專利名稱：熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工技術領域，特別涉及將熱帶假絲酵母中負責β-氧化過程轉運途徑的肉毒堿乙酰輔酶A轉運酶阻斷的一種熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法。
背景技術：
十三碳二元酸(dicarboxylic acid，DCA)是一種重要的化工原料，是用來合成工程塑料、香料、耐寒性增塑劑、涂料、液晶等物質的重要原料。目前，十三碳二元酸主要通過熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)代謝烷烴來生產(chǎn)。
熱帶假絲酵母是一種不具有有性生殖方式的二倍體酵母，在它轉化烷烴生產(chǎn)長鏈二元酸的過程中，烷烴被轉運進入細胞后，首先由細胞色素P450酶氧化生成α-一元醇，再進一步被氧化生成α-一元酸，這被稱為α-氧化過程。接著，α-一元酸由同樣的酶系催化，經(jīng)過ω-氧化途徑被氧化生成α、ω-二元酸。在α、ω-氧化過程中生成的一元酸和二元酸都可以進入微體，經(jīng)過β-氧化被代謝消耗掉。因此，脂肪酸的β-轉運對生產(chǎn)長鏈二元酸是不利的。
雖然包括十三碳二元酸在內的長鏈二元酸系列產(chǎn)品在我國已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，但反應過程中的烷烴轉化率還有待進一步提高。這就需要盡可能抑制β-氧化過程，同時又要保證細胞生長和產(chǎn)酸需要的能量供應不受影響，使細胞的反應體系得到優(yōu)化。
研究者進行了阻斷β-氧化過程中某些酶的嘗試。但是結果發(fā)現(xiàn)，如果只阻斷一個拷貝，即進行不完全阻斷，對產(chǎn)酸則影響甚微甚至毫無影響；如果完全阻斷酶的作用，熱帶假絲酵母無法維持正常的能量供應，不能在烷烴上生長，從而無法生產(chǎn)二元酸。人們認為這是因為到目前為止，還沒有在β-氧化系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)有效的調控酶。但是，要在一個如此復雜的系統(tǒng)中找到關鍵的調控酶并非易事。同β-氧化過程相比，其中的轉運途徑要簡單得多，因此我們對β-氧化的轉運途徑進行了研究。
在一元酸和二元酸向β-氧化途徑轉運的過程中，肉毒堿乙酰基轉移酶(carnitine acyltransferase，CAT)起到了重要的作用。這是因為脂肪酸β-氧化的產(chǎn)物乙酰輔酶A不能通過微體膜，而CAT能可逆地催化乙酰輔酶A生成乙酰肉毒堿，乙酰肉毒堿能通過微體膜，進入線粒體，經(jīng)過三羧酸循環(huán)而產(chǎn)生能量。CAT在這里起到了非常關鍵的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法，其特征在于所述熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法是以熱帶假絲酵母工業(yè)生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，阻斷了一個拷貝的CAT基因，構建了熱帶假絲酵母中肉毒堿乙?；D移酶被部分阻斷的基因工程重組菌；具體實施方案為1、重組質粒pUCSS5hyg15的構建根據(jù)已發(fā)表的熱帶假絲酵母中肉毒堿乙?；D移酶(簡稱CAT)的DNA序列，設計合成兩段引物，上游CACTGCTTGAGCTCCACAAA，下游GCTAAATCCTGCAGGCAA，在兩段引物中分別引入SacI和Sse8387I位點，以熱帶假絲酵母基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈式反應(簡稱PCR)擴增CAT基因；反應條件85-100℃變性5-10分鐘以后，在85-100℃變性20-40秒，50-60℃退火1-4分鐘，70-82℃延伸4分鐘進行循環(huán)，共30個循環(huán)；將PCR產(chǎn)物用限制性內切酶SacI和Sse8387I消化，將得到的熱帶假絲酵母CAT基因連接到pUC18質粒的SacI-Sse8387I位點，得到中間載體pUCSS5。