專利名稱：重要腸道致病病毒檢測基因芯片的制備和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及十種常見腸道致病病毒核酸檢測可視化基因芯片的制備和用途，屬基因芯片檢測技術領域。
背景技術：
腸道病毒(enterovirus)是一大群通過糞-口途徑傳播，經過消化道感染的病毒。 其感染雖然始于胃腸道，但很少引起這些部位的疾病。腸道病毒屬RNA病毒類的小RNA病毒科(picornaviridae),包括脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、致腸細胞病變人孤兒病毒(enterocytopathic human orphan virus, ECHO簡稱埃可病毒)及新型腸道病毒共71個血清型，腸道病毒屬病毒引起的傳染病。臨床表現(xiàn)輕者只有倦怠、乏力、低熱等，重者可全身感染，腦、脊髓、心、肝等重要器官受損，預后較差，并可遺留后遺癥或造成死亡。本類疾病分布于世界各地，在熱帶和亞熱帶全年都有，在溫帶夏季多見，在溫暖、潮濕、 衛(wèi)生條件差、人群擁擠的地區(qū)發(fā)病率高。腸道病毒引起的疾病，臨床表現(xiàn)復雜而多樣化，同型病毒可引起不同的臨床綜合癥，而不同型別病毒又可引起相似的臨床表現(xiàn)。多數(shù)腸道病毒感染后不出現(xiàn)或只出現(xiàn)輕微癥狀，如發(fā)熱或上呼吸道感染等，但有些腸道病毒感染可引起明顯的臨床癥狀，且腸道病毒引起的臨床癥狀很少與腸道疾病有關。腸道病毒所致的疾病主要有(I)脊髓灰質炎85% 的脊髓灰質炎由脊髓灰質炎病毒I型引起，偶有些由脊髓灰質炎病毒2、3型引起。(2)無菌性腦膜炎、腦炎和輕癱幾乎所有的腸道病毒感染都與無菌性腦膜炎、腦炎和輕癱有關。腸道病毒性腦膜炎幾乎每年夏秋季均有發(fā)生。其中有些型別，如?？刹《?、11、18、19、腸道病毒71型等曾引起過暴發(fā)流行。(3)皰疹性咽峽炎主要由柯薩奇病毒A組引起，典型癥狀是在軟腭、腭垂周圍出現(xiàn)水皰性潰瘍損傷。(4)手足口病主要由柯薩奇病毒A組5、10、16 型和腸道病毒71型引起，可導致暴發(fā)感染。(5)肋肌痛主要由柯薩奇病毒B組1-5型引起，患者表現(xiàn)為突發(fā)性發(fā)熱和單側胸痛，有時擴展為雙側胸痛或腹痛。(6)心肌炎和心包炎 主要由柯薩奇病毒B組1-5型引起，散發(fā)流行于成人和兒童，但對新生兒威脅最大，在嬰兒室可引起暴發(fā)流行。新生兒感染后，病毒可直接破壞心肌細胞，患兒出現(xiàn)發(fā)熱和突然的、不明原因的心力衰竭，死亡率高。(7)急性非細菌性胃腸炎輪狀病毒呈世界性分布。A組輪狀病毒感染最為常見，是引起6個月至2歲嬰幼兒嚴重胃腸炎的主要病原體，占病毒性胃腸炎的80%以上，是導致嬰幼兒死亡的主要原因之一。年長兒童和成人常呈無癥狀感染。輪狀病毒感染的傳染源是病人和無癥狀帶毒者。病人每克糞便中排出的病毒體可達IOltl個， 糞-口是主要的傳播途徑。病毒還可能通過呼吸道傳播，從有呼吸道癥狀兒童的呼吸道分泌物中曾檢出輪狀病毒的存在，在動物中已證明氣溶膠可傳播病毒。B組輪狀病毒可在成人中產生暴發(fā)流行，但至今僅在我國有過報道。C組輪狀病毒對人的致病性類似A組，但發(fā)病率很低。及時準確的甄別病毒型別是臨床診治和疾病監(jiān)控的關鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的腸道病毒實驗室檢測方法包括組織細胞培養(yǎng)法；血清學和直接檢測法(包括電鏡法)；間接、直接免疫熒光抗體法(IFA/DFA);酶免疫測定(EIA)、酶活性測定(神經氨酸酶測定)；核酸擴增法 (PCR)。病毒的分離培養(yǎng)與鑒定及血清學實驗等傳統(tǒng)實驗技術，在病毒性疾病診斷中曾起著十分重要的作用。組織細胞培養(yǎng)仍然是發(fā)現(xiàn)新病毒的重要技術手段，是其他任何技術不可替代的。然而，這些技術都還存在一些無法彌補的缺陷，操作費時、費力、敏感性差、診斷效率低等。總之，傳統(tǒng)的實驗室診斷方法和目前應用的實驗技術，遠遠不能滿足臨床診斷的需要，醫(yī)生單憑自己的臨床經驗進行病毒性疾病診斷的事是經常發(fā)生的。據此，病毒性疾病的實驗室診斷技術必須改革，要尋找和建立快速、特異、敏感和簡便的實驗技術，以適應臨床工作的需要?；蛐酒夹g是20世紀90年代初發(fā)展起來的一種用于基因分析的高新生物技術，廣泛用于臨床疾病的研究，特別是用于診斷一些微生物病原體的感染。與傳統(tǒng)的分子生物學技術相比，基因芯片技術其突出的特點是高通量、集成化、微型化、自動化等。特別適合于對大量未知樣品進行平行快速高通量的分析。病毒的基因組較簡單，每種病毒只有一種核酸，但是病毒增殖速度極快，故病毒較其他微生物更具有遺傳不穩(wěn)定性，即變異性。國內外文獻專利報道的基因芯片技術用于檢測腸道病毒的方法比較少，多數(shù)報道僅針對腸道病毒屬中的一種或幾種。因此文獻中報道的方法不能充分利用基因芯片高通量檢測這一特點，國內相關的研究包括顧大勇等人僅針對諾如病毒、輪狀病毒做了相關研究，史蕾等人針對諾如病毒的分型作了介紹。