Il-17f基因?qū)崟r(shí)熒光pcr檢測(cè)引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種IL-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，所用的正反引物如下：正向引物（SEQIDNO.1）:5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3；反向引物（SEQINNO.2）:5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTCT-3；利用還有利用本引物的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒和方法，本發(fā)明所采用的PCR試劑盒，適用于一般的熒光PCR儀器，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；檢測(cè)的成本低，特異性和敏感性高，適合大范圍的普及使用。
【專利說明】IL-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物及試劑盒
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于基因表達(dá)領(lǐng)域，尤其是涉及IL-17F基因PCR檢測(cè)引物。
【背景技術(shù)】
[0003]白介素17(IL-17)是一種炎癥前因子，其家族成員在自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)及炎癥中起著重要作用，IL-17普遍存在與Thl7細(xì)胞、⑶8記憶T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中，主要來源于Thl7細(xì)胞家族。IL-17家族成員主要包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17C、IL-17D 和 IL-17E、IL-17F。目前，研究發(fā)現(xiàn) IL-17F 在哮喘中扮演重要角色，作為哮喘的促炎因子。IL-17F經(jīng)常在哮喘病人的氣管中出現(xiàn)，并且其嚴(yán)重程度與IL-17F濃度相關(guān)；IL-17F可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子，包括趨化因子、粘結(jié)因子等；在小鼠IL-17F過量表達(dá)時(shí)與出現(xiàn)氣管的中性粒細(xì)胞增多、和誘導(dǎo)多種相關(guān)促炎因子表達(dá)增加；IL-17F成為哮喘治療和診斷的主要分子標(biāo)記。
[0004]目前IL-17F的檢測(cè)中，目前沒有有效的引物進(jìn)行檢測(cè)，并利用傳統(tǒng)的抗體檢測(cè)方法，但是此方法費(fèi)用較高，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，并且并利用大范圍的使用。RT-PCR是研究檢測(cè)特定基因表達(dá)的一個(gè)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法。通過RT-PCR在mRNA
水平上檢測(cè)某個(gè)基因的表達(dá)情況，可以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的在于提供用于檢測(cè)IL-17F基因表達(dá)的引物。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
IL-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，所用的正反引物如下:
正向引物(SEQ ID N0.1):5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3 反向引物(SEQ IN N0.2):5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTCT-3?
[0007]IL-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其包括一種混合試劑，所述的混合試劑包括:SYBR Premix Ex Taq II (2X)、、正向引物 10 μ M、反向引物 10μΜο
[0008]所述的正向引物和反向引物為上述的引物。
[0009]IL-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，具體步驟為:
1)提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；
2)反應(yīng)體系:取2μI步驟I)制得的模板cDNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液12 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積20 μ I ;將以上各組分加入至0.2mL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，
短暫離心；
3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，具體反應(yīng)提交如下:
950C /!Os, I 次循環(huán)；95°C /50s,66°C /60s,40 次循環(huán)。[0010]本發(fā)明采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)IL-17A基因進(jìn)行鑒定，具有檢測(cè)實(shí)時(shí)性和高效性，并可以對(duì)早期IL-17A基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，用于早期判斷自身免疫性疾病，另外可以對(duì)病人進(jìn)行個(gè)性診斷和治療過程中，IL-17A的基因表達(dá)情況的檢測(cè)，并判斷病人復(fù)發(fā)和加重病情的可能性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]附圖1為檢測(cè)樣品1-6實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)曲線；
附圖2為檢測(cè)樣品1-6和陰性對(duì)照對(duì)比圖表。
【具體實(shí)施方式】[0012]結(jié)合實(shí)施例對(duì)發(fā)明申請(qǐng)做進(jìn)一步的說明。
[0013]設(shè)計(jì)IL-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，所用的正反引物如下:
正向引物(SEQ ID N0.1):5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3
反向引物(SEQ IN N0.2):5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTCT-3?
[0014]IL-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其包括一種混合試劑，所述的混合試劑包括:SYBR Premix Ex Taq II (2X)、、正向引物 10 μ M、反向引物 10μΜο
[0015]實(shí)施例1
I)提取6位哮喘病人血清樣品，標(biāo)記為1-6，2位正常人血清作為陰性對(duì)照；分別提取各樣品的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0016]2)取步驟I)中所述的取2μ I步驟I)制得的模板cDNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液12 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積20 μ I ;將以上各組分加入至0.2mL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，短暫離心；
3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，具體反應(yīng)提交如下:
950C /10s，I 次循環(huán)；95°C /50s,66°C /60s,40 次循環(huán)。
[0017]結(jié)果分析:
對(duì)得到實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的曲線進(jìn)行分析；并對(duì)檢測(cè)樣品和陰性對(duì)照的熒光進(jìn)行分析。
[0018]其中，如圖1和圖2所示，圖1中所得的熒光PCR擴(kuò)增曲線的特異性較好，并通過附圖2中的與陰性對(duì)照比較，所得哮喘病人IL-17F基因表達(dá)較正常高。所得結(jié)果有利于針對(duì)對(duì)IL-17F因子的個(gè)性化治療病人。
【權(quán)利要求】
1.1L-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，其特征是:所述的正反引物如下:
正向引物(SEQ ID N0.1):5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3,
反向引物(SEQ IN N0.2):5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTCT-3。
2.1L-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征是:其包括一種混合試劑，所述的混合試劑包括:SYBR Premix Ex Taq II (2X )、、正向引物10 μ Μ、反向引物10 μ M ; 所述的正向引物和反向引物為權(quán)利要求1所述的引物。
3.1L-17F基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是，具體步驟為: 1)提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA； 2)反應(yīng)體系:取2μ I步驟I)制得的模板cDNA溶液，加入權(quán)利要2所述的試劑盒中的溶液11.2 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積20 μ I ;將以上各組分加入至0.2mL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，短暫離心； 3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，具體反應(yīng)提交如下:
950C /!Os, I 次循環(huán)；95°C /50s, 66°C /60s, 35 次循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103498007SQ201310504426
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】周世亮 申請(qǐng)人:周世亮