本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測用引物及檢測方法。

背景技術(shù)：

犬圓環(huán)病毒（Dog circovirus，DogCV）于2012年美國首次報(bào)道，隨后被認(rèn)為是犬壞死性血管炎和肉芽腫性淋巴結(jié)炎的病原體。臨床多表現(xiàn)為犬嘔吐、出血性腹瀉等癥狀。DogCV為無囊膜單股環(huán)狀DNA 病毒，分類地位上屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員。序列分析顯示，DogCV基因組大小為2kb左右，具有兩個(gè)主要的閱讀框（ORF）：分別編碼復(fù)制酶Rep蛋白和衣殼Cap蛋白。近年來，美國、意大利、德國相繼報(bào)道了該病毒，給犬群健康造成嚴(yán)重的威脅。由于犬圓環(huán)病毒是新發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物圓環(huán)病毒，目前尚缺乏針對性的檢測技術(shù)和方法，無法開展相關(guān)病原學(xué)和流行病學(xué)研究，以科學(xué)評(píng)估該病對犬群的危害及其程度，并制訂出針對性的防控措施。因此，迫切需要發(fā)展快速、準(zhǔn)確的犬圓環(huán)病毒檢測方法。

熒光定量PCR方法作為一種新技術(shù)，在動(dòng)物傳染病中已被成功地應(yīng)用豬圓環(huán)2型、乙腦、禽流感等檢測及流行病學(xué)調(diào)查。熒光定量PCR方法又分為探針法和SYBR GreenⅠ染料法。相比較探針法SYBR GreenⅠ染料法，不需要合成探針，且價(jià)格低廉，只需要設(shè)計(jì)出序列特異的引物。影響結(jié)果的引物二聚體和非特異性擴(kuò)增可以通過融解曲線分析克服。與傳統(tǒng)的PCR相比，熒光定量PCR能有效地減少試驗(yàn)過程中產(chǎn)生污染的危險(xiǎn)，并以其高靈敏度、高特異性、速度快等優(yōu)點(diǎn)在病原體的定性和定量檢測方面得到了廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對當(dāng)前犬圓環(huán)病毒特異性檢測技術(shù)手段的缺乏，提供一種犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測用引物及檢測方法。該實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的檢測靈敏度可達(dá)4.67×10¹個(gè)拷貝的病毒分子，對于單個(gè)樣本檢測時(shí)間為2個(gè)小時(shí)，可同時(shí)進(jìn)行大批量的樣本檢測，具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以實(shí)現(xiàn)對犬圓環(huán)病毒快速準(zhǔn)確檢測并鑒定的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一方面，提供一種犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測用特異性引物，該特異性引物是針對犬圓環(huán)病毒ORF2基因設(shè)計(jì)出的能夠檢測犬圓環(huán)病毒的特異性引物，特異性引物對序列為：

上游引物：5’-AAGTTCCATAGCAACGGGGTCTC-3’；

下游引物：5’-CCCACTGAACCGTTACAGGAGAA-3’。

本發(fā)明的另一方面，提供一種利用上述特異性引物檢測犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，該實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測方法還采用SYBR Green I染料進(jìn)行檢測，該實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測方法是將用于檢測犬圓環(huán)病毒的特異性引物和SYBR Green I染料置于同一反應(yīng)管中，使用熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。

在本發(fā)明的另一方面，提供檢測犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的反應(yīng)程序，具體為：預(yù)變性95℃ 5min；然后95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec循環(huán)40次。

采用本發(fā)明犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測用引物及檢測方法進(jìn)行犬圓環(huán)病毒的特異性檢測，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）特異性好，本發(fā)明提供的檢測用引物對狂犬病病毒、犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型基因組，均無特異性擴(kuò)增，說明引物對目的基因具有良好的特異性。

（2）靈敏度高，熒光檢測技術(shù)是極靈敏的檢測技術(shù)，采用本發(fā)明提供的檢測用引物進(jìn)行檢測，檢測靈敏度可達(dá)4.67×10¹個(gè)拷貝的病毒分子。

（3）可對產(chǎn)物進(jìn)行定量，由于熒光信號(hào)的強(qiáng)度和每次擴(kuò)增產(chǎn)物量成意義對應(yīng)的線性關(guān)系，通過熒光信號(hào)的檢測可以直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量。

（4）操作簡便，自動(dòng)化程度高，擴(kuò)增和檢測一步完成。

（5）養(yǎng)殖戶通過本發(fā)明的犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測用引物及檢測方法，能夠盡快知道是否犬群患有犬圓環(huán)病毒，及早采取措施，減少損失。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的有效性試驗(yàn)結(jié)果；如圖1所示，圖中1、2、3、4其中4份犬圓環(huán)病毒樣品的Ct值均小于等于33，且出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線；圖中5為其他樣品及陰性對照（超純水）擴(kuò)增結(jié)果，無Ct值并且無特異性的擴(kuò)增曲線。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。犬圓環(huán)病毒的特異性擴(kuò)增曲線，Ct值均小于33；其他樣品狂犬病病毒、犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型和陰性對照（超純水）擴(kuò)增結(jié)果，無Ct值并且無特異性的擴(kuò)增曲線。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的靈敏性試驗(yàn)結(jié)果。陽性模板在4.67×10¹個(gè)拷貝數(shù)仍有擴(kuò)增曲線。由圖3表明該方法檢測靈敏度可達(dá)4.67×10¹個(gè)拷貝。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件。

實(shí)施例1

犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的有效性試驗(yàn)

