本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說，涉及與玉米粗縮病抗性相關(guān)的kasp分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

玉米粗縮病(maizeroughdwarfdisease,mrdd)是全球玉米種植區(qū)廣泛發(fā)生的病毒性病害。玉米幼苗期感染粗縮病病毒后，植株嚴(yán)重矮化，節(jié)間變短、變粗；葉背出現(xiàn)白色蠟淚狀脈突、葉面粗糙、葉色濃綠、葉片縮短；植株根數(shù)少、不發(fā)次生根、且有根縱裂；常不能抽穗或雌穗極小、變形、雄花少或無花粉，大幅度減產(chǎn)或者絕產(chǎn)。

近幾年，隨著農(nóng)業(yè)氣候的變化和黃淮海區(qū)農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)的改變，玉米粗縮病病情又呈上升趨勢，尤其在河北、山東、江蘇等地區(qū)發(fā)生更為嚴(yán)重。目前，粗縮病已經(jīng)成為我國主要玉米病害之一，對玉米生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

玉米粗縮病抗性鑒定主要有田間自然傳毒鑒定和人工接種鑒定兩種。田間自然發(fā)病鑒定主要是在粗縮病高發(fā)病區(qū)進(jìn)行田間自然傳毒鑒定，玉米粗縮病人工接種鑒定目前成熟的方法是通過帶毒灰飛虱在玉米幼苗上傳毒接種，1頭帶毒灰飛虱傳毒可使整個玉米植株發(fā)病，在網(wǎng)箱內(nèi)釋放灰飛虱接種2葉1心期玉米幼苗，4葉期移栽至田間，發(fā)病率可達(dá)92.3％～100％。

然而，田間自然傳毒鑒定方法雖然方便快捷，但往往受環(huán)境條件、灰飛虱發(fā)生及遷飛數(shù)量等因素的制約，影響鑒定的準(zhǔn)確性和抗病品種的篩選。同時不同年份和不同地區(qū)病害的發(fā)生情況有所不同，在不同環(huán)境條件下自然發(fā)病鑒定玉米種質(zhì)資源抗病性時，相同材料通常得到不一致的鑒定結(jié)果。因此該方法進(jìn)行病情預(yù)測和植株抗病性鑒定難度較大，常致使玉米粗縮病的研究工作不能順利進(jìn)行。相對于田間傳毒鑒定，人工接種鑒定的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，但是常受到鑒定規(guī)模小和帶毒灰飛虱數(shù)量少等因素控制。

玉米抗粗縮病性狀為數(shù)量性狀，在性狀表達(dá)中起主導(dǎo)作用的是微效基因的加性效應(yīng)。因此，若將多個微效基因集中于單個自交系中就能顯著提高其抗病性。但是利用傳統(tǒng)的定向輪回選擇法對粗縮病抗性進(jìn)行改良選擇效率低，同時受鑒定條件的制約，選擇結(jié)果不易掌控。通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法能有效地提高抗粗縮病選擇的效率。分子標(biāo)記輔助選擇利用與抗病qtl緊密連鎖的分子標(biāo)記對群體中含有抗病qtl的單株進(jìn)行追蹤，用標(biāo)記的基因型來確定單株的抗病性。

傳統(tǒng)的分子標(biāo)記輔助選擇存在一定的局限性，以ssr標(biāo)記為例：1.與抗病qtl緊密連鎖的ssr分子標(biāo)記在后代群體中有可能發(fā)成重組，造成分子標(biāo)記輔助選擇的偏差；2.與抗病qtl緊密連鎖的ssr標(biāo)記并不是功能標(biāo)記，只能對在該標(biāo)記位點具有多態(tài)性的親本的后代群體進(jìn)行選擇；3.ssr分子標(biāo)記基因型檢測往往采用聚丙烯酰胺凝膠技術(shù)進(jìn)行檢測，但是這種檢測方法操作流程比較繁瑣，而且檢測過程中涉及有毒試劑的使用，會對人體健康造成有一定的威脅；4.由于ssr分子標(biāo)記的特點和其檢測流程的復(fù)雜性，難以實現(xiàn)高通量檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供與玉米粗縮病抗性相關(guān)的kasp分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了與玉米粗縮病抗性相關(guān)的kasp分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記定位于玉米第8號染色體上，命名為csb-2、csb-5、csb-6和csb-7。

所述csb-2如seqidno.1所示，其中，在第201bp處發(fā)生g→a的突變，堿基a為抗粗縮病玉米材料所特有；所述csb-5如seqidno.2所示，其中，在第204bp處發(fā)生ttaaatat的插入，插入片段為抗粗縮病玉米材料所特有；所述csb-6如seqidno.3所示，其中，在第201bp處發(fā)生c→g突變，堿基g為抗粗縮病玉米材料所特有；所述csb-7如seqidno.4所示，其中，在第101bp處發(fā)生seqidno.5所示的轉(zhuǎn)座子序列插入突變后，表現(xiàn)出玉米粗縮病抗性。

具體如下所示：

注：csb-7轉(zhuǎn)座子序列長度為2.5kb，由于表格篇幅有限，將部分堿

基序列省去以“……”代替，詳細(xì)堿基序列參照表1。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于擴(kuò)增前述分子標(biāo)記的特異性引物(表2)，擴(kuò)增csb-2分子標(biāo)記的引物如seqidno.6～8所示，擴(kuò)增csb-5分子標(biāo)記的引物如seqidno.9～11所示，擴(kuò)增csb-6分子標(biāo)記的引物如seqidno.12～14所示，擴(kuò)增csb-7分子標(biāo)記的引物如seqidno.15～18所示。

