本發(fā)明涉及一種用于檢測棕櫚疫霉菌的引物對及其檢測方法，屬于作物病害檢測、鑒定及防治技術領域。

背景技術：

棕櫚疫霉菌（Phytophthora palmivora）屬于卵菌門(Oomycota)、卵菌綱(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉屬(Phytophthora)。棕櫚疫霉菌是農業(yè)生產上的一種危害極為嚴重的病原菌。棕櫚疫霉菌寄主范圍十分廣泛，能侵染包括果樹、林木、花卉等在內的百余種植物，其可侵染植物根、莖、葉、花及果實等各個部位，在氣候潮濕的條件下發(fā)病更為嚴重。由其侵染引起的植物病害分布廣泛，常給農業(yè)作物（如菠蘿、番木瓜、榴蓮、木薯和橡膠樹等）造成重大損失，如由棕櫚疫霉菌侵染引起的榴蓮根莖腐爛病是一種危害榴蓮生產的重要病害，嚴重年份果園發(fā)病達70%，其中果實上的發(fā)病率達40%-50%，受棕櫚疫霉侵染的榴蓮果實果皮變褐，果肉顏色呈深黃色，香味變淡，食用性降低。目前對棕櫚疫霉菌引起的病害還沒有快速有效的防治措施，控制該病菌病害最有效的途徑就是加強檢疫，防止病原菌的傳播和阻礙其擴散方式。新西蘭和澳大利亞曾分別對泰國榴蓮進行風險評估，新西蘭將榴蓮上的棕櫚疫霉列為控制性有害生物，澳大利亞把榴蓮上的棕櫚疫霉視為有風險的潛在有害生物。在我國，棕櫚疫霉雖然未列入檢疫性有害生物名錄，但在引進種子、苗木檢疫中，棕櫚疫霉往往被列為禁止攜帶的有害生物。所以建立棕櫚疫霉菌的快速分子檢測技術對于保護我國農林業(yè)生產的安全及棕櫚疫霉菌病害的早期控制具有重要意義。

棕櫚疫霉菌傳統(tǒng)的檢測方法是采用選擇性培養(yǎng)基從土壤、植物組織或水體中分離菌株，再對這些菌株的形態(tài)等進行鑒定，來確定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助顯微鏡技術對發(fā)病癥狀進行判定。傳統(tǒng)的檢測方法不僅費時、準確度低，而且要求檢測人員要有豐富的經驗，最重要一點是易遺漏潛育期或隱癥的病害，以致延誤病害的防治，導致病害的暴發(fā)，因此傳統(tǒng)病原學檢測方法已不能滿足現(xiàn)代植物病理學研究的需要。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，應用PCR技術對病原菌進行特異、靈敏的快速分子檢測的成功例子已越來越多。國內外研究人員主要利用rDNA/ITS序列設計特異引物來對植物病原菌進行快速檢測、鑒定。然而疫霉屬卵菌的分子檢測技術研究結果表明，rDNA/ITS在疫霉屬的近緣種之間變化很小，從ITS序列上設計引物很難將兩個相似度高的種區(qū)分開；因此要對疫霉屬病原菌進行高靈敏性和特異性檢測，應從疫霉菌其它基因上設計引物進行檢測。已有研究表明，疫霉屬中Ras 家族相關的Ypt1編碼基因含有多個外顯子和內含子，外顯子具有保守性，而這些內含子在不同種之間具有多變性，非常適合于設計引物進行疫霉屬卵菌近緣種的特異性分子檢測、鑒定。目前尚無針對Ypt1基因設計的特異性引物檢測棕櫚疫霉菌的報道。

