本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種在口腔鱗狀細(xì)胞癌生物標(biāo)記物及其應(yīng)用，具體的涉及在口腔鱗狀細(xì)胞癌顯著上調(diào)的XIRP2的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

口腔惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。在口腔惡性腫瘤中，口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)比例約占90％。與其他腫瘤的發(fā)生一樣，OSCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因，多分子呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，多步驟、多階段共同作用的長(zhǎng)期復(fù)雜過(guò)程。各腫瘤基因、分子之間相互協(xié)同作用促使腫瘤細(xì)胞形成和發(fā)展。目前腫瘤的發(fā)生機(jī)制及治療均未取得重大突破，如何早期檢測(cè)腫瘤病損及根治是現(xiàn)代腫瘤工作者難題及機(jī)遇。

腫瘤是一種分子水平的疾病，從基因蛋白水平進(jìn)行腫瘤的研究是最終途徑。近年在整體水平上以高通量分子掃描手段為基礎(chǔ)的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等技術(shù)的整合及相互關(guān)聯(lián)的“技術(shù)鏈”的應(yīng)用等為腫瘤的研究提供了新的契機(jī)，并且已經(jīng)在乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、黑色素瘤等的研究中取得了豐碩的成果。其中基因表達(dá)譜芯片是最典型的代表，通過(guò)基因表達(dá)譜芯片可以檢測(cè)和篩選腫瘤組織與正常組織的差異基因以及癌基因、抑癌基因的變化及變化關(guān)系，從中尋找病因，為早期診斷及根治提供線索和依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種口腔鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)記物，靈敏和特異性的實(shí)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷和治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了XIRP2基因在制備診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括通過(guò)芯片、印跡法、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、FISH法、CGH法或陣列CGH法、亞硫酸氫鹽測(cè)序法、COBRA法檢測(cè)XIRP2基因的變化以診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品。

其中，印跡法包括Northern、Southern、Western印跡法。Southern印跡法是將從樣本得到的基因組DNA分離并固定，通過(guò)檢測(cè)DNA與XIRP2基因的雜交來(lái)測(cè)定樣本中的XIRP2基因；Northern印跡法是一種將由樣本中獲得的mRNA分離、固定，通過(guò)檢測(cè)mRNA與XIRP2基因的雜交來(lái)檢測(cè)該基因的mRNA；Western印跡法是一種將樣本中的蛋白分離、固定，通過(guò)檢測(cè)抗體與XIRP2蛋白的免疫反應(yīng)來(lái)分析基因的表達(dá)程度。

其中，所述用RT-PCR診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增XIRP2基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增XIRP2基因的引物。

進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷管鱗癌的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增XIRP2基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明提供了一種診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中XIRP2基因的表達(dá)水平來(lái)診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒或制劑。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)XIRP2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)XIRP2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的XIRP2蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)XIRP2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括XIRP2蛋白的特異性抗體。

本發(fā)明所述的基因芯片或基因檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括XIRP2基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括XIRP2蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。將口腔鱗狀細(xì)胞癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明提供了XIRP2基因在制備治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括XIRP2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。所述抑制劑包括抑制XIRP2基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制XIRP2基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制XIRP2基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。

進(jìn)一步，所述抑制劑是針對(duì)XIRP2基因的siRNA、針對(duì)XIRP2蛋白的抗體；優(yōu)選的，所述抑制劑為siRNA。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述針對(duì)XIRP2基因的siRNA的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本發(fā)明還提供了一種治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物組合物，所述藥物包含XIRP2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物抑制劑。所述抑制劑包括抑制XIRP2基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制XIRP2基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制XIRP2基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。

本發(fā)明還提供了一種抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法是將針對(duì)XIRP2基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因在體外導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中。

本發(fā)明提供了一種組合藥物，所述組合藥物包括上述的藥物組合物、和含抗腫瘤劑的藥物組合物。

進(jìn)一步，抗腫瘤劑的藥物組合物包括但不限于免疫治療劑如西妥昔單克隆抗體，化學(xué)治療劑或化學(xué)放射性治療劑如卡波鉑或者是一種相關(guān)類別的鉑類藥物、紫杉烷或者是一種類別的紫衫烷，或者是兩者。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)記物—XIRP2，通過(guò)檢測(cè)受試者XIRP2的變化，來(lái)實(shí)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷。

本發(fā)明提供了治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的分子靶標(biāo)，通過(guò)靶向于分子標(biāo)志物來(lái)治療疾病具有敏感性和特異性。

本發(fā)明對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用QPCR檢測(cè)XIRP2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況；

