本發(fā)明涉及疾病診斷領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及TUBB2A在布加綜合征診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：布加綜合癥(Budd-Chiarisyndrome，BCS)是由肝靜脈和(或)其開口以上段下腔靜脈阻塞性病變引起的常伴有下腔靜脈綜合征為特點(diǎn)的一種肝后性門脈高壓癥。從全球范圍來看，BCS發(fā)病率較低，其病因有明顯的地域差別，西方國(guó)家以肝靜脈阻塞型BCS多見，大多有明確的病因，如口服避孕藥、妊娠、血液性疾病等，已有文獻(xiàn)報(bào)道，肝靜脈型BCS與基因突變導(dǎo)致的血液高凝狀態(tài)、肝靜脈血栓形成有關(guān)；而在亞洲和南非地區(qū)則以IVC阻塞型BCS多見，發(fā)病原因大多不清。BCS可引起肝臟損害、門靜脈高壓，甚至導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭、上消化道出血等嚴(yán)重并發(fā)癥，自然預(yù)后極差，5年生存率很低，非手術(shù)治療死亡率高。BCS患者早期的臨床表現(xiàn)隱匿，無特異性，且缺乏早期診療的有效方法，患者在就診時(shí)多屬晚期，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，容易造成誤診、誤治。國(guó)內(nèi)對(duì)BCS的研究多集中在臨床治療方面，相比之下流行病學(xué)和病因?qū)W的研究滯后，缺乏全國(guó)普查和病因?qū)W研究。因此，深入開展BCS病因?qū)W研究，提高BCS的早期診斷率是提高BCS患者生存與預(yù)后的關(guān)鍵問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種布加綜合征的診斷標(biāo)志物，本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明在布加綜合征患者的血液中TUBB2A基因mRNA含量顯著高于正常人群，因此TUBB2A基因的差異表達(dá)的性質(zhì)使其成為可以用來診斷受試者是否患有布加綜合征的分子標(biāo)志物。具體地，本發(fā)明提供了檢測(cè)TUBB2A的產(chǎn)品在制備布加綜合征診斷工具中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述檢測(cè)TUBB2A的產(chǎn)品包括檢測(cè)樣品中TUBB2A基因表達(dá)量的產(chǎn)品。更進(jìn)一步，所述檢測(cè)TUBB2A的產(chǎn)品包括能夠定量樣品中TUBB2A基因mRNA的產(chǎn)品，和/或能夠定量樣品中TUBB2A蛋白的產(chǎn)品。本發(fā)明的定量樣品中TUBB2A基因mRNA的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點(diǎn)雜交、熒光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法、高通量測(cè)序平臺(tái)等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學(xué)合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來獲得。進(jìn)一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS(AmplificationRefractoryMutationSystem，擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴(kuò)增的核酸可以通過使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特異性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測(cè)。所述能夠定量樣品中TUBB2A基因mRNA的產(chǎn)品包括實(shí)時(shí)定量PCR中使用的特異擴(kuò)增TUBB2A基因的引物，所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。產(chǎn)品中包括的引物可以通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過化學(xué)合成來制備。上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當(dāng)設(shè)計(jì)，并通過化學(xué)合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò)增它來制備。本發(fā)明的定量樣品中TUBB2A蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫測(cè)定法、免疫組織化學(xué)法、Western印跡等。本發(fā)明的定量樣品中TUBB2A蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合TUBB2A蛋白的抗體或其片段。可以使用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)(雙抗體)、或含有CDR的肽。本發(fā)明的定量樣品中TUBB2A蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞?？贵w可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免疫動(dòng)物后，從經(jīng)過免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的TUBB2A蛋白或其部分對(duì)獲得的抗體實(shí)施抗原特異性純化來獲得針對(duì)TUBB2A蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對(duì)血清實(shí)施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實(shí)施。例如，可以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用DMSO、緩沖劑、等準(zhǔn)備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-NH2、生物素標(biāo)記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-NH2、堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；過氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2、過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2(DojindoLaboratories)；藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2，B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒SH(DojindoLaboratories)；熒光標(biāo)記試劑盒諸如熒光素標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyteFluor(TM)555標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyteFluor(TM)647標(biāo)記試劑盒-NH2(DojindoLaboratories)；及DyLight547和DyLight647(TechnoChemicalCorp.)