本發(fā)明根據(jù)棕櫚疫霉菌Ypt1基因序列信息設計特異引物，不僅能特異鑒定該病原菌，而且可直接用于發(fā)病組織和土壤中病菌的檢測，這將對棕櫚疫霉菌病害的早期診斷具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中對棕櫚疫霉菌檢測和鑒定主要基于形態(tài)學特征，方法耗時長、程序繁瑣、經驗性強、準確度低，難以做到對病害發(fā)生的及時監(jiān)測和控制病原菌的傳播、流行的問題，以及現(xiàn)有分子檢測中rDNA-ITS序列差異很小，以ITS為靶標設計的引物難以將一些近緣種的病原菌區(qū)分開的技術缺欠，提供了棕櫚疫霉菌特異性PCR檢測引物對及其檢測方法；利用本發(fā)明所述的PCR檢測引物對和檢測方法檢測棕櫚疫霉菌準確性高、特異性強、靈敏度高、易于操作、檢測時間短且結果可靠。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

1. 通過測定棕櫚疫霉菌（Phytophthora palmivora）和其它疫霉菌（Phytophthora spp）的Ypt1基因序列，對疫霉屬不同種間Ypt1基因序列進行比對分析，設計出一種用于檢測棕櫚疫霉菌的引物對，該引物對特異性強，其核苷酸序列為：

上游引物PPF：5'- GCAAAAGTGTTGATGGTTTGG -3'，

下游引物PPR：5'- CTTGACTAGGAACGCCTGGA -3'；

該引物對的擴增產物大小約為220bp。

2. 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述引物對檢測棕櫚疫霉菌檢測的方法，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品基因組DNA。

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用CTAB 法提取基因組DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉于1.5mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【注：CTAB，SDS需60℃預熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩沖液中），12000 r·min^-1離心15 min；取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇（25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min^-1離心9 min；取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1離心5 min；取上清液350 μL，加入1/10體積3 mol·L^-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1離心5 min；棄去上清液，加入700μL 冰70%乙醇進行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超凈工作臺上晾干無酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計檢測 DNA 濃度并稀釋至100 ng/μL待用。

用于檢測植物組織中存在棕櫚疫霉菌時，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10μL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊后轉入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μl加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 μL作為PCR模板進行擴增；

用于檢測土壤樣品中存在棕櫚疫霉菌時，采用土壤DNA提取試劑盒，提取DNA。

（2）PCR擴增反應：以步驟（1）提取的DNA為模板，利用PPF/PPR這一對引物進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，10 μmol/L的PPF/PPR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補足至25 μL；擴增參數(shù)為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

（3）電泳檢測：取步驟（2）的PCR擴增產物5.0 μL用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，4-5V/cm，電泳40min后經溴化乙錠染色于紫外燈下觀察，根據(jù)擴增產物的有無及其片段大小對結果進行判斷，如果能特異性地擴增出約220bp的產物，即可判斷所述的檢測樣品中存在棕櫚疫霉菌，否則所述的檢測樣品中未存在該菌。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下的技術優(yōu)勢和有益效果：

1.特異性強、準確性高：本發(fā)明能準確地檢測、鑒定出棕櫚疫霉菌，只有棕櫚疫霉菌的菌株能擴增出大小約為220bp的條帶，而其它菌株均擴增不出條帶；說明本發(fā)明的引物對具有很強的特異性。使用本發(fā)明的檢測方法對不同地理來源的棕櫚疫霉菌和攜帶棕櫚疫霉菌的植物組織和土壤進行了測試驗證，只有棕櫚疫霉菌和攜帶該病菌的樣品能特異性地擴增出一條220bp的電泳條帶，說明本發(fā)明所設計的引物對能準確診斷出棕櫚疫霉菌。

2.重復性好、靈敏度高：多次試驗證實本發(fā)明具有很好的重復性，目標物DNA只需要100 pg/μL，就可以檢測、鑒定出棕櫚疫霉菌；

3.操作簡便、快速：應用本發(fā)明方法，對待測樣品基因組DNA進行提取、PCR擴增和常規(guī)的瓊脂糖電泳后即可判定結果，整個檢測過程采用DNA快速提取方法，操作簡單，無需對病原菌進行分離培養(yǎng)，大大縮短了檢測時間，一般整個檢測過程可在6小時內完成。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述引物對的特異PCR擴增電泳圖，圖中：泳道M為2000bp Marker，泳道1-3為棕櫚疫霉菌，泳道4-8分別為辣椒疫霉菌、晚疫病菌、大豆疫霉菌、芋疫霉菌和豇豆疫霉菌，泳道9為陰性對照；

