本發(fā)明涉及一種基于數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒及其檢測(cè)方法,
屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，適用于在動(dòng)物弓形蟲(chóng)病早期診斷和防疫中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
弓形蟲(chóng)病(Toxoplasmosis)是由弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）引起的一種人獸共患寄生蟲(chóng)病。該病呈全球性分布。犬、貓、豬、牛、羊、兔等家畜感染弓形蟲(chóng)非常普遍，其感染率高達(dá)10%～47.3%，不僅造成家畜流產(chǎn)，影響畜牧業(yè)生產(chǎn)，而且成為人類(lèi)弓形蟲(chóng)病的主要傳染源。人類(lèi)弓形蟲(chóng)感染率一般為20%～50%，最高達(dá)94%，全球約有1/3的人感染弓形蟲(chóng)，我國(guó)人群弓形蟲(chóng)感染率為5%～20%。弓形蟲(chóng)在某些情況下可引起嚴(yán)重的疾病，如孕婦感染弓形蟲(chóng)可影響胎兒的發(fā)育，產(chǎn)畸形胎、木乃伊胎甚至死胎等，同時(shí)可使孕婦流產(chǎn)或早產(chǎn)；對(duì)于艾滋病等免疫抑制或免疫缺陷的病人，弓形蟲(chóng)更是一個(gè)主要的機(jī)會(huì)性致病因素。據(jù)報(bào)道，孕婦感染弓形蟲(chóng)后有30%～46%的機(jī)率從母親傳播給胎兒，引起胎兒先天性感染，造成流產(chǎn)、死胎或先天性弓形蟲(chóng)病；有6%～10%的艾滋病患者并發(fā)弓形蟲(chóng)病，而艾滋病病人所患腦炎中有50%是由弓形蟲(chóng)感染所引起的。據(jù)調(diào)查，孕產(chǎn)婦和腫瘤患者弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率高達(dá)10%～60%。因此，弓形蟲(chóng)病已成為我國(guó)亟待解決的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。
由于弓形蟲(chóng)病臨床上缺乏特異性表現(xiàn)，導(dǎo)致特異性檢測(cè)方法的建立對(duì)于弓形蟲(chóng)病的防控起重要作用，弓形蟲(chóng)檢測(cè)的一般方法可分為病原學(xué)檢測(cè)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法和血清學(xué)檢測(cè)方法。病原學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用簡(jiǎn)單，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，檢出率低，敏感和特異性不高，易漏診。分子生物學(xué)技術(shù)具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，其中，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一項(xiàng)高效、敏感、特異的快速診斷技術(shù)，已被應(yīng)用于弓形蟲(chóng)病的檢測(cè)，近年來(lái)還發(fā)展了巢式PCR、多重PCR等，但此類(lèi)檢測(cè)方法屬于定性檢測(cè)方法，且易因污染導(dǎo)致假陽(yáng)性。血清學(xué)檢測(cè)方法是診斷弓形蟲(chóng)感染普遍的方法，主要有染色試驗(yàn)（DT）、凝集試驗(yàn)（AT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique）等。其中，染色試驗(yàn)對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員危險(xiǎn)性很大，應(yīng)用范圍存在限制性；凝集試驗(yàn)測(cè)試方法簡(jiǎn)單，具有較高的特異性、靈敏度和重現(xiàn)性，尤其是間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）與改良凝集試驗(yàn)（MAT）效果最佳，但是檢測(cè)費(fèi)時(shí)且費(fèi)用較高；膠體金快速診斷技術(shù)雖然具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高度特異性和敏感性，但目前只適用于弓形蟲(chóng)早期的檢測(cè)和診斷，且價(jià)格較高；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等的優(yōu)點(diǎn)，目前已有多種試劑盒應(yīng)用于弓形蟲(chóng)病的診斷，但因不同試劑盒采取的抗原不同且抗原純度不高而導(dǎo)致檢測(cè)的敏感性、特異性和重復(fù)性仍不夠理想，價(jià)格也較高。
