一種具殺線蟲活性的假絲酵母菌及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具殺線蟲活性的假絲酵母菌及其制備方法與應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的菌株為克魯絲假絲酵母菌（ Candidakrusei ）TY9，于2014年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M2014435，所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌株通過常規(guī)的液體發(fā)酵培養(yǎng)制備，應(yīng)用于防治植物寄生線蟲，特別是對全齒復(fù)活線蟲和/或松材線蟲有良好的防治效果，具有成本低，制備工藝簡單，原料易得，殺線蟲效果好等優(yōu)點，適合產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。CCTCC NO：M20144352014.09.20
【專利說明】一種具殺線蟲活性的假絲酵母菌及其制備方法與應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具殺線蟲活性的假絲酵母菌及其 制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 線蟲作為一類重要的病原物，它的危害已成為農(nóng)林生產(chǎn)上的重要問題。全世界已 報道的植物寄生線蟲達200多屬5000余種。作物病原線蟲危害糧食、油料、蔬菜、水果、棉 花、大豆、花生、三七、西洋參等3000多種植物，由于其具有地域分布廣、宿主種類多樣、隱 蔽性強、防控困難等特點，已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的第二大病害。據(jù)不完全估計植物寄生線蟲每 年造成全球1570億美元的損失。松材線蟲、根結(jié)線蟲、胞囊線蟲是最嚴(yán)重的危害多種重要 作物的線蟲。松材線蟲病是松樹的一種毀滅性病害。由于其危害嚴(yán)重、防治困難而受到世 界各國的高度重視，在世界上被列為重要的危險性森林病害。通常感病后40多天即可造成 松樹枯死,3~5年即可摧毀成片松樹，給人們帶來了極大的經(jīng)濟損失。松材線蟲的危害引起 疫區(qū)的恐慌，被稱為無煙的森林火災(zāi)。根結(jié)線蟲僅對世界上重要的經(jīng)濟作物每年造成的損 失就高達數(shù)百億美元。從世界范圍看，根結(jié)線蟲造成的年收入損失率約為10%。根結(jié)線蟲 病害在我國大部分地區(qū)都有發(fā)生，導(dǎo)致作物常年減產(chǎn)25%左右，嚴(yán)重時可以達70%以上?；?生根結(jié)線蟲在我國山東膠州半島發(fā)生嚴(yán)重，對產(chǎn)量影響極大，一般減產(chǎn)2(Γ30%，嚴(yán)重的減產(chǎn) 7(Γ80%。在我國除東北三省外，內(nèi)蒙古、河北、北京、山西、安徽、江蘇等省市僅大豆胞囊線蟲 的受害面積就達2 000萬畝以上，一般造成產(chǎn)量損失15?20%，嚴(yán)重的地塊達5(Γ80%以上，嚴(yán) 重病土甚至4飛年不能種植大豆，粗略估計每年造成損失達1億美元。在河南燕麥胞囊線 蟲病每年造成了小麥減產(chǎn)15~20%，已嚴(yán)重威脅我國小麥的安全生產(chǎn)。另外，小麥?zhǔn)艽司€蟲侵 染后，很容易受到其它病原物的入侵，加重了危害。
[0004] 目前，雖然可以通過傳統(tǒng)的輪作、土壤改良及化學(xué)防治等途徑加以控制某些植物 的線蟲病，但對于一些經(jīng)濟作物和林木而言，輪作防病難以實施，甚至根本不可能進行。近 些年來，隨著人們環(huán)境意識的增強，化學(xué)殺線劑的應(yīng)用逐步受到限制，除了繼續(xù)探索低毒， 低殘留，高選擇性的化學(xué)農(nóng)藥外，人們更關(guān)注開發(fā)生物防治制劑以作為化學(xué)農(nóng)藥的補充或 替代品。因此，對線蟲的生物防治研究自然成為重點和焦點問題。
[0005] 線蟲的生物防治是直接利用線蟲的生物天敵或者其某些方面的生物特性來進行 防治。線蟲的天敵多種多樣，主要有食線蟲真菌、細菌、螨、捕食性線蟲等，目前國內(nèi)外研究 的以食線蟲真菌為主。但是，由于土壤存在的抑真菌作用等因素的影響，限制了線蟲生物防 治的發(fā)展。同時，在微生物家族中，酵母菌由于其對宿主的低毒性、生長快速、易于培養(yǎng)，一 般不產(chǎn)生對人和寄主有害的代謝產(chǎn)物，對多種脅迫條件和逆境具有較強的耐受力，對多數(shù) 化學(xué)殺菌劑不敏感，能與多種化學(xué)物質(zhì)及物理方法結(jié)合使用。此外，酵母菌的遺傳學(xué)基礎(chǔ)研 究比較清楚，其遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)比較完善，具有通過基因工程技術(shù)提高其生防效力的潛力。