本發(fā)明涉及齊口裂腹魚生長速度相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，具體涉及齊口裂腹魚生長速度相關(guān)的SNP標(biāo)記，用于檢測前述SNP標(biāo)記的引物對和試劑盒，以及前述SNP標(biāo)記、引物對及試劑盒在齊口裂腹魚選育中的用途，以及檢測齊口裂腹魚生長速度的方法。
背景技術(shù)：
：齊口裂腹魚（Schizothoraxprenanti）是我國重要的冷水魚類之一，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味鮮美、營養(yǎng)價值高，深受消費者青睞，已成為目前我國長江上游名貴經(jīng)濟(jì)魚類。我國曾有豐富的齊口裂腹魚野生資源，然而近些年由于過度捕撈、修建電站、水體污染等問題導(dǎo)致齊口裂腹魚野生資源遭到嚴(yán)重破壞，種群數(shù)量急劇下降，自然資源將近枯竭。為有效保護(hù)齊口裂腹魚的野生資源，研究人員先后攻克了齊口裂腹魚的人工繁殖和人工養(yǎng)殖技術(shù)，目前，已在重慶、四川、云南等地進(jìn)行了規(guī)?；酿B(yǎng)殖。但由于近年來養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、集約化程度的提高、養(yǎng)殖密度的增加、近親繁殖程度加大等原因，齊口裂腹魚種質(zhì)退化，生長速度減慢，制約了齊口裂腹魚產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。因此，培育齊口裂腹魚優(yōu)良品種是促進(jìn)該產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。分子標(biāo)記輔助育種（marker-assistedselection，MAS）是依據(jù)與某一基因或性狀緊密連鎖的標(biāo)記的出現(xiàn)來推斷該基因或性狀而進(jìn)行選育，它是在DNA水平上而不是根據(jù)表型進(jìn)行選擇，因此選擇的準(zhǔn)確性大大提高，并可在早期鑒定出具有優(yōu)良性狀的個體，篩選優(yōu)良親本，從而加快育種進(jìn)程，縮短育種周期。SNP標(biāo)記是繼微衛(wèi)星標(biāo)記之后最為高效的分子輔助育種標(biāo)記手段，由于是雙等位型標(biāo)記，SNP標(biāo)記具有在全基因組多態(tài)性高、含量豐富、遺傳穩(wěn)定、分析簡單等優(yōu)點，因而廣泛用于多種動物及少數(shù)魚類的選擇育種中。然而，齊口裂腹魚生長相關(guān)（體質(zhì)量、體高、全長、體長）SNP未見報道，能有效用于齊口裂腹魚生長相關(guān)性狀選育的SNP標(biāo)記有待挖掘。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提供齊口裂腹魚生長速度相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，通過該SNP標(biāo)記能夠快速檢測齊口裂腹魚的生長速度，進(jìn)而加快齊口裂腹魚優(yōu)良品種培養(yǎng)進(jìn)程。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：1.齊口裂腹魚生長速度相關(guān)的SNP標(biāo)記，所述SNP標(biāo)記包括SNP1標(biāo)記和SNP2標(biāo)記，核苷酸序列依次如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述SEQIDNO.1所示序列自5’端起第678位堿基是A或C，所述SEQIDNO.2所示序列自5’端起第452位堿基是A或C。所述SNP1標(biāo)記的CC基因型個體生長速度顯著高于AA和AC基因型個體；所述SNP2標(biāo)記的CC基因型個體生長速度顯著高于AC基因型個體；當(dāng)所述SNP1和SNP2標(biāo)記的個體均為CC基因型時齊口裂腹魚的生長速度更快。2.用于檢測上述SNP標(biāo)記的引物對，所述SNP1標(biāo)記的引物對核苷酸序列為：F1：GCAGAGGCTTTTCTCAACAG，（SEQIDNO.3）；R1：ACAAATCCTTACGCAGTGGC，（SEQIDNO.4）；所述SNP2標(biāo)記的引物對核苷酸序列為：F2：ACAGTGTTGGGTGTAGATGG，（SEQIDNO.5）；R2：GATGCTAGTGTACGGCATTC，（SEQIDNO.6）。3.用于檢測上述SNP標(biāo)記的試劑盒，包含上述的引物對。4.一種檢測齊口裂腹魚生長速度的方法，通過對待測齊口裂腹魚進(jìn)行上述SNP標(biāo)記的檢測，確定所述待測齊口裂腹魚的生長速度。