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血清外泌體miRNAs標志物在地方性砷中毒早期診斷中的應用的制作方法

文檔序號:12250000閱讀:493來源:國知局
血清外泌體miRNAs標志物在地方性砷中毒早期診斷中的應用的制作方法與工藝
本發(fā)明屬于因工程與臨床醫(yī)學
技術領域
,具體涉及人類地方性砷中毒早期發(fā)生相關的血清外泌體微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)標志物及其應用。
背景技術
:地方性砷中毒簡稱地砷病,是一種生物地球化學性疾病,是居住在特定地理環(huán)境條件下的居民,長期通過飲水、空氣或食物攝入過量的無機砷而引起的以皮膚色素脫失或/和過度沉著、掌跖角化及癌變?yōu)橹鞯娜硇缘穆灾卸?。地砷病是一種嚴重危害人體健康的地方病。除致皮膚改變外,無機砷是國際癌癥研究中心確認的人類致癌物,可致皮膚癌、肺癌,并伴有其他內臟癌高發(fā)。在重病區(qū),當切斷砷源后或離開病區(qū),經(jīng)過多年仍有地砷病的發(fā)生,表明由砷引起的毒害可持續(xù)存在很長時間,并逐漸顯示出遠期危害—皮膚改變,惡性腫瘤及其他疾病等。臨床上,地砷病多為慢性砷中毒表現(xiàn)。在不同病區(qū),由于攜砷介質不同及攝入量的差異,臨床表現(xiàn)不盡相同。在輕病區(qū)病人往往只有輕的皮膚病變而無明顯的臨床癥狀。在重病區(qū)病人體征明顯,常伴有不同程度的臨床癥狀,同時心血管病、肝病、腫瘤等并發(fā)也較多見。地方性砷中毒在全球許多國家流行,目前正威脅著至少22個國家和地區(qū)的5000多萬人口,已成為世界性嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題之一,包括由長期飲用高砷水引起的飲水型地方性砷中毒和燃用高砷煤導致室內空氣或食物污染引起的燃煤污染型地方性砷中毒,其中后者是我國特有的地方性砷中毒類型,僅流行于貴州(1976年確認)和陜西(2005年確認)兩省。我國政府高度重視地方性砷中毒防控問題,“十五”以來持續(xù)將其列為國家重點防治疾病和“健康中國2020行動計劃”,目前在環(huán)境干預、人群行為干預等方面取得矚目成就。但由于燃煤型砷中毒影響因素復雜,低砷污染狀況仍有存在,健康危害具有累積性和難可逆性,停止接觸后病情仍可持續(xù)發(fā)展,特別是機制不明和無特效治療藥物或方案致病人病情未得到明顯控制。因此,本發(fā)明主要目標就是在燃煤型砷中毒的早期診斷中探索重要生物學標志物,為早期診斷提供可靠依據(jù),使砷中毒在早期得以有效的控制。表觀遺傳學是指DNA序列不發(fā)生改變,但基因表達卻發(fā)生了可遺傳改變的現(xiàn)象,包括DNA甲基化(DNAmethylation)、組蛋白修飾(histonemodification)、非編碼RNA(noncodingRNA,ncRNA)及染色質重塑等,其具有可遺傳和可逆轉等特征;還有報道認為表觀遺傳學改變可能早于遺傳信息改變,且較遺傳學改變更為普遍。近年來環(huán)境化學物引起表觀遺傳模式改變與疾病發(fā)生關系備受關注,深入研究表觀遺傳調控機制在地方性砷中毒所致機體損傷和腫瘤中的作用及其過程將成為本發(fā)明研究的重點。微小核糖核酸(microRNAs,即miRNAs)是近年剛剛興起的研究熱點,它是一類長約19-23個核苷酸的單鏈RNA分子,多位于基因組非編碼區(qū),進化上高度保守,其通過與靶基因mRNAs的3’UTR區(qū)結合后,對靶基因mRNA剪切或抑制翻譯而下調蛋白表達水平。miRNAs能調控多種生物學過程,包括細胞周期、凋亡、分化、發(fā)育和新陳代謝等生理和病理過程,同時也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。自參與調控線蟲時序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來,miRNAs已逐漸成為調控mRNA穩(wěn)定性和蛋白翻譯的研究熱點,分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志年度十大科技突破。