圖2顯示利用QPCR檢測(cè)XIRP2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；

圖3顯示利用QPCR檢測(cè)siRNA對(duì)XIRP2基因表達(dá)的影響；

圖4顯示MTT法檢測(cè)XIRP2對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖活性的影響；

圖5顯示利用transwell小室檢測(cè)XIRP2基因?qū)谇击[狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響。

具體的實(shí)施方式

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了XIRP2與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并驗(yàn)證了XIRP2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)。XIRP2可作為口腔鱗狀細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，也可以和其他的基因標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)記物”是其在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正?；蚪】导?xì)胞或組織的表達(dá)水平相比發(fā)生改變的任何基因或蛋白。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對(duì)本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。作為非限制性的實(shí)例，標(biāo)志物基因可具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的編碼序列或氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。

本文所述的生物標(biāo)記物包括基因和蛋白。此類生物標(biāo)記物包括含有編碼生物標(biāo)記物的核酸序列或此序列的互補(bǔ)序列的完整或部分序列的DNA。生物標(biāo)記物核酸還包括含有所關(guān)注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物標(biāo)記物蛋白是由本發(fā)明的DNA生物標(biāo)記物編碼的或?qū)?yīng)于本發(fā)明的DNA生物標(biāo)記物的蛋白。生物標(biāo)記物蛋白包含任何生物標(biāo)記物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物標(biāo)記物基因和蛋白的片段和變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所謂“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而編碼的蛋白的一部分。為生物標(biāo)記物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400個(gè)連續(xù)的核苷酸，或最多存在于本文所公開(kāi)的全長(zhǎng)生物標(biāo)記物多核苷酸中的核苷酸個(gè)數(shù)。生物標(biāo)記物多核苷酸的片段將通常編碼至少15、25、30、50、100、150、200或250個(gè)連續(xù)氨基酸，或存在于本發(fā)明的全長(zhǎng)生物標(biāo)記物蛋白中的氨基酸的總數(shù)?！白凅w”旨在表示基本上相似的序列。一般來(lái)講，本發(fā)明的特定生物標(biāo)記物的變體將具有通過(guò)序列比對(duì)程序測(cè)定的與所述生物標(biāo)記物至少約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測(cè)定基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測(cè)定基因表達(dá)的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄或翻譯(即蛋白)水平上檢測(cè)生物標(biāo)記物的表達(dá)水平。

在一些實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)生物標(biāo)記物的表達(dá)水平。利用核酸雜交技術(shù)進(jìn)行具體DNA和RNA測(cè)量的多種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一些方法涉及電泳分離(例如，用于檢測(cè)DNA的Southern印跡和用于檢測(cè)RNA的Northern印跡)，但是也可以在不利用電泳分離的情況下進(jìn)行DNA和RNA的測(cè)量(例如，通過(guò)斑點(diǎn)印跡)。基因組DNA(例如，來(lái)自人)的Southern印跡可用于篩選限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，以檢測(cè)影響本發(fā)明多肽的遺傳病癥的存在?？梢詸z測(cè)所有形式的RNA，包括但不限于信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核糖體RNA(rRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)。

本發(fā)明中的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，這類載體包括(但并不限于)：稀釋劑、賦形劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如干淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨化合物、十二烷基硫酸鈉等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本發(fā)明的藥物組合物可以使用不同的添加劑進(jìn)行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、pH控制劑及表面活性劑。

緩沖劑可以包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、谷氨酸及相應(yīng)的鹽(它們的堿金屬或堿性稀土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽)。等滲劑包括氯化鉀、氯化鈉、糖及甘油。螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及檸檬酸。抑菌劑包括但不限于有效濃度(例如<1％w/v)的芐醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸丙酯。穩(wěn)定劑包括人類血清蛋白、L-氨基酸、糖及纖維素衍生物。L-氨基酸還可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一個(gè)。糖類包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麥芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羥丙基淀粉、硫化軟骨素、透明質(zhì)酸等及它們的衍生物。纖維素衍生物包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素及羥甲基纖維素鈉。表面活性劑包括離子或非離子表面活性劑，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖單酰基酯、脂肪酸甘油酯。

本發(fā)明的藥物還可包括藥學(xué)上可接受的涂層材料包括(但不限于)，快速分解涂層材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散劑。常見(jiàn)快速分解涂層材料包括OPADRY；腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)烯酸聚合物、磷羥丙甲基纖維素苯二甲酸酯、羥丙甲基纖維素乙酸酯、羥丙甲基纖維素琥珀酸酯、羥甲乙基纖維素、乙酰磷苯二甲酸纖維素；增塑劑包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過(guò)吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過(guò)植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無(wú)毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來(lái)調(diào)節(jié)制劑的pH以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術(shù)語(yǔ)非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達(dá)到目標(biāo)組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過(guò)任何途徑給予受體。