優(yōu)選的，包括以下步驟：（1）提取待測齊口裂腹魚的基因組DNA；（2）利用權(quán)利要求2所述的引物對，將步驟（1）獲取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；（3）對步驟（2）獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得測序結(jié)果后根據(jù)結(jié)果確定待測齊口裂腹魚的SNP標(biāo)記的基因型；（4）根據(jù)步驟（3）確定的SNP標(biāo)記的基因型確定待測齊口裂腹魚的生長速度。優(yōu)選的，所述SNP1和SNP2標(biāo)記的個體均為CC基因型時齊口裂腹魚的生長速度更快。本發(fā)明所述檢測齊口裂腹魚生長速度的方法中，基因組提取不受特別限制，可以采用傳統(tǒng)酚氯仿法提取，也可采用試劑盒提取，本發(fā)明中的具體實施例是采用試劑盒提取，試劑盒操作簡便、快速、提取的DNA質(zhì)量高。另外，待測齊口裂腹魚個體基因型檢測方法不受特別限制，飛行時間質(zhì)譜、測序、芯片、單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)均可用于SNP的檢測。其中，飛行時間質(zhì)譜準(zhǔn)確性高、靈活性強(qiáng)、通量大、檢測周期短，因此，本發(fā)明采用飛行時間質(zhì)譜檢測SNP標(biāo)記。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在位點SNP1處，基因型為純合CC時齊口裂腹魚的體重、全長、體高、都顯著高于基因型為AA和AC的個體；在位點SNP2處純合CC基因型的齊口裂腹魚在體重、全長、體高都顯著高于AC基因型個體，因此，綜合兩個位點信息，當(dāng)兩個位點的基因型為純合CC時，待測齊口裂腹魚個體生長速度更快。選擇在SNP1和SNP2位點處基因型都為CC的個體雜交，則后代個體在SNP1和SNP2位點處基因型都為純合CC，后代個體都為快速生長類型。本發(fā)明的SNP標(biāo)記與齊口裂腹魚的生長速度緊密相關(guān)，能夠在魚苗培養(yǎng)早期根據(jù)育種需要選擇親本，利用本發(fā)明標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，進(jìn)而加快齊口裂腹魚優(yōu)良品種培養(yǎng)進(jìn)程。另外，利用本發(fā)明的兩個SNP位點引物及相關(guān)試劑盒可檢測齊口裂腹魚基因型，判斷該個體生長速度及不同基因型組合后代的生長速度，能夠有效用于齊口裂腹魚分子標(biāo)記輔助選擇育種，加快齊口裂腹魚優(yōu)良品種培育進(jìn)程。具體實施方式下面將對本發(fā)明技術(shù)方案的實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只作為示例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。1.1齊口裂腹魚群體樣本來源待測齊口裂腹魚來自于峨眉山冷水魚養(yǎng)殖場同一批次人工繁殖的13月齡的齊口裂腹魚，隨機(jī)挑選114尾齊口裂腹魚測定其表型性狀（體質(zhì)量、體高、全長、體長），并剪取鰭條保存于無水乙醇中，用于基因組DNA提取。1.2待測齊口裂腹魚基因組DNA提取將保存好的鰭條剪取25mg進(jìn)行DNA抽提，抽提基因組DNA采用上海生工Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒，并按照使用說明進(jìn)行。將抽提的DNA采用瓊脂凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和體積分?jǐn)?shù)，并將其稀釋成40ng/μL的濃度，保存在4℃以備用。1.3測序及SNP標(biāo)記開發(fā)隨機(jī)選擇108尾齊口裂腹魚的脾臟組織平均分成18個重復(fù)，用IlluminaHisSeq2500測序平臺進(jìn)行雙末端測序，每個樣品的產(chǎn)生不低于4Gb數(shù)據(jù)。同時還對這108尾魚的生長相關(guān)性狀進(jìn)行統(tǒng)計。采用SAMTools1.19和GATK2.8.1軟件開發(fā)假定的SNPs，從857,535個SNPs中隨機(jī)選擇30個SNPs進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，并利用SPSS18.0進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得了兩個與生長性狀顯著相關(guān)的SNP位點，SNP1位點位于SEQIDNO.1所示序列自5’端起第678bp處，此位點堿基是A或C，SNP2位點位于SEQIDNO.2所示序列自5’端起第452bp處，此位點堿基是A或C。