現(xiàn)在預測miRNAs至少能調控數(shù)千個人類基因,占所有基因的30%以上。隨著研究的深入,越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。目前,miRNAs與腫瘤的關系已成為研究的重點,已發(fā)現(xiàn)若干miRNAs通過負調控基因的表達與慢性淋巴細胞性白血病、、肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌高度相關。然而,但目前血清miRNAs與地方性砷中毒等的相互關系報道甚少。外泌體是一種直徑為30-100nm的納米級脂質包裹體結構,1983年首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn),并1987年被Johnstone命名為“exosome”。其內部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物質。包括腫瘤細胞在內的幾乎所有類型的細胞,都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。外泌體由細胞分泌釋放出來,在血液等體液內傳播,最后又可被其他細胞吞噬,是細胞間通訊的重要介質。越來越多的證據(jù)表明,宿主細胞或腫瘤細胞分泌的外泌體參與了腫瘤發(fā)生、生長、侵襲和轉移。發(fā)表于《自然》(Nature)雜志上的一篇論文中也證實了腫瘤釋放了數(shù)百萬攜帶著它們的蛋白質和遺傳內容物的囊泡。這些囊泡像“通信船”或“偵察艦”一樣,它們確保了受納器官做好準備招待腫瘤細胞。具體說來,外泌體觸發(fā)了受納器官中必要的分子反應——炎癥、血管形成等來歡迎腫瘤細胞,使得當腫瘤細胞到達時可以進行增殖。然而,血清外泌體miRNAs與地方性砷中毒等的相互關系尚未見報道。許多證據(jù)表明miRNAs可以穩(wěn)定存在于體液中,包括唾液、尿液、母乳和血液。細胞外的miRNAs可以被裝入外泌體或微囊泡中,還能被裝載在高密度脂蛋白HDL上,這些都能保護它們不被降解,使它們穩(wěn)定存在。隨著囊泡的運輸功能被日益挖掘,外泌體中的miRNAs的作用也受到越來越多的關注。它們通過循環(huán)囊泡傳遞信息,這被認為是細胞間信號交流的第三種途徑,與細胞接觸依賴的信號傳導和通過可溶性分子介導的傳導這兩條途徑一樣重要。最新的研究成果發(fā)現(xiàn)血清中存在外泌體且攜帶miRNAs,使得miRNAs性質穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測,存在顯著的疾病特異性,在肺癌、結腸癌中已經(jīng)證實血清外泌體miRNAs的表達譜可作為早期診斷的潛在生物標志物。這一發(fā)現(xiàn)令人振奮,血清外泌體miRNAs作為一類非編碼調節(jié)性的小分子RNA有可能取代傳統(tǒng)的特異蛋白為代表的生物標志物,開拓了生物標志物的新境界。然而血清中外泌體miRNAs在地方性砷中毒早期診斷監(jiān)測中的應用還未得到相應的關注,若能發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的與地方性砷中毒早期發(fā)病相關的特異血清外泌體miRNAs作為生物標志物,并研發(fā)相應疾病的診斷、監(jiān)測試劑盒,不僅在該領域處于國際領先地位,可創(chuàng)造令人矚目的經(jīng)濟效益,對我國地方性砷中毒的防治也將是一次強有力的推動。技術實現(xiàn)要素:針對上述技術問題,本發(fā)明提出一種與地方性砷中毒早期診斷相關的血清外泌體miRNA標志物及其應用。本發(fā)明的第二個目的是提供上述miRNAs標志物的特異性引物。本發(fā)明還有一個目的是提供上述血清外泌體microRNA標志物及其特異性引物在制備地方性砷中毒早期診斷試劑盒中的應用。本發(fā)明再有一個目的是提供人類地方性砷中毒早期診斷或監(jiān)測的試劑盒。本發(fā)明的目的是通過下列技術方案實現(xiàn)的:一種與地方性砷中毒早期診斷相關的血清外泌體miRNA標志物,該標志物為has-miR-155、has-miR-191的組合。