、Zenon(TM)、AlexaFluor(TM)抗體標(biāo)記試劑盒、Qdot(TM)抗體標(biāo)記試劑盒(InvitrogenCorporation)和EZ-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(FunakoshiCorporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來檢測(cè)經(jīng)過標(biāo)記的抗體或其片段。作為依照本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測(cè)定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣品來源于血液。進(jìn)一步，所述定量TUBB2A基因或TUBB2A蛋白的產(chǎn)品可以是檢測(cè)TUBB2A基因或TUBB2A蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。本發(fā)明還提供了一種診斷布加綜合征的工具，所述工具能夠檢測(cè)TUBB2A。進(jìn)一步，所述工具能夠檢測(cè)樣品中TUBB2A基因表達(dá)量。進(jìn)一步，所述工具包括能夠定量樣品中TUBB2A基因mRNA的試劑，和/或能夠定量樣品中TUBB2A蛋白的試劑。更進(jìn)一步，所述能夠定量樣品中TUBB2A基因mRNA的試劑是實(shí)時(shí)定量PCR中使用的特異擴(kuò)增TUBB2A基因的引物，所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述能夠定量樣品中TUBB2A蛋白的試劑包括與TUBB2A蛋白特異性結(jié)合的抗體。進(jìn)一步，所述診斷布加綜合征的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷布加綜合征的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知TUBB2A基因的異常與布加綜合征相關(guān)也屬于TUBB2A的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗TUBB2A抗體或其片段所識(shí)別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合TUBB2A即可。本發(fā)明還提供了一種診斷布加綜合征的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取受試者的樣品；(2)檢測(cè)受試者樣品中TUBB2A基因或蛋白的表達(dá)水平；(3)將測(cè)得的TUBB2A基因或蛋白的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來。(4)與正常對(duì)照相比，TUBB2A基因或蛋白的表達(dá)水平升高，則該受試者被判斷具有患有布加綜合征的傾向、或者已經(jīng)患有布加綜合征，或者布加綜合征患者被判斷為復(fù)發(fā)、或者布加綜合征患者被判斷為預(yù)后不良。在本發(fā)明的上下文中，“診斷布加綜合征”包括判斷受試者是否已經(jīng)患有布加綜合征、判斷受試者是否存在患有布加綜合征的風(fēng)險(xiǎn)、判斷布加綜合征患者是否已經(jīng)復(fù)發(fā)、判斷布加綜合征患者的預(yù)后。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷布加綜合征的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在布加綜合征發(fā)生的早期即可作出判斷，提供了患者的生存率。附圖說明圖1顯示利用QPCR在mRNA水平上檢測(cè)TUBB2A基因差異表達(dá)情況的統(tǒng)計(jì)圖。具體的實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1篩選差異表達(dá)基因1、研究對(duì)象和樣品收集(1)研究對(duì)象：3例布加綜合征患者和5例正常志愿者。(2)樣品收集：要求研究對(duì)象空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室溫下，抽取10ml靜脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置10分鐘，10,000rpm離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。每100-200μl血液收集的白細(xì)胞沉淀加入1mlTRIzol，-80℃凍存?zhèn)溆谩?、總RNA的獲取按照常規(guī)方法使用TRIzol提取血液白細(xì)胞中的總RNA。3、RNA濃度和純度測(cè)定NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品，RNA-seq測(cè)序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、RNA樣品的質(zhì)量分析(AgilentTechnologies2100Bioanalyzer)AgilentTechnologies2100Bioanalyzer檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量，觀察28SrRNA和18SrRNA主帶明顯、無降解、RNA完整性指數(shù)合格、濃度達(dá)到要求的符合測(cè)序cDNA文庫構(gòu)建的要求，可以用于文庫構(gòu)建及測(cè)序。5、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(1)RNA-seq讀段定位首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHatv1.3.1將清潔片段與UCSCH.sapiens參考基因組(hg19)進(jìn)行匹配，H.sapiensUCSChg19版的預(yù)先構(gòu)建的索引從TopHat主頁下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時(shí)，允許每個(gè)讀段(默認(rèn)到20)有多個(gè)匹配位點(diǎn)，最多2次錯(cuò)配。