1.4PCR擴(kuò)增及檢測以齊口裂腹魚基因組DNA為模板，采用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：所述SNP1標(biāo)記的引物對核苷酸序列為：F1：GCAGAGGCTTTTCTCAACAG，（SEQIDNO.3）；R1：ACAAATCCTTACGCAGTGGC，（SEQIDNO.4）；所述SNP2標(biāo)記的引物對核苷酸序列為：F2：ACAGTGTTGGGTGTAGATGG，（SEQIDNO.5）；R2：GATGCTAGTGTACGGCATTC，（SEQIDNO.6）。在經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中加入SNP序列特異性延伸引物（EXT1和EXT2），在SNP位點上延伸一個堿基。SNP1延伸引物序列為：EXT1：agtcCCATTGGCAAGAGCATA，（SEQIDNO.7）；SNP2延伸引物序列為：EXT2：tagggTGAAATCCGTGAACTCACAGT，（SEQIDNO.8）。PCR反應(yīng)條件為：94℃15分鐘；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分鐘，45個循環(huán)；72℃延伸3分鐘。反應(yīng)體系以5μL計為：0.5μM引物1μL，2.5mMdNTP0.1μL，10mMMgCl20.3μL，0.5μL10×PCRbuffer，5UTaqpolymerase(Qiagen)0.2μL，和10ng基因組DNA1μL，滅菌雙蒸水1.9μL。延伸產(chǎn)物經(jīng)純化后與表面覆蓋基質(zhì)的MassARRAYSpectroCHIP芯片共結(jié)晶。將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管中即可自動分析SNP的位點信息。114尾齊口裂腹魚在SNP1和SNP2位點基因型及對應(yīng)的生長相關(guān)性狀（體重、全長、體高）如下表1所示。表1114尾齊口裂腹魚在SNP1和SNP2位點基因型及對應(yīng)的生長相關(guān)性狀個體編號體重(g)全長(cm)體高(cm)SNP1基因型SNP2基因型164.317.22.9AACC294.322.54.1AACC369.920.13.6AACC455.818.63.9AAAC5130.725.74.3ACCC677.220.93.8AACC771.920.83.8AACC886.822.63.6AACC985.322.13.9ACCC10121.924.54.4ACCC11130.325.24.5AACC12102.721.44ACCC13170.826.95ACCC1468.420.43.6ACCC1561.719.93.6AACC1649.819.13ACAC1755.6193.2AACC1833.816.32.6ACCC1933.817.12.5ACCC2080.421.33.8ACCC2153.2193.5AACC2284.221.54.1ACCC2399.322.24.2AACC2493.523.14ACCC25119.924.84.3ACCC26114.424.44.5AACC2770.3203.8AAAC2888.3223.6AACC29144.824.65AACC30131.824.64.8CCCC3166.119.83.5ACCC32149.123.55.5ACCC33131.325.24.6AACC3479.921.53.4AACC358721.34AACC3650.518.43.1AACC37102.122.54.5ACCC38124.3254.3AACC3987.522.53.8AACC4067.319.33.5AACC41118.823.84.2AACC4257.819.23.3AACC43100.722.64.1AACC4460.1193.5ACCC4569.819.43.6ACCC4687.9223.3ACAC4765.120.23.1ACCC4876.120.83.4ACCC4975.620.53.7AACC5080.722.53.6ACCC516719.53.3AAAC5267.9203.6AACC5339.116.52.9AACC5495.921.73.8ACCC55132.725.34.4CCCC5689.822.93.9ACCC5759.419.13.4ACCC5853.519.13.3AACC594116.73.1ACAC6076.121.83.4ACCC6134.616.22.9ACAC6270.120.23.8ACCC6375.821.23.6ACCC6495.822.23.7AACC