因 此，研究開發(fā)酵母菌殺線蟲劑對防治線蟲和開發(fā)新的生物殺線蟲劑具有重要的意義。目前 關(guān)于假絲酵母菌生物防治線蟲的相關(guān)技術(shù)報道有限，市場上無來源于假絲酵母菌的用于防 治線蟲的商品生物防治制劑，尚屬技術(shù)空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具殺線蟲活性的 假絲酵母菌及其制備方法，開發(fā)假絲酵母菌源生物殺線蟲劑。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種具殺線蟲活性的假絲酵 母菌，該菌株經(jīng)分類學(xué)鑒定，命名為克魯絲假絲酵母菌TY9,于2014年9 月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)， 郵編是430072,保藏編號為CCTCC M 2014435,拉丁學(xué)名為
[0008] 所述克魯絲假絲酵母菌TY9系本發(fā)明人在開展胞外蛋白酶對線蟲侵染機制的研 究中，從大量植物根系土壤酵母菌中篩選的假絲酵母菌屬。研究發(fā)現(xiàn)其對線蟲具極高的毒 殺活性，通過多批次殺線蟲活性試驗確定其活性后，對菌株進行形態(tài)學(xué)、生理生化及分子鑒 定，確定為克魯絲假絲酵母菌TY9菌株。
[0009] 所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌株的主要形態(tài)特征為：在YM平板培養(yǎng)基上菌落呈圓 形，飽滿，表面濕潤光滑，菌苔白色；細胞圓形，橢圓形，芽殖。
[0010] 所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌株的主要生理生化特征為：發(fā)酵葡萄糖，脲酶陰性， DBB反應(yīng)陰性；細胞卵形，多邊芽殖，形成假菌絲；發(fā)酵葡萄糖、半乳糖，不發(fā)酵麥芽糖、蔗 糖、松三糖、棉子糖；同化木糖、乙醇、甘油；不產(chǎn)生色素，酯化性能高，代謝產(chǎn)生乙酸乙脂； 產(chǎn)甘油，產(chǎn)酸性蛋白酶。
[0011] -種制備所述克魯絲假絲酵母菌TY9的方法，先經(jīng)過試管種培養(yǎng)，再經(jīng)液體擴大 培養(yǎng)來制備，具體步驟如下： ① 試管種培養(yǎng) 培養(yǎng)基的重量配比為：1~3%酵母提取物，0. 5~2%蛋白胨，廣4%葡萄糖，廣3%氯化鈉， 1. 8?2%瓊脂，pH 5飛.5 ;將所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌體接種到上述培養(yǎng)基上，2Γ30? 下培養(yǎng)Γ3天，獲得試管種； ② 液體擴大培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基由下述重量百分比的原料組成：1~3%酵母提取物，0. 5~2%蛋白胨，廣4%葡 萄糖，3%氯化鈉，余量為水，ρΗ5?6. 5 ;將步驟①制備的試管種接種到500mL三角瓶液體培 養(yǎng)基中，每瓶裝200mL，于24?30°C下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間2飛天，轉(zhuǎn)速為20(T300r/min。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟②中的液體培養(yǎng)基的pH為6. 5。
[0013] 本發(fā)明提供了一種殺線蟲活性成分的提取方法，具體步驟如下：將所述步驟②制 備的發(fā)酵培養(yǎng)物于6000r/min離心10分鐘，取上清液，按09Γ90%飽和度加入硫酸銨，于4° C 靜置2小時，然后8500r/min離心30分鐘，棄上清；用50mmoL磷酸緩沖液（39mL的50mmoL 磷酸二氫鈉加61mL的50mmoL磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解,將重新溶解所獲溶液裝入 21mm透析袋(分子量為800(Tl4000Da)于1(Γ20倍的50mmoL磷酸緩沖液中透析:Γ4次，每 次3小時，即得殺線蟲活性成分，將其保存于4° C冰箱中待用。
[0014] 本發(fā)明還涉及所述克魯絲假絲酵母菌TY9的應(yīng)用，所述克魯絲假絲酵母菌TY9應(yīng) 用于防治植物寄生線蟲。
[0015] 所述克魯絲假絲酵母菌TY9具有殺線蟲活性，可用于制備植物寄生線蟲的生防 制劑，用于植物寄生線蟲的生物防治，所述的植物寄生線蟲為全齒復(fù)活線蟲 redivivus')熱 / 或欠致^kiBursaphelenchus xylophilus、。
[0016] 對所述克魯絲假絲酵母菌TY9殺線蟲作用機理的研究發(fā)現(xiàn)，其殺線蟲功能主要源 于蛋白酶成份，主要作用機理是該菌株產(chǎn)生的胞外蛋白酶分解線蟲體壁，破壞線蟲體壁的 完整，使線蟲內(nèi)容物外瀉，最終將線蟲殺死；在整個殺線蟲過程中，伴隨著產(chǎn)生蛋白酶、水解 酶對線蟲的作用，其毒力顯著。
