專利名稱：：一種假絲酵母菌株及生產(chǎn)d-阿拉伯醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種假絲酵母菌株，以及利用該假絲酵母將葡萄糖代謝成為D-阿拉伯醇的方法。
背景技術(shù)：
：D-阿拉伯醇(D-arabitol)是一種五糖醇，廣泛存在于自然界，是耐高滲微生物的重要產(chǎn)物之一，主要應(yīng)用在食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)。目前，D-阿拉伯醇最具市場潛力的用途在于作為原料合成木糖醇。對于積累D-阿拉伯醇菌株的研究，國外始于20世紀(jì)中期，而國內(nèi)起步比較晚且至目前為止鮮有報(bào)道。據(jù)報(bào)道，絕大多數(shù)耐高滲菌株都能夠合成D-阿拉伯醇，可能的原因是D-阿拉伯醇能夠保護(hù)高滲條件下的細(xì)胞，其中主要包括曲霉菌屬(Aspergillus)、假絲酵母屬(Candida)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、小叢梗孢屬(Moniliella)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克勒克酵母屬(Kodamae)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、青霉菌屬(Penicillium)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，但大部分菌株對D-阿拉伯醇的產(chǎn)率較低只有10X左右。目前有見報(bào)道的D-阿拉伯醇高產(chǎn)菌株見表1，其中主要是真菌，且大部分菌株的0-阿拉伯醇對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率在30%40%左右、發(fā)酵周期在72小時(shí)300小時(shí)、存在甘油、其他糖醇等副產(chǎn)物，這些因素直接限制了生物法的工業(yè)化應(yīng)用。D-阿拉伯醇的轉(zhuǎn)化底物可以分為碳?xì)浠衔?C^，C14，C15，C16)、碳水化合物、酒精等，雖然碳?xì)浠衔锖途凭某杀颈容^低但轉(zhuǎn)化率只有20%左右，而碳水化合物(主要是葡萄糖)的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到30%40%，因此葡萄糖是最主要的轉(zhuǎn)化底物。伴隨著木糖醇市場需求的激增和直接轉(zhuǎn)化D-阿拉伯醇為木糖醇菌株的發(fā)現(xiàn)，D-阿拉伯醇日益顯現(xiàn)作為木糖醇合成前體的重要性，獲得一株發(fā)酵周期短、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、符合工業(yè)化要求的菌株就顯得至關(guān)重要。表1部分D-阿拉伯醇高產(chǎn)菌株的發(fā)酵水平<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的生產(chǎn)D-阿拉伯醇的假絲酵母菌株。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，從花粉中首次篩選分離得到一株高產(chǎn)D-阿拉伯醇的菌株，經(jīng)鑒定為假絲酵母(Candidasp.)。該菌株命名為假絲酵母H2(Candidasp.H2)，它不同于已報(bào)道的高產(chǎn)D-阿拉伯醇的假絲酵母菌株。本發(fā)明涉及的微生物假絲酵母菌株H2已于2009年8月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCNo.3255。目前鑒定菌種的方法有很多，如經(jīng)典的分類鑒定法、化學(xué)分類法、遺傳學(xué)分類法等。本發(fā)明鑒定菌株是通過近年新發(fā)展起來的真菌26SrDNADl/D2區(qū)域序列分析法，具體鑒定路線包括(l)基因組抽提；(2)引物設(shè)計(jì)合成；(3)PCR擴(kuò)增；(4)PCR產(chǎn)物純化；(5)測序;(6)在線BLAST分析。本發(fā)明提供的假絲酵母菌株的26SrDNADl/D2區(qū)域序列與SEQIDNO:1序列一致。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用上述假絲酵母菌株生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明使用假絲酵母菌株生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法是先在含有葡萄糖和酵母抽提物的種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述假絲酵母菌株得到假絲酵母的種子菌，然后將所述假絲酵母的種子菌接于含有葡萄糖和酵母抽提物的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生D-阿拉伯醇。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的葡萄糖相對于該發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度為150g/l350g/l。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的葡萄糖相對于該發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度為200g/l300g/l。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的酵母抽提物相對于該發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度為5g/l15g/l。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的酵母抽提物相對于該發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度為8g/112g/l。進(jìn)一步地，本發(fā)明進(jìn)行所述發(fā)酵的條件為發(fā)酵液體培養(yǎng)基的pH為4.010.0、發(fā)酵溫度為25t:4(rC、假絲酵母的種子菌的接種量相對于所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基的體積為0.5ml/100ml-10ml/100ml、發(fā)酵時(shí)間為24小時(shí)240小時(shí)。