本發(fā)明藥物組合物可以以任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對(duì)于口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加入潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無(wú)水玉米淀粉。當(dāng)口服施用水懸浮液和/或乳液時(shí)，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當(dāng)時(shí)，可將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過(guò)在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包埋，也可制備所述制劑已延長(zhǎng)或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的XIRP2蛋白的缺失或不足，通過(guò)提高XIRP2蛋白的表達(dá)或增強(qiáng)XIRP2蛋白的功能，從而治療因XIRP2蛋白減少導(dǎo)致的口腔鱗狀細(xì)胞癌。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過(guò)程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明所述的藥物組合物也可以脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)形式給藥，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可有多種磷脂形成，如膽甾醇、硬脂基胺或磷脂酰膽堿。

本發(fā)明藥物組合物可以局部給藥的藥物組合物，可以配制成軟膏、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。

本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，“探針”通常指能通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。

作為探針，可以使用熒光標(biāo)記、放射標(biāo)記、生物素標(biāo)記等對(duì)癌檢測(cè)用多核苷酸進(jìn)行了標(biāo)記的標(biāo)記探針。多核苷酸的標(biāo)記方法本身是公知的?？赏ㄟ^(guò)如下方法檢查試樣中是否存在受試核酸：固定受試核酸或者其擴(kuò)增物，與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗滌，以及然后測(cè)定與固相結(jié)合的標(biāo)記。備選地，還可固定癌檢測(cè)用多核苷酸，使受試核酸與其雜交，然后應(yīng)用標(biāo)記探針等檢測(cè)結(jié)合于固相上的受試核酸。在這種情況下，結(jié)合于固相上的癌檢測(cè)用多核苷酸也稱為探針。使用多核苷酸探針測(cè)定受試核酸的方法在本領(lǐng)域也是公知的?？梢匀缦逻M(jìn)行該方法：在緩沖液中使多核苷酸探針與受試核酸在Tm或者其附近(優(yōu)選在±4℃以內(nèi))接觸用于雜交，洗滌，然后測(cè)定雜交的標(biāo)記探針或者與固相探針結(jié)合的模板核酸。

在作為探針使用的多核苷酸的大小優(yōu)選為18個(gè)或更多個(gè)核苷酸、更優(yōu)選為20個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及編碼區(qū)域的全長(zhǎng)或更少。作為引物使用時(shí)，該多核苷酸大小優(yōu)選為18個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及50個(gè)或更少核苷酸。

術(shù)語(yǔ)“芯片”也稱為“陣列”，指包含連接的核酸或肽探針的固體支持物。陣列通常包含按照不同的已知位置連接至基底表面的多種不同的核酸或肽探針。這些陣列，也稱為“微陣列”，通?？梢岳脵C(jī)械合成方法或光引導(dǎo)合成方法來(lái)產(chǎn)生這些陣列，所述光引導(dǎo)合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的組合。陣列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝膠、聚合物表面、諸如光纖的纖維、玻璃或任何其它合適的基底上的核酸或肽?？梢砸砸欢ǖ姆绞絹?lái)包裝陣列，從而允許進(jìn)行全功能裝置的診斷或其它方式的操縱。

在本發(fā)明中,術(shù)語(yǔ)“抗體”是指選擇性結(jié)合目標(biāo)抗原的天然或合成抗體。該術(shù)語(yǔ)包括多克隆和單克隆抗體。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及選擇性結(jié)合目標(biāo)抗原的免疫球蛋白分子的人類或人源化形式也包括在術(shù)語(yǔ)“抗體”的范圍內(nèi)，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可?！皢慰寺】贵w”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過(guò)包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。

單克隆抗體還包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可。

多克隆抗體包含對(duì)產(chǎn)生人抗體的動(dòng)物(例如，小鼠)免疫XIRP2蛋白質(zhì)而得的抗體。當(dāng)制備了嵌合抗體或人源化抗體之后，可以將可變區(qū)(例如，F(xiàn)R)和/或恒定區(qū)中的氨基酸用其他氨基酸替換等。