中間載體pUCSS5上有一個SalI位點，位于CAT基因的中間位置，將潮霉素抗性基因插入pUCSS5的SalI位點，轉化大腸桿菌，篩選具有潮霉素抗性的轉化子，提取質粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴增及測序，證明熱帶假絲酵母CAT基因和潮霉素基因已插入pUC18中，序列正確，重組質粒命名為pUCSS5hyg15；2、將重組質粒pUCSS5hyg15轉入熱帶假絲酵母將重組質粒pUCSS5hyg15用限制性內切酶SacI消化，得到線性質粒，用LiCl法轉化熱帶假絲酵母，得到的細胞涂到MD培養(yǎng)基上，在25-40℃培養(yǎng)2-3天，再轉到含潮霉素B的YPD培養(yǎng)基上，25-35℃培養(yǎng)，篩選具有潮霉素抗性的轉化子。根據(jù)熱帶假絲酵母中CAT前面的基因序列和潮霉素B抗性基因設計合成引物P3和P4。
上游AAGTACACCGGCAAGATCAGACC下游AGCTATTTACCCGCAGGACATATCC重組成功的轉化子可以擴增出500bp的片段；通過PCR方法驗證并測序后，從46個轉化子中得到1個CAT基因被單拷貝敲除的重組菌，命名為CZ-15；3、重組菌的培養(yǎng)在與培養(yǎng)野生菌株同樣的條件下，同時培養(yǎng)出發(fā)菌株和重組菌株。
培養(yǎng)條件為接入重組菌CZ-15后在25-36℃培養(yǎng)24小時，此時發(fā)酵搖瓶中的菌量達到一定濃度，加氫氧化鈉調pH值到7.5，加入十三碳烷烴到15％(V/V)，進入產(chǎn)酸期，之后每12小時或24小時調節(jié)pH到7.8，產(chǎn)酸期為4-5天。
本發(fā)明的有益效果是在同樣的條件下培養(yǎng)過程中，達到了出發(fā)菌株和重組菌株的生長情況基本相同；重組菌株中的CAT酶活降至出發(fā)菌株的一半左右，產(chǎn)酸速率得到提高；可以用來考察菌體本身的某些性質，而且基因重組菌的二元酸產(chǎn)量和烷烴轉化率都得到了明顯提高。


圖1為重組質粒pUCSS5hyg15的構建過程示意圖。
圖2為轉化子的PCR驗證示意圖。
圖3為出發(fā)菌株和重組菌株的生長曲線。
圖4為出發(fā)菌株和重組菌株的CAT酶活和產(chǎn)酸速率。
圖5為出發(fā)菌株F10-1和重組菌株CZ-15的產(chǎn)酸情況。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法。所述熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法是以熱帶假絲酵母工業(yè)生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，阻斷了一個拷貝的CAT基因，構建了肉毒堿乙?；D移酶被部分阻斷的基因工程菌。
具體實施方案為1、重組質粒pUCSS5hyg15的構建根據(jù)已發(fā)表的熱帶假絲酵母中肉毒堿乙?；D移酶的DNA序列，設計合成兩段引物，上游CACTGCTTGAGCTCCACAAA，下游GCTAAATCCTGCAGGCAA，在兩段引物中分別引入SacI和Sse8387I位點，以熱帶假絲酵母基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈式反應擴增CAT基因。
反應條件為94℃變性5分鐘，以下在94℃變性30秒，56℃退火2分鐘，72℃延伸4分鐘循環(huán)，共30個循環(huán)。
將PCR產(chǎn)物用限制性內切酶SacI和Sse8387I消化，將得到的熱帶假絲酵母CAT基因連接到pUC18質粒的SacI-Sse8387I位點，得到中間載體pUCSS5。中間載體pUCSS5上有一個SalI位點，位于CAT基因的中間位置，將潮霉素抗性基因插入pUCSS5的SalI位點，轉化大腸桿菌，篩選具有潮霉素抗性的轉化子，提取質粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴增及測序，證明熱帶假絲酵母CAT基因和潮霉素基因已插入pUC18中，序列正確，重組質粒命名為pUCSS5hyg15。
具體過程如圖1所示從熱帶假絲酵母F10-1基因組上擴增得到cat基因片段。用SacI和Sse8387I雙酶切該片段和pUC18質粒，將兩者連接起來得到質粒pUCSS5。將潮霉素B抗性基因用SalI酶消化，插入到質粒pUCSS5上cat基因中的SalI酶切位點上，得到質粒pUCSS5hyg15。