進(jìn)一步地，本發(fā)明進(jìn)行所述發(fā)酵的條件為發(fā)酵液體培養(yǎng)基的pH為5.08.0、發(fā)酵溫度為30°C37°C、假絲酵母的種子菌的接種量相對于所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基的體積為0.5ml/100ml-2.5ml/100ml、發(fā)酵時(shí)間為72120小時(shí)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種新的可用于生產(chǎn)的D-阿拉伯醇的假絲酵母菌株；使用本發(fā)明假絲酵母H2(Candidasp.H2)生產(chǎn)的D-阿拉伯醇可達(dá)到較高產(chǎn)量，其積累量可達(dá)到86.55g的高水平。生物材料樣品的保藏信息保藏的生物材料樣品假絲酵母H2(Candidasp.H2);保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC);保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所(郵編:100101);保藏日期2009年8月28日；保藏登記號CGMCCNo.3255。具體實(shí)施例方式下面進(jìn)一步說明本發(fā)明。下面的實(shí)施僅僅是為了說明的目的，而并非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:取少許樣品如新鮮水果、腐爛水果、花粉、土壤、蜂巢和新鮮蜂蜜等于篩選固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天；后利用涂布法鋪于保藏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天；挑選不同菌落形態(tài)的菌株于保藏固體培養(yǎng)基，置于4t:冰箱保存待用。本實(shí)施例共篩得420株耐高滲菌株。接耐高滲菌株于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天；后取發(fā)酵液離心留上清；利用薄層層析法定性檢測D-阿拉伯醇。本發(fā)明涉及的薄層層析法的展開體系為丁酮丙酮水=10:1:1(ml/ml/ml)，顯色方法為高碘酸鈉-聯(lián)苯胺法(lg/L高碘酸鈉；1.4g聯(lián)苯胺溶于80ml95X乙醇，70ml蒸餾水，30ml丙酮，1.5ml鹽酸靜置12h備用)，通過薄層層析法定性獲得105株產(chǎn)D-阿拉伯醇菌株。利用HPLC對105株產(chǎn)D-阿拉伯醇菌株進(jìn)行定量檢測，獲得10株產(chǎn)量超過40gD-阿拉伯醇/L發(fā)酵液的菌株，其中一株菌株的產(chǎn)量最高達(dá)到50gD-阿拉伯醇/200g葡萄糖，并將該菌株命名為菌株H2。以菌株H2為出發(fā)菌株作進(jìn)一步研究。本發(fā)明涉及的HPLC法為Agilent1200HPLC，色譜柱為ZORBAXCarbohydrateAnalysisColumn(4.6X250mm，5iim);流動相為水乙腈=20:80(ml/ml);流速為lml/min;柱溫為30°C;檢測器為示差檢測器。此外，通過真菌26SrDNADl/D2區(qū)域序列分析法對所獲菌株H2進(jìn)行鑒定，方法如下1、模版DNA的提取在培養(yǎng)基中挑取菌體于101滅菌水中變性后離心去上清作為模板。反應(yīng)條件為:99°C，lOmin。2、PCR擴(kuò)增使用TaKaRaFungiIdentificationPCRKit(CodeNo.D317)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系包括上述1的變性反應(yīng)液liU，PCRPremix25iU，Dl/D2Forwardprimer0.5u1，Dl/D2Reverseprimer0.5u1，dH2023u1，總體積50u1。反應(yīng)條件為94°C5minl個(gè)循環(huán)94。C0.5rninT72°C5minl個(gè)循環(huán)3、PCR產(chǎn)物鑒定和回收取5ii1PCR產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，后使用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.2(CodeNo.DV805A)切膠回收目的片段進(jìn)行DNA測序。4、測序以SEQIDNO:2為引物進(jìn)行DNA測序。SeqForward:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'(SEQIDNO:2)5、鑒定將26SrDNADl/D2區(qū)域序列的測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列信息進(jìn)行BLAST比對，確定菌株H2為假絲酵母(Candidasp.)，并將該菌株H2命名為假絲酵母H2(Candidasp.H2)。本發(fā)明假絲酵母H2(Candidasp.H2)的26SrDNADl/D2區(qū)序列BLAST結(jié)果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例2:將培養(yǎng)23天的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，瓊脂粉15g/1，115t:滅菌20分鐘)接于裝有20ml種子液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，121。C滅菌20分鐘)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，吸取lml的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)的種子菌液體接于裝有100ml發(fā)酵液體培養(yǎng)基(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，pH7.0，115t:滅菌20分鐘)的500ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)144小時(shí)，結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例3實(shí)施例8:實(shí)施例3實(shí)施例8的培養(yǎng)方法中，葡萄糖相對于發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度如表1所示，其余培養(yǎng)條件與實(shí)施例2相同，結(jié)果如表3所示。