數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)是近年來(lái)引起重視并迅速發(fā)展起來(lái)的一種突破性的定量分析技術(shù)。1992年Sykes等利用樣品的有限稀釋獲得單個(gè)模板分子,通過(guò)計(jì)算PCR后的擴(kuò)增信號(hào),以期準(zhǔn)確地確定起始分子的數(shù)量,雖沒(méi)有明確提出“數(shù)字PCR”概念,但已經(jīng)建立了數(shù)字PCR的基本實(shí)驗(yàn)流程,這是數(shù)字PCR的雛形。Bio-Rad公司的QX200系統(tǒng)核心的微滴化技術(shù)能夠?qū)⒁环輼悠贩殖?0 ,000個(gè)納升級(jí)的微滴，本質(zhì)上將傳統(tǒng)定量PCR的一個(gè)test變成20 ,000個(gè)test，大大提高了核酸序列檢測(cè)的靈敏度和精準(zhǔn)度，是對(duì)“無(wú)限稀釋”這一概念的完美演繹，其方法原理可稱(chēng)為微滴式數(shù)字化P CR( Droplet Digital PCR，ddPCR )。該技術(shù)先將核酸模板進(jìn)行稀釋,分配到大量獨(dú)立的反應(yīng)單元中,使每個(gè)反應(yīng)單元中只有單個(gè)模板分子,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)室的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,來(lái)定量DNA 拷貝數(shù)。數(shù)字PCR 采用先擴(kuò)增后定量,因此不依賴(lài)擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值(Ct),也無(wú)需采用內(nèi)參基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線,準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好,可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)都因受到背景DNA或雜質(zhì)的干擾，使得檢測(cè)靈敏度及精確性都達(dá)不到精準(zhǔn)定量的要求，而數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)微滴化處理，使得稀有檢測(cè)片段從大量的復(fù)雜背景中分離出來(lái)，從而提高檢測(cè)的靈敏度和精確性。由于其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì),已經(jīng)在臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、環(huán)境微生物檢測(cè)和下一代測(cè)序等研究領(lǐng)域顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種基于數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒及其檢測(cè)方法，其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高準(zhǔn)確度和精確度，可實(shí)現(xiàn)精確定量的數(shù)字PCR 檢測(cè)方法和數(shù)字PCR 檢測(cè)試劑盒，用于弓形蟲(chóng)的快速精確檢測(cè)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種基于數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒，由微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑和若干個(gè)微滴發(fā)生卡組裝而成，其特征在于：微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑包括以下試劑 ：
溶液A：ddPCR預(yù)混液一支，0.9mL,其中包含500μL的2×ddPCR Supermix for Probes，上/下游引物分別為90μL(濃度為10μM)，特異性探針為30μL(濃度為10μM)，ddH2O 190μL ；
溶液B：微滴發(fā)生油一支，7mL；
溶液C：質(zhì)控液一支，3.5mL；
溶液D：陽(yáng)性對(duì)照模板一支，40μL；
溶液F：ddH2O一支，1mL；
使用基因組DNA為陽(yáng)性模板，使用0.01MpH8.0的Tris-EDTA緩沖液稀釋后冷凍保存；陽(yáng)性對(duì)照制劑按400μL定量分裝；使用ddH2O為陰性對(duì)照；