熒光檢測法是基因芯片的常規(guī)檢測方法，即將熒光色素化合物直接或間接標記在待檢核酸上，產生的熒光信號采用激光共聚焦掃描檢測。該方法的缺點熒光信號易飽和， 易淬滅；存在自發(fā)熒光現(xiàn)象；而且最大缺點是檢測儀器價格昂貴，體積笨重，從而嚴重限制了基因芯片的推廣應用，尤其是在中小醫(yī)療機構以及現(xiàn)場檢測的推廣應用。開發(fā)成本低廉、 檢測方便、適合現(xiàn)場檢測的基因芯片檢測新技術勢在必行。金標銀染技術(GLSS)的出現(xiàn)彌補了熒光檢測法的不足，使基因芯片可視化檢測成為可能。該技術的原理是首先用納米金標記待檢的PCR產物，然后在體系中引入銀離子。 小尺寸效應使納米金具有很強的催化還原作用，可以將周圍的銀離子還原成銀顆粒；而這些銀顆粒又可以進一步催化還原周圍的銀離子。這種級聯(lián)瀑布催化作用使得銀顆粒越聚越多，緊緊包裹納米金顆粒積聚成團狀銀殼，形成肉眼可見的黑色顆粒，肉眼即可觀測?；诮饦算y染的原理的可視化檢測技術能夠大幅降低生物芯片的檢測成本，但是單步金標銀染的檢測靈敏度還不能滿足分子檢測領域的更高要求，進一步提高可視化的靈敏度，使可視化檢測能夠完全代替熒光檢測，對于生物芯片技術的推廣應用具有重要意義。 TSA(tyramine siganal amplification,酪胺信號放大技術)是一種基于辣根過氧化物酶 (horseradishperoxidase, HRP)催化的生物信號放大技術，是由Bobrow等人于1989年首次提出的。信號放大分子酪胺是一個酚基化合物，可以作為HRP的作用底物。TSA的原理是在HRP酶催化下，大量連接半抗原的酪胺分子沉積，這些半抗原主要是生物素、熒光素等小分子物質。1992年,Adams將應用Biotin-Tyramine的TSA系統(tǒng)首先引入免疫組化,用于抗原或抗體的檢測?，F(xiàn)在，TSA技術在免疫印跡、ELISA分析以及原位雜交等諸多領域都得到了廣泛的應用。本研究采用不對稱RT-PCR結合可視化基因芯片檢測技術研發(fā)了常見腸道致病病毒核酸檢測可視化基因芯片，可對目前較常見的腸道致病病毒進行甄別，該芯片法敏感性
5好，特異性高，適合于多種腸道病毒的快速鑒定。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測常見腸道致病病毒核酸的可視化基因芯片，該芯片依托可視化芯片檢測技術實現(xiàn)了檢測信號的可視化，能同時檢測十種腸道致病病毒，包括脊髓灰質炎病毒1、2、3型、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒B3、B4、B5型、 ?？刹《?0型、輪狀病毒，從而實現(xiàn)高通量、特異、敏感、快速檢測常見腸道致病病毒的目的。為了達到上述目的，本發(fā)明開發(fā)了常見腸道致病病毒核酸檢測可視化基因芯片， 其制備方法如下I.步驟一制備特異引物經過比對各腸道病毒基因組，選擇病毒的特異、保守片段作為檢測靶基因，在保證各病毒靶基因特異性擴增的前提下兼顧其靈敏度，故將5對腸道致病病毒引物進行分管組合，經優(yōu)化最終確定了 3管多重RT-PCR體系。優(yōu)選的5對腸道致病病毒引物及其對應的擴增靶病毒種類和分管組合情況，如表I所示表I腸道致病病毒引物及其對應的擴增靶病毒種類和分管組合情況
權利要求
1.一種檢測常見腸道致病病毒核酸的可視化基因芯片，其制備方法包括I)步驟一制備5對腸道致病病毒引物，分別放入3管RT-PCR體系中，序列如表I所示表I引物序列
2.根據權利要求I所述的基因芯片，其特征還在于用于脊髓灰質炎病毒1、2、3型、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒B3、B4、B5型、?？刹《?0型、輪狀病毒的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重要腸道致病病毒檢測基因芯片，其制備方法包括制備特異引物，制備病毒特異性探針，制備寡核苷酸芯片，建立RT-PCR體系，建立雜交體系，制備可視化檢測試劑及建立顯色方法。利用本發(fā)明制備的基因芯片可同時甄別10種常見腸道致病病毒，包括包括脊髓灰質炎病毒1、2、3型、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒B3、B4、B5型、?？刹《?0型、輪狀病毒，為常見腸道致病病毒高通量、快速檢測提供一種新的解決方案，可為腸道致病病毒的監(jiān)測、臨床診斷及治療提供指導。
文檔編號C12R1/93GK102586476SQ20121001547
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權日2012年1月18日
發(fā)明者劉志紅, 劉琪琦, 張敏麗, 彭賢慧, 朱坤, 王升啟, 陳蘇紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所, 深圳市普瑞康生物技術有限公司