實(shí)施例9將培養(yǎng)23天的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，瓊脂粉15g/1，115t:滅菌20分鐘)接于裝有20ml種子液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC滅菌加分鐘)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，吸取lml的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)種子菌液體接于裝有100ml發(fā)酵液體培養(yǎng)基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物lg/1，pH7.0，115t:滅菌20分鐘)的500ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)144小時(shí)，結(jié)果如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例10實(shí)施例14:實(shí)施例10實(shí)施例14的培養(yǎng)方法中，酵母抽提物相對于發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度如表2所示，其余培養(yǎng)條件與實(shí)施例9相同，結(jié)果如表4所示。實(shí)施例15將培養(yǎng)23天的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，瓊脂粉15g/1，115t:滅菌20分鐘)接于裝有20ml種子液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC滅菌加分鐘)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，吸取lml的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)種子菌液體接于裝有100ml發(fā)酵液體培養(yǎng)基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物10g/1，pH7.0，115t:滅菌20分鐘)的500ml三角瓶中，25°C、200rpm振蕩培養(yǎng)144小時(shí)，結(jié)果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例16實(shí)施例18:實(shí)施例16實(shí)施例18的培養(yǎng)方法中的發(fā)酵溫度如表5所示，其余培養(yǎng)條件與實(shí)施例15相同，結(jié)果如表5所示。實(shí)施例19:將培養(yǎng)23天的上述假絲酵母ffi(Candidasp.ffi)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，瓊脂粉15g/1，115t:滅菌20分鐘)接于裝有20ml種子液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC滅菌加分鐘)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，吸取lml的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)種子菌液體接于裝有100ml發(fā)酵液體培養(yǎng)基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物10g/1，pH4，115t:滅菌20分鐘)的500ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)144小時(shí)，結(jié)果如表6所示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例20實(shí)施例25:實(shí)施例20實(shí)施例25的培養(yǎng)方法中的pH如表6所示，其余培養(yǎng)條件與實(shí)施例19相同，結(jié)果如表6所示。實(shí)施例26將培養(yǎng)23天的上述假絲酵母ffi(Candidasp.ffi)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，瓊脂粉15g/1，115t:滅菌20分鐘)接于裝有20ml種子液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC滅菌加分鐘)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，吸取0.5ml的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)種子菌液體接于裝有100ml發(fā)酵液體培養(yǎng)基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物10g/1，pH6，115t:滅菌20分鐘)的500ml三角瓶中，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)144小時(shí)，結(jié)果如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例27實(shí)施例30:實(shí)施例27實(shí)施例30的培養(yǎng)方法中，假絲酵母的種子菌的的接種量如表5所示，其余培養(yǎng)條件與實(shí)施例26相同，結(jié)果如表7所示。