Il-17a基因?qū)崟r(shí)熒光pcr檢測(cè)引物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了IL-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，序列如下：正向引物(SEQIDNO:1)：5-GTTAGGGTGCTTTAGGTCC-3；反向引物(SEQIDNO:2)：5-TAACAATGAGTTTCTGTACG-3；還有利用上述引物進(jìn)行IL-17A基因檢測(cè)的試劑盒和方法。本發(fā)明采用SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)IL-17A基因進(jìn)行鑒定，具有檢測(cè)實(shí)時(shí)性和高效性，并可以對(duì)早期IL-17A基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，用于早期判斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
【專利說明】IL-1 7A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和試劑盒
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)，尤其是涉及IL-17基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003]白細(xì)胞激素-17 (IL-17)是一種前炎癥細(xì)胞因子，通過刺激靶細(xì)胞釋放前炎癥細(xì)胞因子及動(dòng)員中性粒細(xì)胞因子發(fā)揮作用，誘導(dǎo)IL-6，一氧化氮和前列腺素產(chǎn)生，同上上調(diào)IL-1，TNF-a，和干擾素等炎癥細(xì)胞因子的基因表，促進(jìn)局部炎癥的緊張和擴(kuò)大，促進(jìn)NO的合成，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集與炎癥部位。
[0004]但是，目前發(fā)現(xiàn)IL-17A與多種炎癥性及自身免疫性疾病相關(guān)，主要包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和椎間盤退變等。IL-17A在RA的發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用，可導(dǎo)致血管新生、滑膜增生、軟骨破壞及骨吸收增加?；ぶ械腎L-17A的mRNA水平可以預(yù)測(cè)關(guān)節(jié)破壞的嚴(yán)重程度，損害程度，IL-17A是判斷RA病情程度的重要指標(biāo)之一。
[0005]目前IL-17A檢測(cè)方法過于局限，目前只是針對(duì)骨膜進(jìn)行直接抗體性檢測(cè)，檢測(cè)周期長(zhǎng)，費(fèi)用較高，病人的承受度也較低；本發(fā)明提供的IL-17A基因PCR檢測(cè)方法，周期短，在病人進(jìn)行血液生化檢測(cè)時(shí)，同時(shí)完成IL-17A的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種IL-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和試劑盒。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
IL-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，序列如下:
正向引物(SEQ ID NO:1):5-GTTAGGGTGCTTTAGGTCC-3 ；
反向引物(SEQ ID NO:2):5-TAACAATGAGTTTCTGTACG-3。
[0008]IL-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其包括
其包括一種混合試劑，所述的混合試劑包括:SYBR Premix Ex Taq II (2X)、、正向引物ΙΟμΜ、反向引物10 μ M0
[0009]所述的正向引物和反向引物為上述的引物。
[0010]IL-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，具體步驟為:
1)提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；
2)反應(yīng)體系:取2μI步驟I)制得的模板cDNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液12 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積20 μ I ;將以上各組分加入至0.2mL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，
短暫離心；
3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，具體反應(yīng)提交如下:94°C /30s, I 次循環(huán)；95°C /100s,66°C /120s,40 次循環(huán)。
[0011]本發(fā)明采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)IL-17A基因進(jìn)行鑒定，具有檢測(cè)實(shí)時(shí)性和高效性，并可以對(duì)早期IL-17A基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，用于早期判斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，另外可以對(duì)病人進(jìn)行個(gè)性診斷和治療過程中，1L-17A的基因表達(dá)情況的檢測(cè)，并判斷病人復(fù)發(fā)和加重病情的可能性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]附圖1為檢測(cè)樣品1-6實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)曲線；
附圖2為檢測(cè)樣品1-6和陰性對(duì)照對(duì)比圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0013]設(shè)計(jì)IL-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，序列如下:
正向引物(SEQ ID NO:1):5-GTTAGGGTGCTTTAGGTCC-3 ；
反向引物(SEQ ID NO:2):5-TAACAATGAGTTTCTGTACG-3。
[0014]IL-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其包括
其包括一種混合試劑，所述的混合試劑包括:SYBR Premix Ex Taq II (2X)、、正向引物ΙΟμΜ、反向引物10 μ M0
[0015]所述的正向引物和反向引物為上述的引物。
`[0016]實(shí)施例1
I)提取5位類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血清樣品，標(biāo)記為1-5，2位正常人血清作為陰性對(duì)照；分別提取各樣品的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0017]2)取步驟I)中所述的取2μ I步驟I)制得的模板cDNA溶液，加入上述試劑盒中的溶液12 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積20 μ I ;將以上各組分加入至0.2mL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，短暫離心；
3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，具體反應(yīng)提交如下:
940C /30s, I 次循環(huán)；95°C /100s,66°C /120s,40 次循環(huán)。
[0018]結(jié)果分析:
對(duì)得到實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的曲線進(jìn)行分析；并對(duì)檢測(cè)樣品和陰性對(duì)照的熒光進(jìn)行分析。
[0019]其中，如圖1和圖2所示，圖1中所得的熒光PCR擴(kuò)增曲線的特異性較好，并通過附圖2中的與陰性對(duì)照比較，所得哮喘病人IL-17A基因表達(dá)較正常高。所得結(jié)果有利于針對(duì)IL-17A因子的個(gè)性化治療病人。
【權(quán)利要求】
1.1L-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，其特征是，序列如下:
正向引物(SEQ ID NO:1):5-GTTAGGGTGCTTTAGGTCC-3 ； 反向引物(SEQ ID NO:2):5-TAACAATGAGTTTCTGTACG-3。
2.1L-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征是，其包括 其包括一種混合試劑，所述的混合試劑包括:SYBR Premix Ex Taq II (2X)、、正向引物10 μ M、反向引物ΙΟμΜ ； 所述的正向引物和反向引物為權(quán)利要求1所述的引物。
3.1L-17A基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是，具體步驟為: 1)提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA； 2)反應(yīng)體系:取2μ I步驟I)制得的模板cDNA溶液，加入權(quán)利要求2所述的試劑盒中的溶液12 μ 1，再加入滅菌超純水至總體積20 μ I ;將以上各組分加入至0.2mL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，短暫離心； 3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，具體反應(yīng)提交如下: 940C /30s, I 次循環(huán)；95°C /100s,66°C /120s,40 次循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103484562SQ201310504331
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】周世亮 申請(qǐng)人:周世亮