hsa-miR-155的序列為UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU(SEQIDNo.1),hsa-miR-191的序列為CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG(SEQIDNo.2)。所述的miRNA標志物的特異性擴增引物,其特征在于,該引物為:has-miR-155的上游引物序列為SEQIDNo.3,下游引物序列為SEQIDNo.4;has-miR-191的上游引物序列為SEQIDNo.5,下游引物序列為SEQIDNo.6。所述的miRNA標志物在制備地方性砷中毒早期診斷試劑盒中的應用。所述的miRNA標志物的特異性擴增引物在制備地方性砷中毒早期診斷試劑盒中的應用。一種地方性砷中毒早期診斷試劑盒,該試劑盒用于檢測血清外泌體miRNAs中has-miR-155和has-miR-191。所述的診斷試劑盒,該試劑盒中含有所述的miRNA標志物的特異性擴增引物。所述的診斷試劑盒,該試劑盒中還包括PCR技術常用的試劑。所述試劑是能夠測定這些血清外泌體microRNA標志物在血清外泌體中表達量的試劑。本發(fā)明的另外一個目的是提供本發(fā)明的目的是提供提取血清外泌體的方法及鑒定。本發(fā)明詳細描述如下:本發(fā)明人以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本,系統(tǒng)收集完整的人群基礎信息和臨床資料,并采用了RT-PCR方法、TaqManmiRNAArray、Real-timePCR(染料法)方法的一種或幾種進行檢測。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分:一、研究對象選擇和分組依據(jù):A組:健康對照組(n=80,20人芯片篩選,30人一期驗證,30人獨立人群驗證),無其他全身性重大疾病。B組:重度子癇早期組(n=80,20人芯片篩選,30人一期驗證,30人獨立人群驗證),無其他全身性重大疾病。二、血液血清分離及前處理:(1)新鮮肝素抗凝血5ml于離心機3000rpm離心5min,取上清每250μl分裝至潔凈1.5mlEP管中。(2)250ul血清加入63ulExoQuick試劑(4:1),4度孵育30min-1h,孵育后,1500g-10000g離心30min-1h。(3)吸去上清,1500g離心5min,小心吸盡液體用原樣本體積的1/10的去離子水溶解沉淀,即為外泌體。(4)一部分用于透射電鏡檢測,先用戊二醛固定。(5)一部分所提取的外泌體沉淀中加入1mlTrizol,混勻(反復吹打或渦旋),4℃放置10min。(6)按比例(1mlTrizol:200ul氯仿)加入氯仿200ul,劇烈振蕩,4℃放置15min。(7)4℃12000×g離心15min。吸取上層水相至新EP管(350ml)。(8)按比例(1mlTrizol:500ul異丙醇)加入異丙醇500ul,混勻,4℃放置10min。(9)4℃12000×g離心10min,棄上清,RNA沉于管底。(10)按比例(1mlTrizol:1ml75%乙醇)加入75%乙醇1ml,溫和振蕩。(11)4℃12000g離心5min,盡量棄上清(重復75%乙醇洗滌一次)。(12)室溫晾干,加適量DEPC水溶解沉淀RNA。(13)-70℃保存處理后的樣本。本發(fā)明實驗中使用的外泌體提取試劑均來自ExoQuickTMExosomePrecipitationSolution(貨號EXOQ20A-1)這個試劑盒,下同。三、血清外泌體鑒定。血清提取的外泌體用適量濃度的戊二醛固定后進行透射電鏡檢測。四、Real-timePCR方法測量血清外泌體miRNAs表達量。1.取經(jīng)前處理的血清外泌體RNA,通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品。按下表所示配制反轉錄體系:2.將PCR管反復顛倒混勻3次后做簡短離心,冰上放置5分鐘。3.將PCR管放入PCR儀進行反轉錄,反應條件如下所示:反轉錄產(chǎn)物保存于4℃冰箱以用于下一步的預擴增。4.逆轉錄后的cDNA按下表反應體系配制進行預擴增:預擴增的反應條件如下表所示:降至4℃后,將預擴增產(chǎn)物保存于4℃冰箱以用于下一步的Real-timePCR反應。