[0017] 本發(fā)明采用的是從克魯絲假絲酵母菌菌種中分離出的1株綜合性狀較好的菌株， 于2014年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2014435 ;鑒于 該菌株可能由于（自發(fā)的、物理的或化學(xué)的）突變、原生質(zhì)體融合，轉(zhuǎn)化或其他通過生物技術(shù) 而發(fā)生變化或被改造，本菌種任何菌株的突變株、變種和衍生物均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0018] 本發(fā)明的有益效果如下： ①本發(fā)明提供了克魯絲假絲酵母菌l/YAsei )TY9,具有良好的殺線蟲活性，可 用于防治植物寄生線蟲，對比傳統(tǒng)的化學(xué)類防治方法，其環(huán)境友好，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過程 簡單，對環(huán)境無污染。
[0019] ②本發(fā)明所述克魯絲假絲酵母菌ΤΥ9的培養(yǎng)溫度為24~30°C，對能耗的要求不高， 其適用的營養(yǎng)基質(zhì)原料易得，無需生長因子，適用性較廣，適合于產(chǎn)業(yè)推廣應(yīng)用。
[0020] ③本發(fā)明可應(yīng)用于制備殺線蟲活性制劑，填補了本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)不足，并進一 步提供了所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌株的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，為酵母菌源生物防治線蟲提 供重要的技術(shù)基礎(chǔ)，特別是針對植物全齒復(fù)活線蟲和松材線蟲的生物防治。本發(fā)明對于植 物寄生線蟲的生物防治、微生物殺線蟲劑的開發(fā)應(yīng)用和農(nóng)產(chǎn)品的無公害生產(chǎn)，具有極其重 要的意義，適合于推廣應(yīng)用。

【具體實施方式】
[0021] 為了更詳細地進一步闡明而不是限制本發(fā)明，給出下列實施例。
[0022] 首先對克魯絲假絲酵母菌) TY9菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵 培養(yǎng)液中提取活性成分，進行殺線蟲活性實驗，確定其對植物全齒復(fù)活線蟲和松材線蟲的 作用。
[0023] 實施例一 制備所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌株的方法，先經(jīng)過試管種培養(yǎng)，再經(jīng)液體擴大培養(yǎng) 來制備，可按如下步驟進行： ① 試管種培養(yǎng) 培養(yǎng)基的重量配比為：3%酵母提取物，2%蛋白胨，4%葡萄糖，3%氯化鈉，2%瓊脂， pH6. 5 ;將所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌體接種到上述培養(yǎng)基上，30°C下培養(yǎng)3天，獲得試管 種； ② 液體擴大培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基由下述重量百分比的原料組成：3%酵母提取物，2%蛋白胨，4%葡萄糖，3%氯 化鈉，余量為水，PH6. 5 ;將步驟①制備的試管種接種到500mL三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝 200mL，于30°C下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間5天，轉(zhuǎn)速為300r/min。
[0024] 上述液體擴大培養(yǎng)所得發(fā)酵液中殺線蟲活性成分的提取方法如下：將所述步驟② 制備的發(fā)酵培養(yǎng)物于6000r/min離心10分鐘，取上清液，按90%飽和度加入硫酸銨，于4° C 靜置2小時，然后8500r/min離心30分鐘，棄上清；用50mmoL磷酸緩沖液（39mL的50mmoL 磷酸二氫鈉加61mL的50mmoL磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解,將重新溶解所獲溶液裝入 21mm透析袋(分子量為HOOODa)于20倍的50mmoL磷酸緩沖液中透析4次，每次3小時，即 得殺線蟲活性成分；將其保存于4° C冰箱中待用。