氨基酸的替換例如是小于15個(gè)、小于10個(gè)、8個(gè)以下、7個(gè)以下、6個(gè)以下、5個(gè)以下、4個(gè)以下、3個(gè)以下、或2個(gè)以下的氨基酸、優(yōu)選1～5個(gè)氨基酸、更優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸的替換，替換抗體應(yīng)與未替換抗體在功能上等同。期望替換是保守的氨基酸替換，這是電荷、側(cè)鏈、極性、芳香族性等性質(zhì)類似的氨基酸之間的替換。性質(zhì)類似的氨基酸例如可以分類為堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、無(wú)電荷極性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、無(wú)極性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支鏈氨基酸(亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸)等。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“治療”是指以治愈、改善、穩(wěn)定或預(yù)防疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的對(duì)患者進(jìn)行的醫(yī)學(xué)管理。該術(shù)語(yǔ)包括積極療法，即專門以改善疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的的治療，并且還包括病因治療，即以除去相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥的病因?yàn)槟康牡闹委?。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括姑息治療，即設(shè)計(jì)用于緩解癥狀而非治愈疾病、病理狀態(tài)或病癥的治療；預(yù)防性治療，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥的發(fā)展為目的的治療；以及支持性治療，即用于補(bǔ)充另一種以改善相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的的特定療法的治療。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集6例周圍正常粘膜組織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)，所有患者術(shù)前未接受任何形式的治療。手術(shù)切下的樣本于液氮中凍存，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過(guò)組織倫理委員會(huì)的同意。

2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進(jìn)行操作)

取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，按照試劑盒中的說(shuō)明書提取分離RNA。具體如下：

1)加入Trizol，室溫放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5-10min；

3)12000rpm離心15min，將上層水相移到另一新的離心管中(注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì))，加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10min；

4)12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗滌沉淀(4℃保存)，洗滌沉淀物，振蕩混勻，4℃，12000rpm離心5min；

5)棄去乙醇液體，室溫下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，凍存于-70℃冰箱。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)用Cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

4、雜交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達(dá)譜芯片,每張芯片包括45015個(gè)寡核苷酸，其中有43376個(gè)人基因探針和1639個(gè)實(shí)驗(yàn)控制探針。按芯片使用說(shuō)明書的步驟進(jìn)行，溫度在65℃，經(jīng)17h 10r/min滾動(dòng)雜交，37℃洗片。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用Agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動(dòng)以100％和10％PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動(dòng)合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用Feature Extraction進(jìn)行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Bioconductor程序包進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。

6、結(jié)果

與正常粘膜組織相比，XIRP2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量顯著上調(diào)。

實(shí)施例2 QPCR測(cè)序驗(yàn)證XIRP2基因的差異表達(dá)

1、對(duì)XIRP2基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式選擇正常粘膜組織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織各80例。

2、RNA提取步驟如實(shí)施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

1)反應(yīng)體系：

表1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件進(jìn)行。

42℃60min，99℃2min，5℃5min。

3)聚合酶鏈反應(yīng)

1)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank中XIRP2基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

XIRP2基因：

正向引物為5’-GCAGCCTTATCTACAGTC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物為5’-TCTTCCTTCCTTCCTTCT-3’(SEQ ID NO.4)。

管家基因GAPDH的引物序列為：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)

2)按照表1配制25μl PCR反應(yīng)體系：

表2 PCR反應(yīng)體系

3)PCR反應(yīng)條件：94℃4min，(94℃20s，60℃30s、72℃30s)×30個(gè)循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量，每個(gè)樣進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與正常粘膜組織熒光定量RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與周圍正常粘膜組織相比，XIRP2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例3 XIRP2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113、HN13，正常粘膜上皮細(xì)胞系HIOEC購(gòu)自于上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院。HIOEC的培養(yǎng)基為K-SFM；Tca8113、HN13的培養(yǎng)基為DMEM；以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、細(xì)胞總RNA的提取

1)當(dāng)細(xì)胞達(dá)80-90％融合時(shí)終止培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞于1.5m1EP管中，每管中加入lm1Trizol緩慢搖動(dòng)破碎細(xì)胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去DNA：每個(gè)1.5m1EP管加入0.2ml三氯甲烷，搖晃15s，室溫放置10min。4℃，12000rpm離心15min。

剩余操作步驟同組織中RNA提取過(guò)程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實(shí)施例2.