1、設(shè)計(jì)引物

針對犬圓環(huán)病毒ORF2基因設(shè)計(jì)能夠檢測犬圓環(huán)病毒的特異性引物序列：

上游引物：5’-AAGTTCCATAGCAACGGGGTCTC-3’，

下游引物：5’-CCCACTGAACCGTTACAGGAGAA-3’。

上下游引物均由上海生工公司合成，其中SYBR Green I染料購自普洛麥格有限公司。

2、實(shí)驗(yàn)所用的病毒和樣品

32份犬血液樣本采集于廣西壯族自治區(qū)玉林市，由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

3、提取犬圓環(huán)病毒DNA

將32份來自玉林的犬血清按照天根基因組試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）說明書提取病毒基因組。

4、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

反應(yīng)體系為20μL，上游引物、下游引物各1μL，SYBR Green I染料10μL，DNA模板2μL，補(bǔ)超純水至20μL。在ABI 7500熒光PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)定程序條件為：預(yù)變性95℃ 5min；然后95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec循環(huán)40次。

5、試驗(yàn)結(jié)果

熒光PCR儀收集熒光信號(hào)，自動(dòng)生成樣品擴(kuò)增曲線。如圖1所示1、2、3、4其中4份犬圓環(huán)病毒樣品的Ct值均小于等于33，且出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線；5為其他樣品及陰性對照無Ct值并且無特異性的擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定為犬圓環(huán)病毒，表明設(shè)計(jì)的引物能特異性檢測犬圓環(huán)病毒。

實(shí)施例2

犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)所用的病毒和樣品

32份犬圓環(huán)病毒組織樣品采集于廣西壯族自治區(qū)玉林市，由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

其他犬源病毒：狂犬病毒（Rabies virus，RV）、犬細(xì)小病毒（Canine Parvovirus，CPV ）、犬瘟熱病毒（Canine Distemper，CD）、犬副流感病毒（Canine Parainfluenza Virus，CPIV）、犬腺病毒2型（Canine adenovirus type 2，CAV-2）均由軍事獸醫(yī)研究所病毒學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

2、病毒核酸提取

將將犬圓環(huán)病毒樣品及其他其他犬源病毒按照天根基因組試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）說明書提取病毒基因組。

3、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)

采用實(shí)施例1中所提供的熒光PCR檢測方法分別對提取的核酸樣品進(jìn)行檢測，以確定方法的特異性，并以構(gòu)建的犬圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)品為對照。

4、試驗(yàn)結(jié)果

熒光PCR儀收集熒光信號(hào)，生成樣品擴(kuò)增曲線。如圖2所示犬圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值均小于等于33，且出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線；狂犬病毒、犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型以及純水對照的Ct值均大于33，且無特異性的擴(kuò)增曲線。表明該熒光PCR檢測方法具有良好的特異性。

實(shí)施例3

犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的靈敏性試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)所需樣品

將犬圓環(huán)病毒基因克隆測序正確后作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度和純度并稀釋至4.67×10⁰，4.67×10¹，4.67×10²，4.67×10³，4.67×10⁴，4.67×10⁵，4.67×10⁶，4.67×10⁷，4.67×10⁸拷貝/μL。

2、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的靈敏性試驗(yàn)

以稀釋好的梯度質(zhì)粒作為樣品，采用實(shí)施例1中所提供的熒光PCR檢測方法進(jìn)行檢測，以確定方法的靈敏性。

3、試驗(yàn)結(jié)果

熒光PCR儀收集熒光信號(hào)，自動(dòng)生成樣品擴(kuò)增曲線。如圖3所示，犬圓環(huán)病毒基因質(zhì)粒拷貝數(shù)為4.67×10¹和4.67×10⁸時(shí)的擴(kuò)增曲線Ct大于33，拷貝數(shù)為4.67×10¹，4.67×10²，4.67×10³，4.67×10⁴，4.67×10⁵，4.67×10⁶，4.67×10⁷，4.67×10⁸的質(zhì)粒擴(kuò)增曲線Ct小于33，表明該方法檢測靈敏度可達(dá)4.67×10¹個(gè)拷貝。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

<120> 犬圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測用引物及檢測方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagttccata gcaacggggt ctc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccactgaac cgttacagga gaa 23

<210> 3

<211> 677

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggagtaagtc cccttttaaa gcctgccgcc atattaaaag attttgatga tgatctgtct 60

tgtagagggt cgtatatgaa tggagcctta ttggggtctt ttggttgctc cattgttcct 120

ggtactgtcc ctgggtccag gtgtgatctt gtagcattcc ctcttccctg atcttctccg 180

tcaagatcta gtgctgttct tccaagtacg ttctccatca gtgttctggg ccagttgatc 240

catttagccc ttacgaagat ctttttgaat ttataatatc taaaaggtgg gagatgctgg 300

aaatctcctg tgccgtgaga ggcttgtaag aagtcagtca gtttgaatga cagatggtcg 360

aagttccata gcaacggggt ttctgtctgc ggatcattgg ttggtttgac tggtgctgtc 420

ggccaatcag ctgtcagtgt tctgcgcagt cgcagatgaa acagtttgaa attgttttgg 480

cgccttctcc tgtaacggat caatgggcgt gtcctgtatc tccggcgact tgcccgggca 540

tgtcttcgta cgcgcatgcg ccgtctgaat gttctccttc tgagcctgcg cagagaatga 600

ggatgtggtt agtgacgtca gcgtatcgag gtgcctggca tagtattacc cggcacctcg 660

tcacagacac agcacag 677