5.簡短離心后,加入0.1TE(Ph8.0)75μl,顛倒混勻后再做簡短離心。預擴增產(chǎn)物可以直接用于下面的Real-timePCR。預擴增產(chǎn)物進行Real-timePCR按下表所示配制反應體系:*考慮到吸液損失而放量12.5%。6.檢測并比較健康對照、地方性砷中毒早期組血清外泌體樣本中miRNAs表達量的差異。檢測到的存在差異表達的健康對照和地方性砷中毒早期患者血清外泌體miRNAs包括hsa-miR-155、hsa-miR-191。這些miRNAs在地方性砷中毒早期患者中的拷貝數(shù)明顯低于健康對照組,并且這些miRNAs在血清外泌體中表達具有穩(wěn)定性。五、Real-timePCR方法驗證血清外泌體miRNAs表達量1.設計2條目標miRNAs的引物:運用Stem-loopPCR方法設計引物。2.加入熒光染料進行Real-timePCR反應。3.選擇獨立人群(對照和病例各30人)進行Real-timePCR檢測,結果一致的有3條miRNAs,具體的為:hsa-miR-155、hsa-miR-191。因此,最終確認為存在差異表達的健康對照和地方性砷中毒早期血清外泌體miRNAs包括hsa-miR-155、hsa-miR-191。它們在地方性砷中毒早期血清外泌體中的拷貝數(shù)都顯著低于健康對照組,并且這些miRNAs在血清中表達具有穩(wěn)定性。五、診斷試劑盒制備方法:根據(jù)上述一系列實驗結果,本發(fā)明人還制備了一種能用于地方性砷中毒早期動態(tài)監(jiān)測的診斷試劑盒,所述診斷試劑盒包含測定受試者血清外泌體中穩(wěn)定存在且可檢測的成熟hsa-miR-155、hsa-miR-191的引物和工具。診斷試劑盒包括一批血清外泌體miRNAs引物,還可以包括Taq酶、三磷酸堿基脫氧核苷酸等試劑的混合物。有益效果:本發(fā)明采用血清外泌體miRNAs作為地方性砷中毒早期評價的標志物的優(yōu)越性在于:(1)血清外泌體易于提取,需要血清量少,減少檢測者血清抽取量。(2)血清外泌體miRNAs是一種新型生物標志物,區(qū)別于傳統(tǒng)生物標志物,不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測,且定量精確,將大大提高地方性砷中毒早期診斷的敏感性和特異性,相比于傳統(tǒng)的生物標志物(例如mRNA和蛋白質),外泌體miRNAs更加穩(wěn)定并易于篩選及精確地定量分析,從而成為理想的新一代早期診斷和預后評估的生物標志物。(3)本發(fā)明提供的血清外泌體miRNA標志物可用作地方性砷中毒早期診斷標志物,可避免侵入性診斷,并可在早期進行輔助診斷,從而為臨床醫(yī)生進一步深入檢查提供依據(jù),為快速準確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴重程度、及時采取更具個性化的防治方案提供支持,延緩和阻止疾病進展。(4)本發(fā)明采用符合地方性砷中毒早期和健康對照人群的樣本進行驗證,證明這幾種標志物表達量存在顯著性差異并具有穩(wěn)定性,以說明該標志物具有特異性,可作為標志物使用。(5)本發(fā)明采用嚴密、多階段的驗證和評價體系,初期通過預實驗篩選多種血miRNAs,應用Real-timePCR等方法進行二次驗證和獨立人群驗證,保證了該血清外泌體miRNA生物標志物的可靠性。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例2的實驗效果圖。圖2為本發(fā)明實施例5的實驗效果圖。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步地說明。實施例1:對研究對象選擇和分組依據(jù)于2013年12月從合作單位貴陽醫(yī)學院搜集到符合要求的地方性砷中毒早期患者及健康對照組血液樣品,通過對樣品資料的整理,從中選擇了符合要求的80例健康對照、80例地方性砷中毒早期患者作為Real-timePCR檢測miRNAs表達的實驗對象。具體的樣品歸類標準如下:A組:健康對照組(n=80,20人芯片篩選,30人一期驗證,30人獨立人群驗證),無其他全身性重大疾病。