第二方面，基于前述研究成果，本發(fā)明提供了所述分子標(biāo)記在玉米粗縮病種質(zhì)材料抗性鑒定或抗性基因檢測中的應(yīng)用。

以及所述分子標(biāo)記在玉米粗縮病抗性標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

具體表現(xiàn)為，一種玉米粗縮病抗性標(biāo)記輔助育種方法，包括檢測前述分子標(biāo)記的步驟。

所述方法的具體步驟如下：

(1)獲得待測樣品基因組dna；

(2)以基因組dna為模板，利用權(quán)利要求2所述的引物進(jìn)行競爭性等位基因特異性pcr(kasp,kompetitiveallelespecificpcr)反應(yīng)擴(kuò)增；

(3)pcr反應(yīng)結(jié)束后，收集每個反應(yīng)孔產(chǎn)生的熒光信號，根據(jù)熒光信號的類型判斷分子標(biāo)記的基因型，進(jìn)而確定樣品對粗縮病的抗性。

本發(fā)明涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了與玉米粗縮病抗性相關(guān)的kasp分子標(biāo)記，可用于粗縮病抗病分子育種和玉米種質(zhì)資源分析，同時具有成本相對較低和應(yīng)用靈活性高的特點，可實現(xiàn)高通量檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明采用的kasp引物設(shè)計的方法和原理。

圖2為本發(fā)明利用kasp引物csb-5對165份玉米材料的檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

根據(jù)前人研究已知，粗縮病抗病基因和感病基因相比有一片段大小為2.5kb的轉(zhuǎn)座子插入，該轉(zhuǎn)座子插入使玉米對粗縮病產(chǎn)生抗性，是抗病基因的功能位點。本發(fā)明通過比對已經(jīng)克隆的粗縮病抗病基因和感病基因的序列，找出兩條基因序列之間的5個snp位點、1個小片段插入/缺失位點和1個轉(zhuǎn)座子的插入/缺失位點，共計7個序列差異位點，見表1。

表1抗病基因與感病基因序列比對

注：差異位點如下劃線標(biāo)記所示。

根據(jù)上述7個序列差異位點的特點和類型進(jìn)行kasp引物設(shè)計，用于檢測這7個序列差異位點的基因型。

提取上述7個差異位點及兩側(cè)各100bp的堿基序列，將7條序列分別與玉米b73_agpv3參考基因組進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示，這7條序列都只能比對到基因組上唯一的物理位置，是非重復(fù)序列，因此可以對這7條序列進(jìn)行引物設(shè)計。引物設(shè)計采用kasp引物設(shè)計原理，方法如圖1，設(shè)計完成后合成kasp引物，編號分別為csb-1引物，csb-2引物，csb-3引物，csb-4引物，csb-5引物，csb-6引物，csb-7引物。引物列表見表2。

表2

引物擴(kuò)增的結(jié)果以熒光信號的形式展現(xiàn)，根據(jù)熒光信號的顏色判斷突變位點的基因型，如圖2。

實施例2

選取165份玉米材料(其中有兩份為已知具有粗縮病抗性的自交系，有兩份為粗縮病感病自交系)。分別采用已有的粗縮病抗病基因特異引物和設(shè)計的kasp引物csb-1，csb-2，csb-3，csb-4，csb-5，csb-6，csb-7對這165份材料進(jìn)行基因型檢測，檢測結(jié)果顯示kasp引物csb-2，csb-5，csb-6，csb-7的檢測結(jié)果與粗縮病抗病基因特異引物的檢測結(jié)果一致，其中已知的兩份抗病材料檢測為抗病的基因型，兩份感病材料檢測為感病的基因型，說明kasp引物csb-2，csb-5，csb-6，csb-7可以特異地區(qū)分粗縮病抗病材料和感病材料。

實施例3

對1500份玉米材料進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示這四個標(biāo)記在這1500份玉米材料中檢測出的基因型一致，陽性對照，陰性對照和空白對照的基因型與預(yù)期一致。從中篩選出492份抗粗縮病的玉米材料，見表3。

表3

實施例4高通量的分子育種方法

利用開發(fā)的抗粗縮病kasp分子標(biāo)記，結(jié)合高通量的dna提取方法，lgc高通量分子標(biāo)記基因型分型平臺，實現(xiàn)了玉米抗粗縮病的高通量分子育種。主要流程如下：

樣品準(zhǔn)備。對玉米籽粒單粒進(jìn)行取樣，剪取玉米籽粒的部分胚乳，在不傷害胚的情況下，該籽?？梢岳^續(xù)種植。

dna快速提取。采用hotshot法對玉米籽粒單粒進(jìn)行快速dna提取。hotshot提取dna的方法不僅在試劑耗材成本上低廉，而且整個流程的耗時非常短，在大規(guī)模提取dna時可以節(jié)省大量的人力物力和時間。

高通量分子標(biāo)記檢測。利用lgc生產(chǎn)的高通量實時熒光檢測系統(tǒng)和水浴pcr儀，對dna樣品進(jìn)行高通量的分子標(biāo)記檢測

優(yōu)良樣品追蹤。根據(jù)對dna的分子標(biāo)記檢測的結(jié)果，追蹤到相應(yīng)的玉米籽粒，在育種時只對優(yōu)良的玉米籽粒進(jìn)行播種，可以節(jié)省50％-75％的播種面積。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司

<120>與玉米粗縮病抗性相關(guān)的kasp分子標(biāo)記及其應(yīng)用

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