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常粘膜上皮細(xì)胞相比，XIRP2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113、HN13中表達(dá)均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例4 XIRP2基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、siRNA設(shè)計(jì)

針對(duì)XIRP2基因的siRNA序列：

陰性對(duì)照siRNA序列(siRNA-NC)：

正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.7)，

反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.8)；

siRNA1-XIRP2：

正義鏈為5’-UGUUGAUAUUGGUAUUGAGCA-3’(SEQ ID NO.9)，

反義鏈為5’-CUCAAUACCAAUAUCAACAUC-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA2-XIRP2：

正義鏈為5’-AUAACAUCCUCUUUCUGACAA-3’(SEQ ID NO.11)，

反義鏈為5’-GUCAGAAAGAGGAUGUUAUAG-3’(SEQ ID NO.12)；

將細(xì)胞按4×10⁴/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)24h，在無(wú)雙抗、含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購(gòu)自于Invitrogen公司)的說(shuō)明書轉(zhuǎn)染。

將實(shí)驗(yàn)分為三組：對(duì)照組(Tca8113)、陰性對(duì)照組(siRNA-NC)和實(shí)驗(yàn)組(siRNA1-XIRP2、siRNA2-XIRP2)，其中陰性對(duì)照組siRNA與XIRP2基因的序列無(wú)同源性，濃度為20nM/孔，同時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3、QPCR檢測(cè)XIRP2基因的轉(zhuǎn)錄水平

3.1細(xì)胞總RNA的提取

具體步驟同實(shí)施例3。

3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。

3.3 QPCR擴(kuò)增步驟同實(shí)施例2。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，干擾XIRP2基因表達(dá)組與對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，相比TCA8113、轉(zhuǎn)染空載siRNA-NC、siRNA2-XIRP2組，siRNA1-XIRP2組能夠顯著降低XIRP2基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)施例5 ELISA檢測(cè)Tca8113細(xì)胞中XIRP2的蛋白表達(dá)

應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析法測(cè)定Tca8113細(xì)胞上清中XIRP2蛋白水平。RNA干擾后第六天，分別收集三組Tca8113細(xì)胞的上清液，按照ELISA試劑盒操作流程定量檢測(cè)腫瘤細(xì)胞上清液中XIRP2的濃度。

1、配置濃度為70000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，10倍稀釋后，再進(jìn)行2倍倍比稀釋，共有7個(gè)稀釋度。

2、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?0μl，余孔分別加不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品各50μl。輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)2h。

3、棄去液體，晾干。每孔加200μl VEGF-C結(jié)合物。37℃，120min后，棄去孔內(nèi)液體，晾干，PBS洗板3次。

4、依序每孔加底物溶液200μl，37℃避光顯色30min。

5、依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)。

6、用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。所有標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的OD值均需減去零孔的OD值以得到校正值。

7、計(jì)算樣品的實(shí)際濃度。

8、結(jié)果如下表3所示，siRNA沉默Tca8113細(xì)胞的XIRP2基因，XIRP2的蛋白含量也相應(yīng)降低，說(shuō)明沉默XIRP2基因可以抑制XIRP2基因的表達(dá)。

表3 ELISA檢測(cè)不同組別細(xì)胞中的XIRP2蛋白的表達(dá)

實(shí)施例6 MTT法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞增殖活性

應(yīng)用MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium，甲基噻唑基四唑)法檢測(cè)XIRP2基因沉默后對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖活性的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng)將Tca8113細(xì)胞按1×10³/孔接種于96孔板，每孔100μ1，37℃，5％CO₂孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。

3、MTT檢測(cè)

1)分別于轉(zhuǎn)染1～7天時(shí)，棄掉各孔培養(yǎng)基，加入MTT(5mg/ml)20μl。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h。

2)吸去混合液，每孔加入DMSO 200μl，震蕩10min使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫儀上測(cè)490nm處的光吸收值，記錄結(jié)果。

4、以時(shí)間為橫軸，光吸收值(OD)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

5、結(jié)果：

結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染siRNA1-XIRP2組的細(xì)胞增殖顯著降低。

實(shí)施例7 Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

RNA干擾后第六天收集不同組別的Tca8113細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)液中，使細(xì)胞終濃度為2×10⁶/ml，吸取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室中。應(yīng)用Transwell小室方法觀察XIRP2基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲性的影響。

1、將Matrigel(4μg/μl)放入4℃融化，準(zhǔn)備冰盒(冰浴環(huán)境)。Matrigel用DMEM稀釋8倍后使用。在Transwell小室濾膜(8μm孔徑)的外表面涂8μg人纖粘連蛋白，置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。

2、在6孔Transwell小室濾膜的內(nèi)表面鋪以100μ1/孔的Matrigel膠，37℃、5％CO₂孵箱內(nèi)孵育1h，形成一個(gè)基質(zhì)屏障層備用。

3、在6孔板每孔內(nèi)加入含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液2.5m1。

4、收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)液中，終濃度為2×10⁶/ml。

5、將細(xì)胞懸液加入Transwell小室中，每孔100μ1，將小室浸于6孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃、5％CO₂孵箱內(nèi)孵育24h。