B組:地方性砷中毒早期組(n=80,20人芯片篩選,30人一期驗證,30人獨立人群驗證),經(jīng)臨床診斷為地方性砷中毒早期,無其他全身性重大疾病。實施例2:血清外泌體的提取鑒定制備血清外泌體樣品:a)取250ul血清;b)加入63ulExoQuick試劑(4:1),輕輕混勻,4度孵育30分鐘-1小時,孵育后,1500g-10000g離心30分鐘-1小時,棄上層廢液;c)吸去上清后,再用1500g離心5分鐘,小心吸盡上層液體,并用原樣本體積的1/10的去離子水溶解沉淀;d)加入適量2.5%戊二醛4度冰箱固定2-3小時后,送去樣本檢測室進行透射電鏡檢測前處理,最終鑒定外泌體,如圖1所示。實施例3:外泌體RNA的提取制備外泌體RNA:a)提取的外泌體沉淀中加入1mlTrizol,混勻(反復吹打或渦旋),4℃放置10min;b)按比例(1mlTrizol:200ul氯仿)加入氯仿200ul,劇烈振蕩,4℃放置15min;c)4℃12000g離心15min,吸取上層水相至新EP管(350ml);d)按比例(1mlTrizol:500ul異丙醇)加入異丙醇500ul,混勻,4℃放置10min;e)4℃12000g離心10min,棄上清,RNA沉于管底;f)按比例(1mlTrizol:1ml75%乙醇)加入75%乙醇1ml,溫和振蕩;g)4℃12000g離心5min,盡量棄上清(重復75%乙醇洗滌一次);h)室溫晾干,加適量DEPC水溶解沉淀RNA;i)-70℃保存處理后的樣本。實施例4:TaqManmiRNAarray篩選制備cDNA樣品:通過RNA逆轉錄反應得到cDNA。逆轉錄的反應體系包括0.5μlmiRNA特定引物RT緩沖液、2μl5逆轉錄混合液(Vazyme公司)及無核酸酶水。反應步驟為50℃孵育15min,85℃孵育2min。(若針對不同miRNA則采用對應的miRNART引物按上述步驟進行)逆轉錄之后的按下表反應體系配制進行預擴增:預擴增的反應條件如下表所示:將預擴增產(chǎn)物簡短離心后,加入0.1×TE(pH8.0)75μl,顛倒混勻后再做簡短離心。預擴增產(chǎn)物可以直接用于下面的實時熒光定量PCR(qPCR)。預擴增產(chǎn)物進行qPCR按下表所示配制反應體系:*考慮到吸液損失而放量12.5%。檢測并比較健康對照、地方性砷中毒早期血清外泌體中miRNAs表達譜的差異,篩選出有3倍差異以上的miRNAs。經(jīng)生物信息學分析和動物實驗結果,選定其中2條作為候選并進行進一步驗證,具體為:hsa-miR-155、hsa-miR-191。實施例5:Real-timePCR方法測量血清外泌體miRNAs的表達量設計引物,分別對60例健康對照、60例地方性砷中毒患者的血清外泌體進行各miRNAs的定量Real-timePCR檢測。(1)制備cDNA樣品:提取的外泌體RNA逆轉錄反應得到cDNA。逆轉錄的反應體系包括0.5μlmiRNA特定引物緩沖液RT(20μM)、2μl5×逆轉錄混合液(Vazyme公司)及無核酸酶水。反應步驟為50℃孵育15min,85℃孵育2min。(2)Real-timePCR:染料法:取1μlcDNA模板,加入5μlSYBRGreen染料混合物Vazyme公司,0.2μlROX混合液,0.5μl20μM上述單一miRNA對應的正向引物,0.5μl20μM上述單一miRNA對應的反向引物,2.8μl無核酸酶水,10μl體系進行熒光定量PCR。使用的儀器是ABIPrism7300熒光定量PCR儀,PCR的反應條件是:95℃、20秒進行1個循環(huán)→95℃、10秒,60℃、20秒,70℃、30秒進行40個循環(huán)。檢測比較健康對照、地方性砷中毒早期患者血清外泌體樣本中miRNAs表達量的變化,各組樣品血清外泌體miRNAs的表達量比值可用方程2-(ΔΔCt)表示,其中ΔCt=Ct(group1)-Ct(group2)。為了保證每次實驗間的可比性,我們在每板上都設置了U6,以其表達量作為內參調整計算表達量。從結果分析得出,hsa-miR-155、hsa-miR-191這2條miRNAs在各組間均有顯著差別,如圖2所示,非參數(shù)的趨勢性檢驗也顯示了相同的差異。實施例6用于地方性砷中毒早期診斷和監(jiān)測的miRNA診斷試劑盒的制作:首先通過測序的方法和Real-timePCR方法確定正常人和地方性砷中毒早期患者血清外泌體中有一個以上拷貝的miRNA。