.lmg/L、葉酸0.25mg/L和煙 酸 O.Olmg/L。
實施例4 一種培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基的成分及配比 L 一天冬氨酸35mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物25mg/L、L 一天冬酰氨酸35mg/L、 L—丙氨酸25mg/L、B —丙氨酸13.5mg/L、L 一胱氨酸一氫氧化物2.5 mg/L、L 一谷 氨酸25mg/L、L 一谷酰氨酸75 mg/L、L 一氨基乙酸50 mg/L、L 一組氨酸200 mg/L、 L 一異亮氨酸2.5mg/L、L 一亮氨酸7 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物75mg/L、L 一甲硫 氨酸 3.5mg/L、L 一脯氨酸 15 mg/L、L 一苯丙氨酸 40 mg/L、DL —絲氨酸 135mg/L、 L 一酪氨酸 6.5mg/L、L—色氨酸 15mg/L、L 一蘇氨酸 40 mg/L、L 一纈氨酸 30mg/L、 葡萄糖50mg/L、鏈霉素硫酸鹽35mg/L、蘋果酸80 mg/L、α 一酮戊二酸30mg/L、琥珀 酸 5mg/L、反丁烯二酸 6.5 mg/L、核黃素 0.1mg/L、泛酸鈣 0.25mg/L、葉酸 0.5mg/L 和 煙酸 0.01mg/L。
實施例5 一種培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基的成分及配比 L 一天冬氨酸45mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物65mg/L、L 一天冬酰氨酸25mg/L、 L 一丙氨酸45 mg/L、B —丙氨酸42mg/L、L-胱氨酸一氫氧化物4.5 mg/L、L 一谷氨酸 65mg/L、L 一谷酰氨酸 50mg/L、L 一氨基乙酸 90mg/L、L 一組氨酸 400 mg/L、L -異亮氨酸7mg/L、L 一亮氨酸3mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物80mg/L、L 一甲硫氨酸 7mg/L、L—脯氨酸25mg/L、L 一苯丙氨酸20mg/L、DL —絲氨酸75mg/L、L 一酪氨酸 2.5mg/L、L—色氨酸 40mg/L、L—蘇氨酸 25mg/L、L 一纈氨酸 15mg/L、葡萄糖 70mg/ L、鏈霉素硫酸鹽45mg/L、蘋果酸65mg/L、α 一酮戊二酸15mg/L、琥珀酸8.5mg/L、 反丁烯二酸3.5mg/L、核黃素0.01mg/L、泛酸鈣lmg/L、葉酸0.001mg/L和煙酸0.5mg/ L。
實施例6 一種培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基的成分及配比 L 一天冬氨酸25mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物85mg/L、L 一天冬酰氨酸45mg/L、 L—丙氨酸40mg/L、B—丙氨酸25mg/L、L 一胱氨酸一氫氧化物2mg/L、L 一谷氨酸 80mg/L、L-谷酰氨酸10mg/L、L-氨基乙酸35mg/L、L 一組氨酸150 mg/L、L 一異亮 氨酸8.5mg/L、L—亮氨酸9mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物90mg/L、L —甲硫氨酸8.5mg/ L、L—脯氨酸40mg/L、L 一苯丙氨酸35mg/L、DL —絲氨酸125mg/L、L 一酪氨酸 8.5mg/L、L—色氨酸 35mg/L、L—蘇氨酸 15mg/L、L—纈氨酸 40mg/L、葡萄糖 85mg/ L、鏈霉素硫酸鹽25mg/L、蘋果酸90mg/L、α 一酮戊二酸lOmg/L、琥珀酸7mg/L、反 丁烯二酸 8.5mg/L、核黃素 0.25mg/L、泛酸鈣 0.01mg/L、葉酸 0.1mg/L 和煙酸 lmg/L。
實施例7: —種褐飛虱類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其通過以下步驟進(jìn)行 1)褐飛虱在人工智能培養(yǎng)箱中用養(yǎng)蟲籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度26士0.5°C，相對 濕度80士5%，光照時間12小時，光照強(qiáng)度8000 LUX，所用稻苗為感蟲Tm品種；或采 用飼養(yǎng)條件溫度25°C，相對濕度90%，光照時間16小時，光照強(qiáng)度6000 LUX;或采用飼養(yǎng)條件溫度30°C，相對濕度85%，光照時間10小時，光照強(qiáng)度8000 LUX;