[0025] 實施例二 制備所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌株的方法，先經(jīng)過試管種培養(yǎng)，再經(jīng)液體擴大培養(yǎng) 來制備，可按如下步驟進行： ① 試管種培養(yǎng) 培養(yǎng)基的重量配比為：2%酵母提取物，1. 2%蛋白胨，2. 5%葡萄糖，2%氯化鈉，1. 9%瓊 脂，PH6 ;將所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌體接種到上述培養(yǎng)基上，28°C下培養(yǎng)2天，獲得試 管種； ② 液體擴大培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基由下述重量百分比的原料組成：2%酵母提取物，1.2%蛋白胨，2. 5%葡萄糖， 2%氯化鈉，余量為水，pH6 ;將步驟①制備的試管種接種到500mL三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶 裝200mL，于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間3天，轉(zhuǎn)速為250r/min。
[0026] 上述液體擴大培養(yǎng)所得發(fā)酵液中殺線蟲活性成分的提取方法如下：將所述步驟② 制備的發(fā)酵培養(yǎng)物于6000r/min離心10分鐘，取上清液，按60%飽和度加入硫酸銨，于4° C 靜置2小時，然后8500r/min離心30分鐘，棄上清；用50mmoL磷酸緩沖液（39mL的50mmoL 磷酸二氫鈉加61mL的50mmoL磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解,將重新溶解所獲溶液裝入 21mm透析袋(分子量為12000Da)于16倍的50mmoL磷酸緩沖液中透析4次，每次3小時，即 得殺線蟲活性成分；將其保存于4° C冰箱中待用。
[0027] 實施例三 制備所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌株的方法，先經(jīng)過試管種培養(yǎng)，再經(jīng)液體擴大培養(yǎng) 來制備，可按如下步驟進行： ① 試管種培養(yǎng) 培養(yǎng)基的重量配比為：1%酵母提取物，〇. 5%蛋白胨，1%葡萄糖，1%氯化鈉，1. 8%瓊脂， PH5 ;將所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌體接種到上述培養(yǎng)基上，24°C下培養(yǎng)1天，獲得試管 種； ② 液體擴大培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基由下述重量百分比的原料組成：1%酵母提取物，0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，1% 氯化鈉，余量為水，PH5 ;將步驟①制備的試管種接種到500mL三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝 200mL，于24°C下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間2天，轉(zhuǎn)速為200r/min。
[0028] 上述液體擴大培養(yǎng)所得發(fā)酵液中殺線蟲活性成分的提取方法如下：將所述步驟② 制備的發(fā)酵培養(yǎng)物于6000r/min離心10分鐘，取上清液，不加硫酸銨，于4° C靜置2小時， 然后8500r/min離心30分鐘，棄上清；用50mmoL磷酸緩沖液（39mL的50mmoL磷酸二氫鈉 加61mL的50mmoL磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋 (分子量為8000Da)于10倍的50mm〇L磷酸緩沖液中透析3次，每次3小時，即得殺線蟲活 性成分；將其保存于4° C冰箱中待用。
[0029] 實施例四 制備所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌株的方法，先經(jīng)過試管種培養(yǎng)，再經(jīng)液體擴大培養(yǎng) 來制備，可按如下步驟進行： ① 試管種培養(yǎng) 培養(yǎng)基的重量配比為：2%酵母提取物，1%蛋白胨，2%葡萄糖，2%氯化鈉，1. 8%瓊脂， pH5. 5 ;將所述克魯絲假絲酵母菌TY9菌體接種到上述培養(yǎng)基上，26°C下培養(yǎng)2天，獲得試管 種； ② 液體擴大培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基由下述重量百分比的原料組成：2%酵母提取物，1%蛋白胨，2%葡萄糖，2%氯 化鈉，余量為水，PH5. 5 ;將步驟①制備的試管種接種到500mL三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝 200mL，于26°C下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間4天，轉(zhuǎn)速為200r/min。