所述上、下游引物的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示 ；特異探針的序列如 SEQ ID NO:3 所示。
在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明繼續(xù)提供一種弓形蟲(chóng)微滴數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒，采用所述的試劑盒進(jìn)行微滴數(shù)字 PCR 定量檢測(cè)；具體包括步驟 ：
(1)制備ddPCR反應(yīng)液，總體積20μL，向擴(kuò)增管中加入下列反應(yīng)物：溶液A：18μL；模板：2μL；陰性對(duì)照：以ddH2O代替模板，同樣條件下擴(kuò)增；
(2)取微滴發(fā)生卡置于卡托中固定，用8道可調(diào)移液器將20μL反應(yīng)液加入到微滴發(fā)生卡中間一排的8個(gè)孔內(nèi)，不足8個(gè)樣品時(shí)用20μL溶液C補(bǔ)足；
(3)在微滴發(fā)生卡最底下一排8個(gè)孔中各加入70μL溶液B，不能有空著的孔；蓋上膠墊密封；
(4)將帶有卡托的微滴發(fā)生卡輕且平穩(wěn)的放置于微滴生成儀中，開(kāi)始生成微滴；
(5)微滴生成于微滴發(fā)生卡最上面一排孔內(nèi)，緩慢吸取40μL，再打入96孔板相應(yīng)位置孔內(nèi)；
(6)在96孔PCR儀內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，升降溫速度為2.5℃/sec；
(7)將完成PCR的96孔板放入plate holder中組裝好，之后輕且平穩(wěn)的放入微滴讀取儀中；
(8)打開(kāi)QuantaSoft軟件進(jìn)行檢測(cè)和定量分析。
所述程序(2)中使用8道可調(diào)移液器加樣時(shí)，槍頭接近孔一側(cè)底部，與側(cè)壁呈大約15°角，緩慢打出液體，打出一部分后慢慢提升槍頭再打出剩余液體，不要將槍按至超過(guò)第一檔位置以免引入氣泡。所述程序(5)中使用8道可調(diào)移液器加樣時(shí)，槍頭接近微滴發(fā)生卡底部，緩慢吸出液體，轉(zhuǎn)移至96孔板時(shí)，不貼壁，緩慢打入孔內(nèi)，避免破壞生成的微滴。
上述檢測(cè)方法，優(yōu)選的，所述步驟 (6) 中的 PCR 反應(yīng)條件為 ：
本發(fā)明的積極效果是具有更高的靈敏度、準(zhǔn)確度、精確性、重復(fù)性，可直接定量，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)感染弓形蟲(chóng)樣品能有效檢測(cè),是一種快速、敏感、準(zhǔn)確的檢測(cè)用試劑盒和檢測(cè)方法，便于在早期內(nèi)確定感染情況，做好預(yù)防工作。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述：需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互任意組合；一種基于數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒，其特征在于：包括1對(duì)特異性引物和1條與引物對(duì)配合使用的特異探針，其核苷酸序列分別為：
一種基于數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒在制備弓形蟲(chóng)檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
一種基于數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒，由微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑和若干個(gè)微滴發(fā)生卡組裝而成，其特征在于：微滴數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒，包含弓形蟲(chóng)檢測(cè)試劑；包括：溶液A：ddPCR預(yù)混液一支，0.9mL,其中包含500μL的2×ddPCR Supermix for Probes，上/下游引物分別為90μL(濃度為10μM)，特異性探針為30μL(濃度為10μM)，ddH2O 190μL ；
溶液B：微滴發(fā)生油一支，7mL；
溶液C：質(zhì)控液一支，3.5mL；
溶液D：陽(yáng)性對(duì)照模板一支，40μL；
溶液F：ddH2O一支，1mL；
使用基因組DNA為陽(yáng)性模板，使用0.01M pH8.0的Tris-EDTA緩沖液稀釋后冷凍保存；陽(yáng)性對(duì)照制劑按400μL定量分裝；使用ddH2O為陰性對(duì)照；
所述試劑盒的檢測(cè)方法程序?yàn)椋?/p>
1）制備ddPCR反應(yīng)液，總體積20μL，向擴(kuò)增管中加入下列反應(yīng)物：溶液A：18μL；模板：2μL；陰性對(duì)照：以ddH2O代替模板，同樣條件下擴(kuò)增；