6、將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定1分鐘。

7、HE染色：蘇木精染色3min，水洗；伊紅染色10～30s，水洗。并用棉簽擦掉未穿過(guò)膜的細(xì)胞。

8、顯微鏡下觀察、照相并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，每膜計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)不同視野的透過(guò)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。每組平行設(shè)3個(gè)濾膜。

9、數(shù)據(jù)處理

用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

10、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，Tca8113、siRNA1-XIRP2、siRNA-NC組細(xì)胞在transwell小室中培養(yǎng)24h后，siRNA1-XIRP2組聚碳酸酯膜下室面的細(xì)胞數(shù)顯著減少。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

daSEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120> 口腔鱗狀細(xì)胞癌生物標(biāo)記物及其應(yīng)用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2817

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgttcccaa tgcagaaggg ctccctcaac ctcctgaggc agaaatggga atcttgtgat 60

tatcagagaa gtgagtgtca tcccagggac agccattgta caattttcca gcctcaggaa 120

agcaaattgc ttgcgcctga aggagaggta gtatcagcac ctcaatcttt ggatcccaca 180

agtctgccct acagtacagg ggaagagatg tggagttcga agccggaaga gaaggattct 240

gtggacaaga gtaacaacac cagggaatat ggtcggccag aagtgctgaa ggaggattcc 300

ctgagcagtc ggcgcaggat tgaacgcttt tccattgccc ttgatgagct gaggagtgtg 360

tttgaggctc ctaagagtgg aaacaaacca gctgagtacg gtggaaagga agtggaaatt 420

gagcgaagtt tgtgctcgcc agcttttaag agtcaccctg ggagccagct ggaggattct 480

gtgaaagatt cagacaagaa aggcaaggaa acatcttttg acaagatgtc acctgaaagt 540

ggtcacagcc gcatctttga agcgactgct ggccctaata agcctgagag tggatttgca 600

gaagacagtg ctgctcgggg cgagggtgtg tcagacctcc acgaagtggt ctccctgaag 660

gagcggatgg cgaggtacca ggcagctgtt tccaggggtg actgccgcag cttctctgct 720

aatatgatgg aagaatcaga aatgtgcgca gtgcctggtg gtttggccaa ggtgaagaaa 780

caatttgagg acgaaattac ttcttcccgt aatacctttg ctcaatacca atatcaacat 840

cagaacagat ctgagcagga ggcaattcat agcagccagg ttggcacttc aagaagcagc 900

caggaaatgg caagaaatga acaagaaggg tccaaagtac agaaaattga tgttcatgga 960

acagaaatgg tctctcatct tgaaaagcac accgaggaag taaaccaagc atctcagttt 1020

catcaatatg ttcaagaaac tgtcattgat acacctgagg atgaagagat tccaaaggtt 1080

tcgactaagt tgttaaaaga gcagtttgaa aagtctgccc aggaaaagat cctttattct 1140

gacaaagaga tgacaacccc agccaagcag attaagaagc tgctgctcca agacaaggaa 1200

atatgtatac tttgtcaaaa gacagtttat ccaatggagt gcctagtggc agacaagcag 1260

aattttcata agtcctgctt ccgatgccac cattgcaaca gtaaactaag tttgggaaat 1320

tatgcatcac ttcatggaca aatatactgt aaacctcact ttaaacaact tttcaaatcc 1380

aaaggaaatt atgatgaagg ttttggacat aagcagcata aagatagatg gaactgcaaa 1440

aaccaaagca gatcagtgga ctttattcct aatgaagaac caaatatgtg taaaaatatt 1500

gcagaaaaca cccttgtacc tggagatcgt aatgaacatt tagatgctgg taacagtgaa 1560

gggcaaagga atgatttgag aaaattaggg gaaaggggaa aattaaaagt catttggcct 1620

ccttccaagg agatccctaa gaaaacctta ccctttgagg aagagctcaa aatgagtaaa 1680