然后通過定量PCR等技術篩選與地方性砷中毒早期相關的一類人血清外泌體miRNA,作為預測是否患有地方性砷中毒早期以及診斷的指標。最后篩選出對應的血清miRNA的數(shù)量控制在幾條,這是在預實驗的基礎上做出的最優(yōu)化的精簡。此試劑盒包括一批血清miRNA引物,其中miRNA的引物包括hsa-miR-155、hsa-miR-191、U6的正反向引物(見表1)。還可以有相關PCR技術常用的試劑,如Taq酶、PCR緩沖液、MgCl2、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合液、染料等試劑,這些試劑也可采用相應的市售產(chǎn)品,也可以購買所需試劑的混合液。此類試劑盒的價值在于只需要一次抽出少量(1~2ml)血液,即可檢測血清外泌體miRNA標志物的變化趨勢,再通過該變化趨勢預測地方性砷中毒早期發(fā)生可能性或診斷地方性砷中毒早期病,并易于進行動態(tài)監(jiān)測和觀察治療效果。具體試劑盒組成如下:以下兩對引物:SEQIDNO.3和SEQIDNO.4,SEQIDNO.5和SEQIDNO.6,各20μM0.5μl。試劑盒中還可以含有5逆轉錄混合液(Vazyme公司)及無核酸酶水。試劑盒中還可以含有內參U6的正反向引物一對(表1)。或者試劑盒中除正向引物外還含有0.5μl20μM通用反向引物,10μlTaqMan通用PCR混合液,6.6μlH2O。試劑盒中的組分除引物外的試劑可以采用現(xiàn)有技術中用于miRNA含量檢測的相應試劑。在上述一系列研究結果的基礎上,本發(fā)明人證明了采用hsa-miR-155、hsa-miR-191能夠很好地將地方性砷中毒早期患者和健康對照分開。表1引物名稱對應miRNA引物序列hsa-miR-155-FACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAThsa-miR-155-RCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCCTAThsa-miR-191-FACACTCCAGCTGGGCAACGGAATCCCAAAAGhsa-miR-191-RCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGCTGCTURPTGGTGTCGTGGAGTCGU6-FCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACU6-RGCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCF:上游引物,R:下游引物。序列表<110>南京醫(yī)科大學<120>血清外泌體miRNAs標志物在地方性砷中毒早期診斷中的應用<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>RNA<213>hsa-miR-155<400>1uuaaugcuaaucgugauaggggu23<210>2<211>23<212>RNA<213>hsa-miR-191<400>2caacggaaucccaaaagcagcug23<210>3<211>31<212>RNA<213>hsa-miR-155上游引物<400>3acactccagctgggttaatgctaatcgtgat31<210>4<211>44<212>RNA<213>hsa-miR-155下游引物<400>4ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacccctat44<210>5<211>31<212>RNA<213>hsa-miR-191上游引物<400>5acactccagctgggcaacggaatcccaaaag31<210>6<211>44<212>RNA<213>hsa-miR-191下游引物<400>6ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagcagctgct44當前第1頁1 2 3 
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