2）取微滴發(fā)生卡置于卡托中固定，用8道可調(diào)移液器將20μL反應(yīng)液加入到微滴發(fā)生卡中間一排的8個(gè)孔內(nèi)，不足8個(gè)樣品時(shí)用20μL溶液C補(bǔ)足；
3）在微滴發(fā)生卡最底下一排8個(gè)孔中各加入70μL溶液B，不能有空孔，蓋上膠墊密封；
4）將帶有卡托的微滴發(fā)生卡輕且平穩(wěn)的放置于微滴生成儀中，開(kāi)始生成微滴；
5）微滴生成于微滴發(fā)生卡最上面一排孔內(nèi)，緩慢吸取40μL，再打入96孔板相應(yīng)位置孔內(nèi)；
6）在96孔PCR儀內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，升降溫速度為2.5℃/sec；
7）將完成PCR的96孔板放入plate holder中組裝好，之后輕且平穩(wěn)的放入微滴讀取儀中；
8）打開(kāi)QuantaSoft軟件進(jìn)行檢測(cè)和定量分析。
所述檢測(cè)程序2）中使用8道可調(diào)移液器加樣時(shí)，槍頭接近孔一側(cè)底部，與側(cè)壁呈大約15°角，緩慢打出液體，打出一部分后慢慢提升槍頭位置再打出余下液體，不要將槍按至超過(guò)第一檔位置以免引入氣泡。
所述檢測(cè)所述程序5）中微滴發(fā)生卡最底下一排8個(gè)孔中用8道可調(diào)移液器加樣時(shí)，槍頭接近微滴發(fā)生卡底部，緩慢吸出液體，轉(zhuǎn)移至96孔板時(shí)，不貼壁，緩慢打入孔內(nèi)，避免破壞生成的微滴。
所述程序6）中的PCR反應(yīng)條件為：
(1) 預(yù)變性：溫度94℃，10min；
(2) 變性：溫度94℃，15s，退火：溫度60℃，1min，共40個(gè)循環(huán)；
(3)結(jié)束反應(yīng)：溫度98℃，10min。
實(shí)施例 1 引物及探針的設(shè)計(jì)與篩選
1、本發(fā)明引物、探針設(shè)計(jì) ：根據(jù)Genbank已發(fā)表的弓形蟲(chóng)基因序列 (GenBank: AF179871.1 ) 為靶基因，進(jìn)行適用于ddPCR的特異性引物和的設(shè)計(jì)。
本實(shí)施例給出了篩選最佳引物的過(guò)程，選擇用軟件設(shè)計(jì)出的其中幾對(duì)備選引物進(jìn)行篩選，備選引物如下，見(jiàn)表 1。
2、引物的篩選
(1)引物隨機(jī)配為四對(duì)：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2；
(2)然后用染料法做熒光定量PCR，PCR體系配方：2×SYBR Green Supermix 10μL，上游引物，下游引物分別為1μL，ddH2O 3μL，陽(yáng)性模板5μL。PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性10min；94℃變性15sec，58℃退火1min，共40個(gè)循環(huán)；65℃—95℃每5秒升高0.5℃溶解曲線，結(jié)束反應(yīng)。
(3)結(jié)果分析，選擇沒(méi)有非特異性擴(kuò)增的引物對(duì)F1R1。
3、探針的篩選
(1)引物探針的組合為：1、F1R1+P1，2、F1R1+P2
(2)然后在ddPCR平臺(tái)上，ddPCR體系配方：2×ddPCR Supermix for probes 10μL，上游引物，下游引物分別為1μL，探針0 .5μL，ddH2O 3.5μL，陽(yáng)性模板4μL，總體積20μL(引物和探針的濃度均為10μM)。然后生成微滴。
(3)上PCR儀擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性10min；94℃變性30sec，58℃退火1min，共35個(gè)循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字PCR檢測(cè)儀檢測(cè)。
(4)分析結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇F1R1+P1引物探針組合。
實(shí)施例2在ddPCR平臺(tái)上檢測(cè)弓形蟲(chóng)的PCR方法退火溫度的優(yōu)化。
1、選擇引物探針的組合為：F1R1+P1。
2、然后在ddPCR平臺(tái)上，ddPCR體系配方：2×ddPCR Supermix for probes 10μL，上游引物，下游引物分別為1μL，探針0 .5μL，ddH2O 3.5μL，陽(yáng)性模板4μL，總體積20μL(引物和探針的濃度均為10μM)。做8個(gè)復(fù)孔，然后生成微滴。
3、上PCR儀擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性10min；94℃變性15sec，55～62℃(儀器設(shè)置8個(gè)溫度梯度)退火1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字PCR檢測(cè)儀檢測(cè)。