[0030] 上述液體擴大培養(yǎng)所得發(fā)酵液中殺線蟲活性成分的提取方法如下：將所述步驟② 制備的發(fā)酵培養(yǎng)物于6000r/min離心10分鐘，取上清液，按30%飽和度加入硫酸銨，于4° C 靜置2小時，然后8500r/min離心30分鐘，棄上清；用50mmoL磷酸緩沖液（39mL的50mmoL 磷酸二氫鈉加61mL的50mmoL磷酸氫二鈉，pH為7)重新溶解,將重新溶解所獲溶液裝入 21mm透析袋(分子量為IOOOODa)于15倍的50mmoL磷酸緩沖液中透析4次，每次3小時，即 得殺線蟲活性成分；將其保存于4° C冰箱中待用。
[0031] 殺線蟲活性試驗如下： 1.制備試驗用藥劑 按前述液體擴大培養(yǎng)方法培養(yǎng)克魯絲假絲酵母菌TY9菌株，按前述提取殺線蟲活性成 份的方法制備試驗用藥劑。
[0032] 2.制備對照用藥劑 對照1 :按前述1制備試驗用藥劑的方法制備對照用藥劑，但培養(yǎng)基中不接入克魯絲假 絲酵母菌TY9菌株； 對照2 :以50mm〇L磷酸緩沖液作為對照； 對照3 :以透析后的透析溶液作為對照； 對照4 :為了證明殺線蟲有效成份是蛋白酶，將制備供試藥劑煮沸滅活后作為對照。
[0033] 3.制備試驗用線蟲 ①制備全齒復(fù)活線蟲 將全齒復(fù)活線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28°C下培養(yǎng)6天，凍于4°C冰箱備用。將所 需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5mL離心管內(nèi)，加5mL無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復(fù) 5次得到潔凈供試線蟲；用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/^L的線蟲懸浮液。
[0034] ②制備松材線蟲 在IOOmL三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10mL，高壓滅菌，接入灰葡萄 孢(價ci/?￡irea)，25°C培養(yǎng)Γ7天；待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0. 25%次氯酸鈉表 面消毒的松材線蟲，28°C培養(yǎng)15~20天；用無菌水將線蟲洗下，制成含量為15條/^L的線蟲 懸浮液。
[0035] 4.試驗方法 藥效試驗方法為：取試驗用藥劑20〇μ?于I. 5mL離心管中，加入活線蟲150條，離心管 平放，置于25°C下，全齒復(fù)活線蟲分別于12小時、24小時、48小時；松材線蟲分別于24小 時、48小時、60小時檢查，計算線蟲的死亡率；并在光學(xué)顯微鏡下觀察線蟲體壁變化情況。
[0036] 鑒定死亡的方法為：在處理離心管中加入1飛滴5%氯化鈉溶液，2分鐘后觀察，死 蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
[0037] 分別用4種對照藥劑，每次處理重復(fù)三次。
[0038] 線蟲死亡率的計算式： 線蟲的死亡率％=死線蟲數(shù)/150 X 100 5.試驗結(jié)果 表1對全齒復(fù)活線蟲的毒殺效果

【權(quán)利要求】
1. 一種具殺線蟲活性的假絲酵母菌，其特征在于：該菌株為克魯絲假絲酵母菌 TY9,于2014年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 (ΧΤ<ΧΜ 201443544Τ#8*β?/7?//--?Γ?·5?^·。
2. -種制備如權(quán)利要求1所述具殺線蟲活性的假絲酵母菌的方法，包括所述克魯絲假 絲酵母菌ΤΥ9經(jīng)過常規(guī)的液體發(fā)酵后制備殺線蟲制劑，其特征在于：所述克魯絲假絲酵母 菌ΤΥ9的液體發(fā)酵培養(yǎng)基由下述重量百分比的原料組成：1~3%酵母提取物，0. 5~2%蛋白胨， 1?4%葡萄糖，1?3%氯化鈉，余量為水，ρΗ5?6. 5。
3. 如權(quán)利要求2所述具殺線蟲活性的假絲酵母菌的制備方法，其特征在于：所述液體 培養(yǎng)基的pH為6. 5。
4. 如權(quán)利要求1所述具殺線蟲活性的假絲酵母菌的應(yīng)用，其特征在于：所述克魯絲假 絲酵母菌TY9應(yīng)用于防治植物寄生線蟲。
5. 如權(quán)利要求4所述具殺線蟲活性的假絲酵母菌的應(yīng)用，其特征在于：所述的植物寄 生線蟲為全齒復(fù)活線蟲和/或松材線蟲。
【文檔編號】A01N63/04GK104263664SQ201410556060
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】牛秋紅, 張 林, 丁鋒, 唐悅, 和晶亮, 曹鋒, 張果 申請人:南陽師范學(xué)院