圖2為本發(fā)明引物對的靈敏性檢測擴增電泳圖，圖中泳道M為2000bp Marker，泳道1為100 ng，泳道2為10 ng，泳道3為1 ng，泳道4為100 pg，泳道5為10 pg，泳道6為1 pg，泳道7為100 fg，泳道8為10 fg，泳道9為1 fg，泳道10-11為陰性對照，泳道12為陽性對照；

圖3為本發(fā)明檢測方法對番木瓜果實組織和土壤樣品中棕櫚疫霉菌檢測結果電泳圖，圖中泳道M為2000bp Marker，泳道1為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3為健康番木瓜果實，泳道4為人工接種發(fā)病的番木瓜果實，泳道5為高壓滅菌土壤，泳道6-7為攜帶棕櫚疫霉菌的土壤。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述， 但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例均按照常規(guī)實驗條件，或已發(fā)表相關文獻中所述的操作技術規(guī)程，或按照廠商所建議的實驗條件。

實施例 1：棕櫚疫霉菌PCR檢測引物對的設計及引物對的特異性驗證

1.棕櫚疫霉菌基因組DNA的提取

采用CTAB 法提取不同地區(qū)來源的棕櫚疫霉菌基因組 DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【注：CTAB，SDS需60℃預熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩沖液中），12000 r·min^-1離心15 min；取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇（25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min^-1離心9 min；取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1離心5 min；取上清液350 μL，加入1/10體積3 mol·L^-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1離心5 min；棄去上清液，加入700μL 冰70%乙醇進行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超凈工作臺上晾干無酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計檢測 DNA 濃度并稀釋至100 ng/μL待用。

2.棕櫚疫霉菌檢測靶標Ypt1基因擴增及測序

以Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）對供試棕櫚疫霉菌（P. palmivora）的Ypt1基因進行擴增，PCR反應體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的ph1F / Yph2R引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補足至25 μL。擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將PCR擴增產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

3.棕櫚疫霉菌檢測特異引物對的設計

將測序得到的棕櫚疫霉菌（P. palmivora）的Ypt1基因序列與GenBank中疫霉屬18個不同種的Ypt1基因序列進行同源性比較分析，根據(jù)棕櫚疫霉菌與其它種間的差異位點（在BioEdit中比對），用Primer Primer5軟件設計了棕櫚疫霉菌（P. palmivora）的特異性引物，上游引物PPF：5'- GCAAAAGTGTTGAT- GGTTTGG -3'，下游引物PPR：5'- CTTGACTAGGAACGCCTGGA -3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

4.棕櫚疫霉菌PCR檢測方法的建立及引物特異性PCR驗證

在已設計特異引物對的基礎上，通過PCR反應體系和擴增參數(shù)的優(yōu)化，建立的棕櫚疫霉菌PCR檢測方法，PCR反應體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PPF/PPR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補足至25 μL。擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性1 min、60℃退火45 s、72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。以供試的棕櫚疫霉菌及其它病原菌的基因組DNA為模板，采用已建立好的棕櫚疫霉菌PCR檢測擴增體系和擴增程序對棕櫚疫霉菌引物對PPF/PPR進行特異性檢驗。取5 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖電泳檢測，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)DNA條帶的有無及大小對棕櫚疫霉菌引物對的特異性進行驗證。

5.引物特異性驗證結果

PCR擴增結果表明，引物PPF/PPR可特異性地從供試的棕櫚疫霉菌基因組DNA中擴增出大小約為220bp的條帶（圖1），而其它病原菌及陰性對照均無擴增條帶。說明該對引物可以將棕櫚疫霉菌與其它病原菌區(qū)分開來，具有種的特異性，可用于棕櫚疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。