TopHat根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號(hào)建立可能的剪切位點(diǎn)庫，根據(jù)這些剪切位點(diǎn)庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用TopHat方法的系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。(2)轉(zhuǎn)錄豐度評(píng)估匹配上的讀段文件通過Cufflinksv1.0.3處理，Cufflinksv1.0.3將RNA-seq片段數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度。FPKM值指的是每一百萬測(cè)序片段中匹配到特定基因1kb長(zhǎng)的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計(jì)算FPKM估計(jì)值的置信區(qū)間。Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。(3)差異表達(dá)基因的檢測(cè)將下載的EnsemblGTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，檢測(cè)差異表達(dá)。在Cuffidff輸出中只有q值＜0.01，測(cè)試顯示成功的比較才被認(rèn)為是差異表達(dá)。6、結(jié)果比較布加綜合征患者和正常人血液中的基因表達(dá)差異，共有405個(gè)差異表達(dá)基因，317個(gè)上調(diào)，88個(gè)下調(diào)。其中，與正常人相比，TUBB2A基因在布加綜合征患者血液中表達(dá)上調(diào)，mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.71±0.93，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例2大樣本驗(yàn)證篩選出的差異表達(dá)基因選擇TUBB2A基因進(jìn)行驗(yàn)證。1、樣品收集按照實(shí)施例1的方法收集布加綜合征患者和正常人群的外周血樣品各50例。2、在mRNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證2.1提取血液總RNA步驟同實(shí)施例1。2.2逆轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄使用Primescript1ststrandcDNAsynthesiskit試劑盒，操作步驟如下進(jìn)行：(1)在微量離心管中加入以下反應(yīng)液體，如表1所示：表1反應(yīng)液體試劑劑量RNA2.0μgdNTP1.0μlOligo(dT)2.0μlRnasefreedH2O加至10.0μl(2)70℃孵育5min，迅速冷卻至4℃；在微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)試劑，制成反應(yīng)體系：表2反應(yīng)體系的配制試劑劑量5x1stStrandSynthesisBuffer4.0μlPrimeScriptRTase1.0μlRNaseInhibitor1.0μlRnasefreedH2O4.0μl輕輕震蕩，快速離心后，42℃反應(yīng)1h，70℃10min終止反應(yīng)，4℃冷卻，-20℃保存。采用SYBPPremixExTapTMII試劑盒，在EppendorfReal-timePCR分析儀進(jìn)行，具體操作如下：(1)在冰上配制以下PCR反應(yīng)液：表3PCR反應(yīng)液的配制試劑劑量SYBR10.0μl正向引物1.0μl反向引物1.0μlcDNA2.0μlddH2O6.0μl總量20.0μl引物序列設(shè)計(jì)如下：TUBB2A基因：5’-GCATCCTTAGTGAACTTCT-3’(SEQIDNO.1)；5’-CCACATCATTACATCAACAG-3’(SEQIDNO.2)β-actin：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQIDNO.3)；5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQIDNO.4)(2)上機(jī)，執(zhí)行下述程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s。60℃退火15s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果釆用相對(duì)定量法，運(yùn)用公式2-△△ct計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?！鱟t＝ct(A)-ct(β-actin)△△ct＝△ct(實(shí)驗(yàn)組)-△ct(對(duì)照組)結(jié)果如圖1所示，與正常對(duì)照人群相比，布加綜合征患者血液中TUBB2A基因的mRNA水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例2布加綜合征診斷試劑盒的制備根據(jù)TUBB2A基因與布加綜合征的相關(guān)性，可以通過檢測(cè)TUBB2A基因的表達(dá)情況來診斷布加綜合征，據(jù)此本發(fā)明提供了一種基于檢測(cè)TUBB2A基因表達(dá)來診斷布加綜合征的試劑盒，該診斷試劑盒中的組分如下：SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系；擴(kuò)增TUBB2A基因和β-actin基因的引物對(duì)。擴(kuò)增TUBB2A基因的正向引物序列為5’-GCATCCTTAGTGAACTTCT-3’，反向引物序列為5’-CCACATCATTACATCAACAG-3’；擴(kuò)增β-actin的正向引物序列為5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，反向引物序列為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’。SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBRGreen熒光染料。PCR緩沖液成分為：25mMKCL，2.5mMMgCL2、200mM(NH4)2SO4。上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司<120>TUBB2A作為血液診斷標(biāo)志物的用途<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1gcatccttagtgaacttct19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ccacatcattacatcaacag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gtggggcgccccaggcacca20<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4ctccttaatgtcacgcacgattt23當(dāng)前第1頁1 2 3