4、分析結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇57～60℃的退火溫度。
實(shí)施例3引物、探針濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
1、設(shè)計(jì)引物探針濃度均為10μM ,組合為F1R1+P1,體系配置方法見(jiàn)表2。
2、在ddPCR平臺(tái)上生成微滴，轉(zhuǎn)移到96孔板內(nèi)，封鋁膜。
3、上PCR儀擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性10min；94℃變性15sec，60℃退火1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字PCR檢測(cè)儀檢測(cè)。
4、分析結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇F1R1+P1引物探針配方：引物分別為1.8μL，探針為0.6μL。
實(shí)施例4 PCR擴(kuò)增升降溫速度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
1、然后在ddPCR平臺(tái)上，引物探針組合F1R1+P1 (濃度為10μM),用ddPCR體系配方：2×ddPCR Supermix for probes 10μL，上游、下游引物分別為1.8μL，探針為0.6μL，ddH2O 3.8μL，陽(yáng)性模板2μL，總體積20μL。每臺(tái)儀器做4個(gè)復(fù)孔，生成微滴，轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)。
2、在兩臺(tái)同樣的PCR儀平臺(tái)上擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性10min；94℃變性15sec，60℃退火1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng),一臺(tái)設(shè)置升降溫速度設(shè)置為5℃/sec，另一臺(tái)上設(shè)置升降溫速度設(shè)置為2.5℃/sec，擴(kuò)增結(jié)束后，把PCR管內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到同一塊96孔板內(nèi)，封鋁膜，上微滴數(shù)字PCR檢測(cè)儀檢測(cè)。
3、分析結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，升降溫速度慢的最后檢測(cè)的微滴數(shù)比升降溫速度快的多，擴(kuò)增效率高，升降溫速度慢的陰性微滴和陽(yáng)性微粒之間的距離分的很開(kāi)，很容易區(qū)分，升降溫速度快的陰性微滴和陽(yáng)性微粒之間的距離分的不開(kāi)，不容易區(qū)分，故選擇2.5℃/sec升降溫速度。
實(shí)施例5總DNA提取
1、取200mg研磨后的樣品于1 .5mL離心管中。
2、加入350μL的組織裂解液，10μL蛋白酶K混合均勻，56℃水浴1h-3h。
3、加入700μL飽和酚強(qiáng)烈振蕩,12000r/min離心10min，取上清。
4、重復(fù)步驟3，加入等體積苯酚:氯仿:異戊醇(25: 24: 1)混勻后12000r/min離心10min ，取上清液，加等體積酚:氯仿:異戊醇(25: 24: 1)再抽提一次。
4、用2倍體積的無(wú)水乙醇，0.1倍體積的 3 mol/L NaAC于-20℃沉淀30 min，12000 r/min離心10 min，棄上清。
5、沉淀用無(wú)水乙醇洗一次，自然干。
6、用50-200μL TE（pH值8.0）溶解DNA沉淀，-20℃保存。
實(shí)施例6檢測(cè)弓形蟲(chóng)的ddPCR方法的建立
1、微滴數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒的組裝
將試劑盒分為微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑，方便保存和運(yùn)輸。用合適的外包裝盒包裝以下試劑，貼標(biāo)簽(標(biāo)示名稱(chēng)、批號(hào)、生產(chǎn)日期、有效期等)。
溶液A（ddPCR預(yù)混液），一支，0.9mL；溶液B（微滴發(fā)生油），一支，7mL；溶液C（質(zhì)控液），一支，3.5mL；溶液D（陽(yáng)性對(duì)照模板），一支，35μL；溶液F（ddH2O），一支，1mL。
使用基因組DNA為陽(yáng)性模板，使用0.01MpH8.0的Tris-EDTA緩沖液稀釋后冷凍保存；陽(yáng)性對(duì)照制劑按400μL定量分裝；使用ddH2O為陰性對(duì)照。