cctaagtggc cacctgaaat gacaaccctg ctatcccctg aatttaaaag tgaatctctg 1740

ctagaagatg ttagaactcc agaaaataaa ggacaaagac aagatcactt tccatttttg 1800

cagccttatc tacagtccac ccatgtttgt cagaaagagg atgttatagg aatcaaagaa 1860

atgaaaatgc ctgaaggaag aaaagatgaa aagaaggaag gaaggaagaa tgtgcaagat 1920

aggccgagtg aagctgaaga cacaaagagt aacaggaaaa gtgctatgga tcttaatgac 1980

aacaataatg tgattgtgca gagtgctgaa aaggagaaaa atgaaaaaac taaccaaact 2040

aatggtgcag aagttttaca ggttactaac actgatgatg agatgatgcc agaaaatcat 2100

aaagaaaatt tgaataagaa taataataac aattatgtag cagtctcata tctgaataat 2160

tgcaggcaga agacatctat tttagaattt cttgatctat tacccttgtc gagtgaagca 2220

aatgacactg caaatgaata tgaaattgag aagttagaaa atacatctag aatctcagag 2280

ttacttggta tatttgaatc tgaaaagact tattcgagga atgtactagc aatggctctg 2340

aagaaacaga ctgacagagc agctgctggc agtcctgtgc agcctgctcc aaaaccaagc 2400

ctcagcagag gccttatggt aaagggggga agttcaatca tctctcctga tacaaatctc 2460

ttaaacatta aaggaagcca ttcaaagagc aaaaatttac actttttctt ttctaacacc 2520

gtgaaaatca ctgcattttc caagaaaaat gagaacattt tcaattgtga tttaatagat 2580

tctgtagatc aaattaaaaa tatgccatgc ttggatttaa gggaatttgg aaaggatgtt 2640

aaaccttggc atgttgaaac aacagaagct gcccgcaata atgaaaacac aggttttgat 2700

gctctgagcc atgaatgtac agctaagcct ttgtttccca gagtggaggt gcagtcagaa 2760

caactcacgg tggaagagca gattaaaaga aacaggtgct acagtgacac tgagtaa 2817

<210> 2

<211> 938

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Phe Pro Met Gln Lys Gly Ser Leu Asn Leu Leu Arg Gln Lys Trp

1 5 10 15

Glu Ser Cys Asp Tyr Gln Arg Ser Glu Cys His Pro Arg Asp Ser His

20 25 30

Cys Thr Ile Phe Gln Pro Gln Glu Ser Lys Leu Leu Ala Pro Glu Gly

35 40 45

Glu Val Val Ser Ala Pro Gln Ser Leu Asp Pro Thr Ser Leu Pro Tyr

50 55 60

Ser Thr Gly Glu Glu Met Trp Ser Ser Lys Pro Glu Glu Lys Asp Ser

65 70 75 80

Val Asp Lys Ser Asn Asn Thr Arg Glu Tyr Gly Arg Pro Glu Val Leu

85 90 95

Lys Glu Asp Ser Leu Ser Ser Arg Arg Arg Ile Glu Arg Phe Ser Ile

100 105 110

Ala Leu Asp Glu Leu Arg Ser Val Phe Glu Ala Pro Lys Ser Gly Asn

115 120 125

Lys Pro Ala Glu Tyr Gly Gly Lys Glu Val Glu Ile Glu Arg Ser Leu

130 135 140

Cys Ser Pro Ala Phe Lys Ser His Pro Gly Ser Gln Leu Glu Asp Ser

145 150 155 160

Val Lys Asp Ser Asp Lys Lys Gly Lys Glu Thr Ser Phe Asp Lys Met

165 170 175

Ser Pro Glu Ser Gly His Ser Arg Ile Phe Glu Ala Thr Ala Gly Pro

180 185 190

Asn Lys Pro Glu Ser Gly Phe Ala Glu Asp Ser Ala Ala Arg Gly Glu

195 200 205

Gly Val Ser Asp Leu His Glu Val Val Ser Leu Lys Glu Arg Met Ala

210 215 220

Arg Tyr Gln Ala Ala Val Ser Arg Gly Asp Cys Arg Ser Phe Ser Ala

225 230 235 240

Asn Met Met Glu Glu Ser Glu Met Cys Ala Val Pro Gly Gly Leu Ala

245 250 255

Lys Val Lys Lys Gln Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ser Ser Arg Asn Thr