2、將重組質粒pUCSS5hyg15轉入熱帶假絲酵母將重組質粒pUCSS5hyg15用限制性內切酶SacI消化，得到線性質粒，用LiCl法轉化熱帶假絲酵母，得到的細胞涂到MD培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)2-3天，再轉到含潮霉素B的YPD培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，篩選具有潮霉素抗性的轉化子。根據(jù)熱帶假絲酵母中CAT前面的基因序列和潮霉素B抗性基因設計合成引物P3和P4(如圖2所示)。
具體實施方案為1、重組質粒pUCSS5hyg15的構建根據(jù)已發(fā)表的熱帶假絲酵母肉毒堿乙?；D移酶的DNA序列，設計合成兩段引物，上游CACTGCTTGAGCTCCACAAA下游GCTAAATCCTGCAGGCAA在兩段引物中分別引入SacI和Sse8387I位點，以熱帶假絲酵母基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈式反應擴增CAT基因；反應條件為85-100℃變性5-10分鐘，以下在85-100℃變性20-40秒，50-60℃退火1-4分鐘，70-82℃延伸4分鐘循環(huán)，共30個循環(huán)；將PCR產(chǎn)物用限制性內切酶SacI和Sse8387I消化，將得到的熱帶假絲酵母CAT基因連接到pUC18質粒的SacI-Sse8387I位點，得到中間載體pUCSS5。中間載體pUCSS5上有一個SalI位點，位于CAT基因的中間位置，將潮霉素抗性基因插入pUCSS5的SalI位點，轉化大腸桿菌，篩選具有潮霉素抗性的轉化子，提取質粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴增及測序，證明熱帶假絲酵母CAT基因和潮霉素基因已插入pUC18中，序列正確，重組質粒命名為pUCSS5hyg15；2、將重組質粒pUCSS5hyg15轉入熱帶假絲酵母將重組質粒pUCSS5hyg15用限制性內切酶SacI消化，得到線性質粒，用LiCl法轉化熱帶假絲酵母，得到的細胞涂到MD培養(yǎng)基上，在25-40℃培養(yǎng)2-3天，再轉到含潮霉素B的YPD培養(yǎng)基上，25-35℃培養(yǎng)，篩選具有潮霉素抗性的轉化子。根據(jù)熱帶假絲酵母中CAT前面的基因序列和潮霉素B抗性基因設計合成引物P3和P4。
上游AAGTACACCGGCAAGATCAGACC下游AGCTATTTACCCGCAGGACATATCC重組成功的轉化子可以擴增出500bp的片段；通過PCR方法驗證并測序后，從46個轉化子中得到1個CAT基因被單拷貝敲除的重組菌，命名為CZ-15；
3、重組菌的培養(yǎng)在與培養(yǎng)野生菌株同樣的條件下，同時培養(yǎng)出發(fā)菌株和重組菌株。
培養(yǎng)條件為接入重組菌CZ-15后在25-36℃培養(yǎng)24小時，此時發(fā)酵搖瓶中的菌量達到一定濃度，加氫氧化鈉調pH值到7.5，加入十三碳烷烴到15％(V/V)，進入產(chǎn)酸期，之后每12小時或24小時調節(jié)pH到7.8，產(chǎn)酸期為4-5天。
重組菌的通常培養(yǎng)條件為接入重組菌CZ-15后在30℃培養(yǎng)24小時，此時發(fā)酵搖瓶中的菌量達到一定濃度，加氫氧化鈉調pH值到7.5，加入十三碳烷烴到15％(V/V)，進入產(chǎn)酸期，之后每12小時或24小時調節(jié)pH到7.8，產(chǎn)酸期為4-5天。
實驗結果在同樣的條件下培養(yǎng)過程中，出發(fā)菌株和重組菌株的生長情況基本相同，并沒有明顯的差異，菌體生長曲線見圖3所示。
敲除一個CAT等位基因后，重組菌株中的CAT酶活降至出發(fā)菌株的一半左右，產(chǎn)酸速率得到提高(如圖4、圖5所示)。而且在產(chǎn)酸速率提高的過程中，CAT酶活則不斷下降。
因為熱帶假絲酵母的遺傳背景還不完全清楚，而且它是一種二倍體酵母，基因改造的困難較大，所以之前國內外文獻所作的研究都是在營養(yǎng)缺陷型菌株上進行的，這樣便于篩選，可以用來考察菌體本身的某些性質，而且基因重組菌的二元酸產(chǎn)量和烷烴轉化率都得到了明顯提高。