上述溶液A其900μL的配方包含500μL的2×ddPCR Supermix for Probes，上/下游引物分別為90μL(濃度為10μM)，特異性探針為30μL(濃度為10μM)，ddH2O 190μL 。
使用時(shí)，在18μL的ddPCR探針?lè)A(yù)混液中加入2μL的DNA模板，得到20μL的ddPCR反應(yīng)液，用于制備微滴。
2、ddPCR方法的建立
(1)制備ddPCR反應(yīng)液，總體積20μL。向擴(kuò)增管中加入下列反應(yīng)物：
空白對(duì)照：以ddH2O代替模板，同樣條件下擴(kuò)增。
(2)取微滴發(fā)生卡置于卡托中固定，將20μL反應(yīng)液加入到微滴發(fā)生卡中間一排的8個(gè)孔內(nèi)，不足8個(gè)樣品時(shí)用20μL 1×溶液C補(bǔ)足，建議使用8道可調(diào)移液器加樣時(shí)，槍頭接近孔一側(cè)底部，與側(cè)壁呈大約15°角，緩慢打出液體，打出一部分后慢慢提升槍頭再打出剩余液體，不要將槍按至超過(guò)第一檔位置以免引入氣泡。
(3)在微滴發(fā)生卡最底下一排8個(gè)孔中各加入70μL微滴生成油，同樣不能有空孔。
(4)蓋上膠墊，注意兩邊的小孔都要鉤牢。
(5)將以上卡托輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開(kāi)始生成微滴，注意儀器上指示燈狀態(tài)，一般2分鐘之內(nèi)完成。
(6)微滴生成于微滴發(fā)生卡最上面一排孔內(nèi)，建議使用8道可調(diào)移液器小心緩慢吸取，調(diào)整吸取體積為40μL，將卡托放平，槍頭以與孔壁呈30～45°角放入，輕觸孔底，約5秒吸取40ul，再同樣緩慢地打入96孔板相應(yīng)位置孔內(nèi)(約5秒)，槍頭貼近孔壁接近孔底，注意封上蓋以防油揮發(fā)，每次棄去已使用過(guò)的微滴發(fā)生卡和膠墊。
(7)封好膜之后應(yīng)該在30min內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)，或者放于4℃冰箱4h之內(nèi)進(jìn)行PCR，可在任意一臺(tái)96孔PCR儀上完成，升降溫速度為2.5℃/sec。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min；94℃變性15sec，60℃退火1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)。
(8)將之前完成PCR的96孔板放入plate holder中組裝好，注意板斜角方位，組裝好之后輕輕地平穩(wěn)放入微滴讀取儀中。
(9)打開(kāi)QuantaSoft軟件，建議每次實(shí)驗(yàn)之前做一次系統(tǒng)清洗，若一周以上未使用建議先做一次填充油路再做系統(tǒng)清洗。之后對(duì)96孔板中樣品信息進(jìn)行設(shè)置，主要是提供實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)、實(shí)驗(yàn)類(lèi)型以及探針信息等，完成后即可運(yùn)行儀器，結(jié)束后結(jié)果會(huì)被自動(dòng)分析，人工核實(shí)后保存結(jié)果。
4、結(jié)果分析和判定
本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)果的判定方法為：(1)陽(yáng)性對(duì)照：20±5個(gè)拷貝；(2)陰性對(duì)照：<1個(gè)拷貝；待測(cè)樣本結(jié)果判定：(1)陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果≥ 1個(gè)拷貝。(2)陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果<1拷貝。
實(shí)施例7特異性檢驗(yàn)
用制備的試劑盒分別檢測(cè)犬新孢子蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)、球蟲(chóng)、賈第蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)樣本各10份，結(jié)果全為陰性；檢測(cè)弓形蟲(chóng)樣本各10份，結(jié)果全為陽(yáng)性。
以上檢測(cè)結(jié)果證明了本發(fā)明的試劑盒特異性好、靈敏度高、可直接定量，檢測(cè)方便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
本發(fā)明根據(jù)弓形蟲(chóng)B1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，成功建立了弓形蟲(chóng)的數(shù)字PCR檢測(cè)方法，填補(bǔ)了弓形蟲(chóng)數(shù)字PCR檢測(cè)方法的空白。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。