2)將上述飼養(yǎng)的褐飛虱雌成蟲羽化后24h、30h、60h或72h內(nèi)取出，于75%酒精 中消毒3min后于解剖鏡下解剖腹部取出卵巢，并將卵巢用無菌水沖洗后浸沒于75%酒精 中；
3)取30-50頭雌成蟲腹部卵巢，75%酒精消毒后，-196°C液氮中快速勻漿，制得勻 漿液；
4)在上述的勻漿液中加入IOml無菌水，配置成溶液，經(jīng)0.22μιη的millipor濾膜過 濾后待用，為溶液I ； millipor濾膜可采用孔徑大小在0.1-0.45μιη的均可；
5)專用培養(yǎng)基各組分的配比培養(yǎng)基各組分按實施例1中所述的比例稱量后，溶解 于水中之后，通過0.45μιη的濾膜過濾滅菌后待用，為溶液II ； millipor濾膜可采用孔徑 大小在0.1-0.45μιη的均可；
6)瓊脂的配比稱取瓊脂，與水重量比為18 1000或采用16 1000、22 1000， 加熱、熔化，高壓滅菌；
7)取溶液I和溶液II各Iml注入高溫滅菌的平皿中，然后倒入冷卻至50、55或60°C 的步驟6)制得的瓊脂5-lOml，輕輕晃動平皿，使三者均勻混合進(jìn)行褐飛虱類酵母共生 菌的離體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度28士2°C，濕度85士5%。
試驗例
試驗材料褐飛虱；
試驗用培養(yǎng)基按實施例1配方配置；
離體培養(yǎng)方法按實施例7進(jìn)行；
試驗結(jié)果取供試褐飛虱雌成蟲解剖取卵巢，冷凍切片觀察可以看到，褐飛虱體內(nèi) 類酵母共生菌在形態(tài)上以長梭形形態(tài)(圖1)為主，長度為2 — 10μ m，寬度為0.5 — 2μ m,多端芽殖，出芽形成的單細(xì)胞連接形成假菌絲。通過離體培養(yǎng)48h后，有白色、 土黃色兩種菌落長出，白色菌落厚實、表面較濕潤、平坦無皺褶，邊緣不規(guī)則，顯微鏡 下觀察，細(xì)胞呈橢圓形，接近于桿狀，多端芽殖，長度為8 — 10 μ m，寬度為0.5 — 2μ m (圖2)，此菌株暫時命名為YLS-I號菌株。土黃色菌落厚實、呈豆腐渣狀，表面 不平整、較白色菌落干燥，邊緣不規(guī)則，顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈不規(guī)則圓球狀，長度為 2.5 — 4μ m，寬度為2 — 4μ m，并且連接成串，形成假菌絲(圖3)，此菌株暫時命名 為YLS-2號菌株。離體培養(yǎng)獲得的兩株菌株經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定，分別為解 脂假絲酵母QCmdidalipolytica)和嗜鹽梗孢酵母泣^^^ ^ / ^"^力^^^fos)。經(jīng)試驗確定用實施例2、3、4、5或6配制的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗，其也能達(dá)到與試 驗例1相同的技術(shù)效果。
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于包括以下重量配比的組份L 一天冬氨酸10 - 50mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物10 — 100mg/L、L 一天冬酰氨酸 10 - 50 mg/L、L 一丙氨酸 10 — 50 mg/L、B 一丙氨酸 10 — 50 mg/L、L 一胱氨酸一氫 氧化物 1 一 5 mg/L、L 一谷氨酸 10 — 100 mg/L、L 一谷酰氨酸 10 — 100 mg/L、L-氨 基乙酸 10 - 100 mg/L、L 一組氨酸 100 — 500 mg/L、L 一異亮氨酸 1 一 10 mg/L、L 一 亮氨酸1 一 10 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物50 — 100 mg/L、L 一甲硫氨酸1 一 10 mg/ L、L 一脯氨酸 10 - 50 mg/L、L 一苯丙氨酸 10 — 50 mg/L、DL 一絲氨酸 50 — 150 mg/ L、L 一酪氨酸 1 一 10 mg/L、L 一色氨酸 5 — 50 mg/L、L 一蘇氨酸 10 — 50 mg/L、 L 一纈氨酸5 - 50 mg/L、葡萄糖10 — 100 mg/L、鏈霉素硫酸鹽5 — 50 mg/L、蘋果酸 50 - 100 mg/L、α 一酮戊二酸 10 — 50 mg/L、琥珀酸 1 一 10 mg/L、反丁烯二酸 1 一 10 mg/L、核黃素 0.001 - lmg/L、泛酸鈣 0.001 — lmg/L、葉酸 0.001 — lmg/L 和煙酸 0.001 — lmg/L。