權利要求
1.一種熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法，其特征在于所述熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法是以熱帶假絲酵母工業(yè)生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，阻斷了一個拷貝的CAT基因，構建了肉毒堿乙?；D移酶被部分阻斷的基因工程重組菌；具體實施方案為1)重組質粒pUCSS5hyg15的構建根據(jù)已發(fā)表的熱帶假絲酵母中肉毒堿乙酰基轉移酶的DNA序列，設計合成兩段引物，上游CACTGCTTGAGCTCCACAAA，下游GCTAAATCCTGCAGGCAA，在兩段引物中分別引入SacI和Sse8387I位點，以熱帶假絲酵母基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈式反應擴增CAT基因；反應條件為85-100℃變性5-10分鐘，以下在85-100℃變性20-40秒，50-60℃退火1-4分鐘，70-82℃延伸4分鐘循環(huán)，共30個循環(huán)；將PCR產(chǎn)物用限制性內切酶SacI和Sse8387I消化，將得到的熱帶假絲酵母CAT基因連接到pUC18質粒的SacI-Sse8387I位點，得到中間載體pUCSS5，中間載體pUCSS5上有一個SalI位點，位于CAT基因的中間位置，將潮霉素抗性基因插入pUCSS5的SalI位點，轉化大腸桿菌，篩選具有潮霉素抗性的轉化子，提取質粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴增及測序，證明熱帶假絲酵母CAT基因和潮霉素基因已插入pUC18中，序列正確，重組質粒命名為pUCSS5hyg15；2)將重組質粒pUCSS5hyg15轉入熱帶假絲酵母將重組質粒pUCSS5hyg15用限制性內切酶SacI消化，得到線性質粒，用LiCl法轉化熱帶假絲酵母，得到的細胞涂到MD培養(yǎng)基上，在25-40℃培養(yǎng)2-3天，再轉到含潮霉素B的YPD培養(yǎng)基上，25-35℃培養(yǎng)，篩選具有潮霉素抗性的轉化子；根據(jù)熱帶假絲酵母中CAT前面的基因序列和潮霉素B抗性基因設計合成引物P3和P4；上游AAGTACACCGGCAAGATCAGACC，下游AGCTATTTACCCGCAGGACATATCC，重組成功的轉化子可以擴增出500bp的片段；通過PCR方法驗證并測序后，從46個轉化子中得到1個CAT基因被單拷貝敲除的重組菌，命名為CZ-15；3)重組菌的培養(yǎng)培養(yǎng)條件為接入重組菌CZ-15后在25-36℃培養(yǎng)24小時，此時發(fā)酵搖瓶中的菌量達到一定濃度，加氫氧化鈉調pH值到7.5，加入十三碳烷烴到15％(V/V)，進入產(chǎn)酸期，之后每12小時或24小時調節(jié)pH到7.8，產(chǎn)酸期為4-5天。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物化工技術領域的涉及一種熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構建方法。其構建方法是以熱帶假絲酵母工業(yè)生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，阻斷了一個拷貝的熱帶假絲酵母中負責β－氧化過程轉運途徑被部分阻斷的肉毒堿乙酰輔酶CAT基因，構建了熱帶假絲酵母基因工程重組菌。達到在同樣的條件下培養(yǎng)過程中，出發(fā)菌株和重組菌株的生長情況基本相同；重組菌株中的CAT酶活降至出發(fā)菌株的一半左右，產(chǎn)酸速率得到提高，可以用來考察菌體本身的某些性質，而且基因重組菌的二元酸產(chǎn)量和烷烴轉化率都得到了明顯提高。
文檔編號C12N15/66GK1614004SQ200410096698
公開日2005年5月11日 申請日期2004年12月7日 優(yōu)先權日2004年12月7日
發(fā)明者曹竹安, 高弘, 華玉濤, 焦鵬, 劉銘, 黃英明 申請人:清華大學