實施例2：棕櫚疫霉菌引物對靈敏度檢測

用無菌超純水對棕櫚疫霉菌基因組DNA進行稀釋，配制成10倍數(shù)量級的系列濃度備用。使用本發(fā)明所述引物對PPF/PPR對不同系列濃度的基因組DNA進行PCR擴增，評估該引物對的靈敏性，擴增反應體系和反應程序如下：PCR反應體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PPF/PPR引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，用無菌超純水補足至25 μL。擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

檢測靈敏度結果表明，當以本發(fā)明所述引物PPF/PPR進行常規(guī)PCR擴增時，反應靈敏度可以達到100pg（圖2），說明本發(fā)明引物對具有較高的靈敏度。

實施例3：番木瓜果實發(fā)病組織中棕櫚疫霉菌的檢測

人工接種發(fā)病組織的獲得：將番木瓜（品種：臺農雜交5號）果實用70%的乙醇表面消毒，果實表面用無菌打孔器（Φ5mm）打深約5mm的孔，每孔內接種一塊直徑5mm、厚約2mm的棕櫚疫霉菌絲塊，用無菌濕棉團覆蓋接種處。接種的果實置于25℃下保濕，待果實發(fā)病后，取發(fā)病組織備用。

發(fā)病果實組織基因組DNA的提?。翰捎肗aOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10μL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊后轉入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μl加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 μL作為PCR模板進行擴增。

PCR擴增檢測：利用本發(fā)明所述引物PPF/PPR進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PPF/PPR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補足至25 μL；擴增參數(shù)為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

檢測結果：取PCR擴增產物5.0 μL用1.5%瓊脂糖電泳分離，電壓為4-5V/cm，電泳結束經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴增產物的有無及其片段大小對結果進行判斷，如果能特異性地擴增出約220bp的產物，即可判斷發(fā)病組織中帶有棕櫚疫霉菌。檢測結果（圖3）表明，人工接種發(fā)病的果實中可檢測出棕櫚疫霉菌，而健康組織及陰性對照則無特異性條帶出現(xiàn)，說明該套技術能用于植物組織中棕櫚疫霉菌的快速分子檢測。

實施例4：土壤中棕櫚疫霉菌的檢測

攜帶棕櫚疫霉菌土壤的制備：將供試的棕櫚疫霉菌菌株培養(yǎng)于黑麥培養(yǎng)基平板上，待菌絲長滿平板后，用適量的無菌水將平板中的菌絲及孢子囊洗下，雙層紗布過濾去除菌絲，得到的濾液為棕櫚疫霉菌孢子囊懸浮液，將孢子囊懸浮液與適量土壤混合，混合后的土壤在室溫下風干，得到攜帶棕櫚疫霉菌土壤。

帶菌土壤基因組DNA的提?。翰捎肧igma公司的土壤DNA提取試劑盒（Sigma,DNB100,Soil DNA Isolation Kit）提取土壤中的總DNA，取1.0 μL作為PCR模板進行擴增。

PCR擴增檢測：利用本發(fā)明所述引物對PPF/PPR進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5μL，10 μmol/L的PPF/PPR引物各1.0μL，DNA 模板1.0μL，用無菌超純水補足至25 μL；擴增參數(shù)為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

檢測結果：取PCR擴增產物5.0 μL用1.5%瓊脂糖電泳分離，電壓為4-5V/cm，電泳結束經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴增產物的有無及其片段大小對結果進行判斷，如果能特異性地擴增出約220bp的產物，即可判斷土壤樣品中存在棕櫚疫霉菌。檢測結果（圖3）表明，攜帶棕櫚疫霉菌的土壤中均可檢測出該菌，而高壓滅菌的土壤及陰性對照則無特異性條帶出現(xiàn)，說明該套技術能用于土壤中棕櫚疫霉菌的快速分子檢測。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農業(yè)科學院植物保護研究所

<120> 一種用于檢測棕櫚疫霉菌的引物對及其檢測方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> PPF

<400> 1

gcaaaagtgt tgatggtttg g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> PPR

<400> 2

cttgactagg aacgcctgga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> ph1F

<400> 3

cgaccattgg cgtggacttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Yph2R

<400> 4

acgttctcgc aggcgtatct 20