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于包括 以下重量配比的組份L 一天冬氨酸20 - 40mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物20 — 80mg/L、L 一天冬酰氨酸 20 - 40mg/L、L 一丙氨酸 20 — 40 mg/L、B 一丙氨酸 20 — 40 mg/L、L-胱氨酸一氫氧 化物2 — 4 mg/L、L 一谷氨酸20 — 80 mg/L、L 一谷酰氨酸20 — 80 mg/L、L 一氨基乙 酸 20 — 80 mg/L、L 一組氨酸 200 — 400 mg/L、L 一異亮氨酸 2 — 8 mg/L、L 一亮氨酸 2-8 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物60 — 90 mg/L、L 一甲硫氨酸2 — 8mg/L、L 一脯 氨酸 20 — 40 mg/L、L 一苯丙氨酸 20 — 40 mg/L、DL —絲氨酸 60 — 140 mg/L、L -酪氨酸 2 — 8 mg/L、L 一色氨酸 10 — 40 mg/L、L 一蘇氨酸 20 — 40 mg/L、L 一纈氨 酸10— 40 mg/L、葡萄糖20 — 80 mg/L、鏈霉素硫酸鹽10 — 40 mg/L、蘋果酸60 — 90 mg/L、α 一酮戊二酸 20 — 40 mg/L、琥珀酸 2 — 8 mg/L、反丁烯二酸 2 — 8 mg/L、核 黃素 0.005 - 0.5 mg/L、泛酸鈣 0.005 — 0.5mg/L、葉酸 0.005 — 0.5mg/L 和煙酸 0.005 — 0.5mg/L。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的專用培養(yǎng)基，其特征在于包括 以下重量配比的組份L 一天冬氨酸25 - 35mg/L、L 一精氨酸一氫氧化物30 — 70mg/L、L 一天冬酰氨酸 25 - 35mg/L、L 一丙氨酸 25 — 35 mg/L、B 一丙氨酸 25 — 35 mg/L、L 一胱氨酸一氫 氧化物2 - 3 mg/L、L 一谷氨酸30 — 70 mg/L、L 一谷酰氨酸30 — 70 mg/L、L 一氨基 乙酸 30 - 70 mg/L、L 一組氨酸 250 — 350 mg/L、L 一異亮氨酸 3 — 7 mg/L、L 一亮氨 酸3 — 7 mg/L、L 一賴氨酸一氫氧化物70 — 80 mg/L、L 一甲硫氨酸3 — 7mg/L、L 一 脯氨酸 25 - 35 mg/L、L 一苯丙氨酸 25 — 35 mg/L、DL 一絲氨酸 70 — 130 mg/L、L 一 酪氨酸 3 — 7 mg/L、L 一色氨酸 20 — 30 mg/L、L 一蘇氨酸 25 — 35 mg/L、L 一纈氨 酸20 — 30 mg/L、葡萄糖30 — 70 mg/L、鏈霉素硫酸鹽20 — 30 mg/L、蘋果酸70 — 80 mg/L、α 一酮戊二酸 25 — 35 mg/L、琥珀酸 3 — 7 mg/L、反丁烯二酸 3-7 mg/L、核黃 素 0.01 — 0.1 mg/L、泛酸鈣 0.01 — 0. lmg/L、葉酸 0.01 — 0. lmg/L 和煙酸 0.01 — O.lmg/ L。
4.利用1或2或3所述的專用培養(yǎng)基離體培養(yǎng)褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的方法，其特 征在于包括以下工藝步驟1)取褐飛虱在溫度25-30°C，相對濕度70-90%，光照時間10-16小時，光照強(qiáng)度 6000-8000 LUX下，用感蟲水稻品種進(jìn)行飼養(yǎng)；2)將上述飼養(yǎng)的褐飛虱雌成蟲在羽化后24-72h內(nèi)取出，于75%酒精中消毒1-5分 鐘后，解剖腹部取出卵巢，并將卵巢用無菌水沖洗后浸沒于75%酒精中；3)取30-50頭上述得到的卵巢，用75%酒精消毒后，于-196°C液氮中快速勻漿，得 到勻漿液；4)在步驟3)得到的勻漿液中加入5-15ml無菌水，配置成溶液，經(jīng)孔徑0.1-0.45μιη 的millipor濾膜過濾后待用，為溶液I ；5)將上述的專用培養(yǎng)基的各組分按所述的比例稱量后，溶解于水中，經(jīng)孔徑 0.1-0.45μιη的millipor濾膜過濾滅菌后待用，為溶液II ；6)稱取瓊脂，將瓊脂與水按重量比為16-22 1000混合后，加熱、熔化，高壓滅菌 待用；7)取溶液I、溶液II各Iml注入高溫滅菌的平皿中，再倒入冷卻至50-60°C步驟 6)制得的瓊脂5-lOml中，使三者均勻混合，然后接種褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌，在溫 度25-30°C，濕度80-100%條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求4所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的 步驟1)中褐飛虱在人工智能培養(yǎng)箱中用養(yǎng)蟲籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度27-28°C，相對 濕度75-85%，光照時間12-14小時，光照強(qiáng)度7000-8000 LUX，所用感蟲水稻品種為感 蟲TNl品種。
6.如權(quán)利要求4所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的 步驟2)中褐飛虱雌成蟲在羽化后30-60h內(nèi)取出。
7.如權(quán)利要求4所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的 步驟4)中勻漿液中加入8-10ml無菌水，用孔徑0.2-0.35μιη的millipor濾膜過濾。
8.如權(quán)利要求4所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的 步驟5)中專用培養(yǎng)基的各組分按所述的比例稱量后，溶解于水中，經(jīng)孔徑0.2-0.35μιη的 millipor濾膜過濾。
9.如權(quán)利要求4所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的 步驟6)中瓊脂與水按重量比為18-20 1000混合。
10.如權(quán)利要求4所述的褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法，其特征在于所述 的步驟7)中褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌在溫度27-28°C，濕度80-90%條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)。
全文摘要
褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的離體培養(yǎng)方法以及專用培養(yǎng)基，屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。其專用培養(yǎng)基包括31種褐飛虱類酵母共生菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)；其培養(yǎng)方法包括褐飛虱成蟲飼養(yǎng)、褐飛虱卵巢處理、培養(yǎng)液的制備及離體培養(yǎng)等。運用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，從褐飛虱體內(nèi)分離到兩株類酵母菌株，為進(jìn)一步研究類酵母共生菌的遺傳學(xué)背景，類酵母共生菌與寄主褐飛虱之間相互利用營養(yǎng)關(guān)系以及改造共生菌以控制褐飛虱的為害提供基礎(chǔ)。并且本發(fā)明中涉及的專用培養(yǎng)基配伍合理，為離體繼代培養(yǎng)褐飛虱類酵母共生菌提供必要的營養(yǎng)基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法也為其他同翅目昆蟲體內(nèi)類酵母共生菌的分離培養(yǎng)提供了技術(shù)支撐。
文檔編號C12N1/16GK102010834SQ20101054340
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者何月平, 俞曉平, 張玨鋒, 陳列忠, 陳建明 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院