實(shí)施例31將培養(yǎng)23天的上述假絲酵母ffi(Candidasp.ffi)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，瓊脂粉15g/1，115t:滅菌20分鐘)接于裝有20ml種子液體培養(yǎng)基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC滅菌加分鐘)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，吸取lml的上述假絲酵母H2(Candidasp.H2)種子菌液體接于裝有100ml發(fā)酵液體培養(yǎng)基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物10g/1，pH6，115t:滅菌20分鐘)的500ml三角瓶中，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)果如表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><400>1ggcagtatcgacaaagactataacacactaccgaggcagtgccacatttctttgcaattg60tcctaccgcccaaactgatgctggcccggtaaactgtagaggccacccccgagagagtaa120catacaaaataccaagtctgatctcaagcccttccctttcaacaatttcacgtacttttt180cactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctc240tcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctgcattcccaaacaa300ctcgactcttcgaaggaactttacataggtctgggacatctcatcgcacgggattctcac360cctctgtgacgttctgttccaagaaacatagacaagagccagacccaaagataccttctt420caaattacaactcggacactgaaagtgccagatttcaaatttgagcttttgccgcttcac480tcgccgctactaaggcaatccctgttggttt51權(quán)利要求一種假絲酵母菌株，其特征在于它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCCNo.3255；該菌株的26SrDNAD1/D2區(qū)域序列如SEQIDNO1所示。2.—種使用權(quán)利要求l的假絲酵母菌株生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法，其特征在于先在含有葡萄糖和酵母抽提物的種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述假絲酵母菌株得到假絲酵母的種子菌，然后將所述假絲酵母的種子菌接于含有葡萄糖和酵母抽提物的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生D-阿拉伯醇。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的葡萄糖相對于該發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度為150g/l350g/l。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的葡萄糖相對于該發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度為200g/l300g/l。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的酵母抽提物相對于該發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度為5g/l15g/l。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的酵母抽提物相對于該發(fā)酵液體培養(yǎng)基的濃度為8g/l12g/l。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法，其特征在于進(jìn)行所述發(fā)酵的條件為發(fā)酵液體培養(yǎng)基的pH為4.010.0、發(fā)酵溫度為25t:4(rC、假絲酵母的種子菌的接種量相對于所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基的體積為0.5ml/100ml-10ml/100ml、發(fā)酵時(shí)間為24小時(shí)240小時(shí)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法，其特征在于進(jìn)行所述發(fā)酵的條件為發(fā)酵液體培養(yǎng)基的pH為5.08.0、發(fā)酵溫度為3(TC37t:、假絲酵母的種子菌的接種量相對于所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基的體積為0.5ml/100ml-2.5ml/100ml、發(fā)酵時(shí)間為72120小時(shí)。全文摘要本發(fā)明公開了一種假絲酵母菌株及生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法，該假絲酵母菌株Candidasp.H2在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCCNo.3255；該菌株的26SrDNAD1/D2區(qū)域序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明使用上述假絲酵母菌株生產(chǎn)D-阿拉伯醇的方法是先在含有葡萄糖和酵母抽提物的種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述假絲酵母菌株得到假絲酵母的種子菌，然后將所述假絲酵母的種子菌接于含有葡萄糖和酵母抽提物的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生D-阿拉伯醇。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種新的可用于生產(chǎn)的D-阿拉伯醇的假絲酵母菌株；使用本發(fā)明假絲酵母H2(Candidasp.H2)生產(chǎn)的D-阿拉伯醇可達(dá)到較高產(chǎn)量，其積累量可達(dá)到86.55g的高水平。文檔編號C12R1/72GK101691543SQ20091015317公開日2010年4月7日申請日期2009年9月24日優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日發(fā)明者宋衛(wèi)斌,張建國,謝志鵬申請人:杭州寶晶生物化工有限公司