65106.423.33.9AACC6684.221.63.8AACC6710122.54.1ACCC68138.223.65.2ACCC69119.822.44.3AACC70120.924.14.4ACCC7192.221.53.6ACCC72124.123.64.6AACC73111.623.64.1AACC74104.723.83.8AACC75126.424.64.2ACCC76140.324.84.6ACCC7785.423.14.1AACC7889.622.33.6ACCC7967.919.73.8AACC8072.620.73.3ACCC8178.921.53.6ACCC8279.922.23.3ACCC8355.319.63.2ACCC8494.122.24.1ACCC8597.522.44.3ACCC86165.126.55ACCC8712223.74.2AACC8885.322.33.8AACC89104.525.54.7ACCC90100.323.43.9ACCC919922.14.1AACC92110.3244.1AACC9354.6193.1AAAC9466.919.23.4AACC95123.523.94.3ACCC96148.425.44.5AACC97121.723.54.1AACC98125.524.14.3AACC99138.8244.5ACCC10082.121.63.5AAAC101115.124.24ACCC102109.123.74AACC10392.921.63.8AACC104199.528.35.2AACC10590.5223.9ACCC1069321.54AAAC10772.221.13.5AACC10845.517.83AACC10965.119.33.4AACC11045.917.23.1ACCC11174.420.23.8ACCC11252.318.53.3AACC113132.824.54.4AACC11464.3203.6ACCC1.5SNP位點與生長相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析基于表1的結(jié)果，采用SPSS18.0的一般線性模型中的多元方差分析和獨立樣本T檢驗檢驗各SNPs位點的基因型和各位點的等位基因與數(shù)量性狀的相關(guān)分析，對于表達(dá)顯著的SNPs位點，采用Ducan法進(jìn)行多重比較分析。分析結(jié)果見表2。表2齊口裂腹魚SNP位點與表型性狀的相關(guān)關(guān)系SNP編號基因型數(shù)目體重均值(g)全長均值(cm)體高均值(cm)SNP1AA5990.24±30.84a21.66±2.40a3.84±0.49aAC5390.27±32.36a21.75±2.51a3.84±0.63aCC2132.25±0.64b24.95±0.50b4.60±0.28bSNP2CC10493.63±31.37a21.98±2.39a3.90±0.56aAC1063.61±19.83b19.42±1.97b3.39±0.39b由表2可知，在位點SNP1處，基因型為純合CC時齊口裂腹魚的體重、全長、體高、都顯著高于基因型為AA和AC的個體（P<0.01）；在位點SNP2處純合CC基因型的齊口裂腹魚在體重、全長、體高都顯著高于AC基因型個體（P<0.01）；進(jìn)而證明SEQIDNO.1所示核苷酸序列（全長1160bp）自5’段起第678位堿基A或C，SEQIDNO.2所示核苷酸序列（全長1594bp）自5’段起第452位堿基A或C，都與齊口裂腹魚生長速度顯著相關(guān)，為齊口裂腹魚生長相關(guān)SNP標(biāo)記，本發(fā)明的兩個標(biāo)記可用于齊口裂腹魚生長相關(guān)性狀選育。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書的范圍當(dāng)中?！?10〉西南大學(xué)〈120〉齊口裂腹魚生長速度相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用〈160〉8〈210〉1〈211〉1160〈212〉DNA〈213〉齊口裂腹魚（Schizothoraxprenanti）〈220〉〈223〉SNP1序列〈400〉1agcgccttaagatcattctcatccacaacaaatcctgtcaataaagatatgtccaatata60gacatggtggcgtctctgtcagcagacagatatctggtattgataatgagtttgtaactc120tcagttgctccttgatatgttactttattatccctttcaaaagccaaagaaagctcaaag180ttcttgcaagtgcttttgctttcttttggttttgcatagtactccgtcacaacagttaca240gaggcctcgccagaacccttggcactgatggtgatctgcctgttggatggaatcttttct300gtttgtgcgagataagagttttctttgttgaacttccacacaatcggctgccggctgcca360tccactcgtatcgtcatctccaggtctaactgctttatgtctttcacatgaatcctgtac420tcagctacggcctgaaacaccatgatggtggcctgagtcgtgccatatcctccactgtac480tgcctctggttgttgagccagtttacgatgggagctgcactctggaagtcttgagctttt540acaagagccaaaagtgcataggccgaagcctctaaagtaaagctactgcttccagggaca600ggccagtgacttccatctgcagaggcttttctcaacagaacttgtttgtcaagtgcattt660ccattggcaagagcatamgatgccattgccactgcgtaaggatttgtcagaccatgtaac720tgagatctgaggtacacaatggctttgtatatgctactgtcaagacttgagatgtggccg780gcacaaatgcccctcccctcctgcagggcaatgagcacaaaagctgtcatggatgcttgt840gaatttcccccacgcacgttcccagtcatctctccgtgaattacaggggcatcttctctg900aaaacaccatcaggtaactgcttgttcagtatgagccacttgagggcagagcagatcaca960ttccagtcaatgtttacgatgttactggccatggcaaatactttagcaacatatgctgtc1020aaccaggtgctgcttgaacgattaatccatgcggcataggacccgtcatttttacgatat1080gccagctgttgattgtaacctctcgtgatgtacgtaactgctgtctgcctaagcccaacc1140ctcacggtgtgccactgatt1160〈210〉2〈211〉1594〈212〉DNA〈213〉齊口裂腹魚（Schizothoraxprenanti）〈220〉〈223〉SNP2序列〈400〉2ccagtcacacaaaagtcaatcagaagcttcagtccatgggcaggaccagcttcttggtga60gggtatatcgaggttcaggcatctgcttgcggcccttcaaactttttaaactcacttcac120ggtttacttttgtcaggatggacaagatatcctcttttctggggcagaggttctccaact180gattacagagctcctggatatagatagacccatctttagtgtggcggtaggactggtagc240gctctactgtggccattccaattagcatatcagcttctataggaatagagggggcttcag300gattataagcatcttcatcatatgggtcgtcttctgtagcgtttcccggtgcatccgctg360tcaatacaccattctgaccctcatttccttgacaggcttgaatgaagaaaagcttgggct420tggatgctagtgtacggcattcagcaataggmactgtgagttcacggatttcaacctctt480taccatctacacccaacactgtgcccttctgtccatgcgaaaggacacagcagacaaaag540cccccatacgagtatgatccctgtttgcaaagtgccttataacatccttcatatctgaag600ctgtcagatctttctgaaccttaacctcaaaatgcattctgcgaaacactctgctaaggt660catctttgtccttatccgttcctgtccggttggacaatgaggacctttctttaaagttgt720agttgttgatgattaaacagtatccaagcggtcgctgagtcacattataataatcccccg780ttctgggttcagtgtctgaatcggtaacaagtgagtctctcctccatccattttctgcct840ccatttgatatcttggcatactttcagcaggaacggaaacttgcacattaccagacactt900cccgtagaggaagtctgcctccttgttcccgggccctgtactcctctatcctgcaggcca960gctgtttgtcacatttgt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