260 265 270

Phe Ala Gln Tyr Gln Tyr Gln His Gln Asn Arg Ser Glu Gln Glu Ala

275 280 285

Ile His Ser Ser Gln Val Gly Thr Ser Arg Ser Ser Gln Glu Met Ala

290 295 300

Arg Asn Glu Gln Glu Gly Ser Lys Val Gln Lys Ile Asp Val His Gly

305 310 315 320

Thr Glu Met Val Ser His Leu Glu Lys His Thr Glu Glu Val Asn Gln

325 330 335

Ala Ser Gln Phe His Gln Tyr Val Gln Glu Thr Val Ile Asp Thr Pro

340 345 350

Glu Asp Glu Glu Ile Pro Lys Val Ser Thr Lys Leu Leu Lys Glu Gln

355 360 365

Phe Glu Lys Ser Ala Gln Glu Lys Ile Leu Tyr Ser Asp Lys Glu Met

370 375 380

Thr Thr Pro Ala Lys Gln Ile Lys Lys Leu Leu Leu Gln Asp Lys Glu

385 390 395 400

Ile Cys Ile Leu Cys Gln Lys Thr Val Tyr Pro Met Glu Cys Leu Val

405 410 415

Ala Asp Lys Gln Asn Phe His Lys Ser Cys Phe Arg Cys His His Cys

420 425 430

Asn Ser Lys Leu Ser Leu Gly Asn Tyr Ala Ser Leu His Gly Gln Ile

435 440 445

Tyr Cys Lys Pro His Phe Lys Gln Leu Phe Lys Ser Lys Gly Asn Tyr

450 455 460

Asp Glu Gly Phe Gly His Lys Gln His Lys Asp Arg Trp Asn Cys Lys

465 470 475 480

Asn Gln Ser Arg Ser Val Asp Phe Ile Pro Asn Glu Glu Pro Asn Met

485 490 495

Cys Lys Asn Ile Ala Glu Asn Thr Leu Val Pro Gly Asp Arg Asn Glu

500 505 510

His Leu Asp Ala Gly Asn Ser Glu Gly Gln Arg Asn Asp Leu Arg Lys

515 520 525

Leu Gly Glu Arg Gly Lys Leu Lys Val Ile Trp Pro Pro Ser Lys Glu

530 535 540

Ile Pro Lys Lys Thr Leu Pro Phe Glu Glu Glu Leu Lys Met Ser Lys

545 550 555 560

Pro Lys Trp Pro Pro Glu Met Thr Thr Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys

565 570 575

Ser Glu Ser Leu Leu Glu Asp Val Arg Thr Pro Glu Asn Lys Gly Gln

580 585 590

Arg Gln Asp His Phe Pro Phe Leu Gln Pro Tyr Leu Gln Ser Thr His

595 600 605

Val Cys Gln Lys Glu Asp Val Ile Gly Ile Lys Glu Met Lys Met Pro

610 615 620

Glu Gly Arg Lys Asp Glu Lys Lys Glu Gly Arg Lys Asn Val Gln Asp

625 630 635 640

Arg Pro Ser Glu Ala Glu Asp Thr Lys Ser Asn Arg Lys Ser Ala Met

645 650 655

Asp Leu Asn Asp Asn Asn Asn Val Ile Val Gln Ser Ala Glu Lys Glu

660 665 670

Lys Asn Glu Lys Thr Asn Gln Thr Asn Gly Ala Glu Val Leu Gln Val

675 680 685

Thr Asn Thr Asp Asp Glu Met Met Pro Glu Asn His Lys Glu Asn Leu

690 695 700

Asn Lys Asn Asn Asn Asn Asn Tyr Val Ala Val Ser Tyr Leu Asn Asn

705 710 715 720

Cys Arg Gln Lys Thr Ser Ile Leu Glu Phe Leu Asp Leu Leu Pro Leu

725 730 735

Ser Ser Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Glu Tyr Glu Ile Glu Lys Leu

740 745 750

Glu Asn Thr Ser Arg Ile Ser Glu Leu Leu Gly Ile Phe Glu Ser Glu

755 760 765

Lys Thr Tyr Ser Arg Asn Val Leu Ala Met Ala Leu Lys Lys Gln Thr

770 775 780

Asp Arg Ala Ala Ala Gly Ser Pro Val Gln Pro Ala Pro Lys Pro Ser

785 790 795 800

Leu Ser Arg Gly Leu Met Val Lys Gly Gly Ser Ser Ile Ile Ser Pro

805 810 815

Asp Thr Asn Leu Leu Asn Ile Lys Gly Ser His Ser Lys Ser Lys Asn

820 825 830

Leu His Phe Phe Phe Ser Asn Thr Val Lys Ile Thr Ala Phe Ser Lys

835 840 845

Lys Asn Glu Asn Ile Phe Asn Cys Asp Leu Ile Asp Ser Val Asp Gln

850 855 860

Ile Lys Asn Met Pro Cys Leu Asp Leu Arg Glu Phe Gly Lys Asp Val

865 870 875 880

Lys Pro Trp His Val Glu Thr Thr Glu Ala Ala Arg Asn Asn Glu Asn

885 890 895

Thr Gly Phe Asp Ala Leu Ser His Glu Cys Thr Ala Lys Pro Leu Phe

900 905 910

Pro Arg Val Glu Val Gln Ser Glu Gln Leu Thr Val Glu Glu Gln Ile

915 920 925

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcagccttat ctacagtc 18

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttccttcc ttccttct 18

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

uguugauauu gguauugagc a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

cucaauacca auaucaacau c 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

auaacauccu cuuucugaca a 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

gucagaaaga ggauguuaua g 21