本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種基于二代高通量測序技術(shù)的檢測疾病患者體內(nèi)腸道菌群多樣性的技術(shù)和方法。
背景技術(shù)：
：腸道內(nèi)數(shù)以億計的微生物及其代謝產(chǎn)物在人體能量代謝、營養(yǎng)物質(zhì)吸收、先天和獲得性免疫、胃腸道功能等方面發(fā)揮著重要作用,一旦宿主與腸道微生物之間共棲共生的穩(wěn)態(tài)被打破,就會誘發(fā)多種人類疾病。目前已經(jīng)認(rèn)識到腸道微生物與人類健康和疾病的密切關(guān)系,僅僅從人類自身角度出發(fā)來研究人類疾病遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,必須考慮到與人類共棲共生的腸道微生物的作用。目前應(yīng)用于人體腸道微生物的多樣性及差異化的研究方法較多，主要有傳統(tǒng)檢測方法、構(gòu)建基因文庫法、遺傳指紋圖譜技術(shù)、分子雜交技術(shù)和dna測序技術(shù)等方法。其中傳統(tǒng)微生物檢測方法是用各種培養(yǎng)基培養(yǎng)分離微生物，并通過革蘭染色、生物化學(xué)和血清學(xué)試驗等方法來確定微生物種類，通過倍比稀釋、菌落計數(shù)等方法來測定微生物數(shù)量。但由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)中，菌株的富集或衰減不可避免，原始的微生態(tài)結(jié)構(gòu)被改變，這會導(dǎo)致研究結(jié)果存在較大偏差。綜上所述，應(yīng)用和開發(fā)針對疾病患者腸道菌群的多樣性及差異性的檢測方法，能夠為人們更好的了解腸道微生物以及疾病之間的相互關(guān)系的技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的即在于提供一種針對泌尿系統(tǒng)疾病患者腸道菌群的多樣性及差異性的檢測方法。本發(fā)明的再一個目的是提供一種通過設(shè)計特異性引物(人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條dna模板鏈互補(bǔ)，另一個引物與目的基因另一端的另一條dna模板鏈互補(bǔ))，適用于多種類疾病患者腸道菌群的多樣性及差異性的檢測方法。本發(fā)明的又一個目的在于為人們更好的了解腸道微生物以及疾病之間的相互關(guān)系的技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。1.在本發(fā)明中，所述引物對(上、下游引物統(tǒng)稱為一對引物)不限于由所述序列所示的兩條單鏈dna分子組成的引物對，只要是能夠特異性擴(kuò)增所有需要檢驗的微生物來源的引物對均可。本發(fā)明提供了一種檢測自閉癥患兒及其父母的腸道菌群的多樣性及差異性的特異性引物對，其特征在于，所述引物對是能夠特異性擴(kuò)增所有需要檢驗的微生物來源的引物對。所述引物對是由兩條單鏈dna分子序列組成的引物對。所述引物對的上游引物為：5’-agagtttgatcmtggctcag-3’；下游引物為：5’-gctgcctcccgtaggagt-3’。所述的引物對，用于生物技術(shù)及檢測領(lǐng)域，通過二代高通量測序技術(shù)，精準(zhǔn)檢測自閉癥患兒及其父母的腸道菌群的多樣性及差異性。2.本發(fā)明還提供一種判定待測疾病患者體內(nèi)腸道菌群的多樣性及差異性的方法，其特征在于包括以下步驟，(1)提供一待測糞便樣品；(2)從所述糞便樣品中，提取其樣本dna；(3)配置pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行pcr反應(yīng)；(4)對于pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行目標(biāo)片段的檢測；(5)對于有目的片段的pcr產(chǎn)物進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化；(6)以步驟5中pcr產(chǎn)物為檢測對象，用二代高通量測序技術(shù)進(jìn)行糞便樣本中的微生物種類的檢測；(7)對于二代測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及處理。3.本發(fā)明所述糞便樣本的采集及糞便樣本dna的提取方法為：(1)所述糞便樣本的采集方法具體為：1)糞便排入一個清潔且干燥的容器內(nèi)。注：容器內(nèi)不能混入尿液。2)用采樣管中的小勺來收集糞便，為防止糞便表層污染，需用取樣勺輕輕扒開表層，在糞便內(nèi)部取樣，將裝有糞便的小勺放入采樣管中。3)將采樣管的蓋擰緊，做好信息記錄，包括被采樣者姓名、住院號及采樣時間。(2)所述糞便dna提取方法具體為：用2.0克左右的糞便樣本，選擇用改進(jìn)的ctab抽提法進(jìn)行樣本dna的提取。1)將凍存管內(nèi)的取樣勺取出(盡量涮洗干凈，不留樣品)12000轉(zhuǎn)速，離心2分鐘。2)用移液槍吸出乙醇(盡量吸干凈)，加入300微克65℃預(yù)熱的2×ctab攪拌震蕩為懸濁液。3)ep管纏繞封口膜后95℃水浴加熱8分鐘。4)加入300微升酚仿(取下層)混合液，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)速，離心5分鐘；5)將上清液200ul移至新的1.5毫升無菌離心管中，加入3倍體積(600微升)的溶膠液，振蕩混勻，分兩次(每次約400微升)移入硅質(zhì)柱，靜置2分鐘，12000轉(zhuǎn)速離心30秒；6)棄液體，在硅質(zhì)柱中加入約400微升的洗滌液，12000轉(zhuǎn)速離心30秒；7)重復(fù)前一步驟；8)棄回收管內(nèi)廢液，空管離心，12000轉(zhuǎn)速離心2分鐘；9)將硅質(zhì)柱移入新的1.5毫升無菌離心管，加入60微升te洗脫液，(te洗脫液需提前65℃水浴)，12000轉(zhuǎn)速離心30秒；10)離心管中收集的60微升液體，即為dna模版，于-20℃冰箱保存。4.本發(fā)明所述dna含量的判定具體為：(1)對提取出的dna進(jìn)行nanodrop2000分光光度計檢測其純度，發(fā)現(xiàn)1.6＜o(jì)d260/280＜2.0，提取dna濃度均＞10納克/微升。(2)所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)為單重pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系包含：10×buffer，正向引物和反向引物，dna模板，dntp，taq酶，滅菌蒸餾水。提取的dna為模板，用所述的引物、進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增。(3)所述的pcr反應(yīng)的50微升的反應(yīng)體系包括：試劑使用量終濃度taq酶溶液0.8微升上游引物(10微摩)0.5微升0.1微摩下游引物(10微摩)0.5微升0.1微摩10×buffer溶液5微升dna模板2微升dntp溶液4微升滅菌蒸餾水37.2微升總體積15微升反應(yīng)體系共：50微升。(4)所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為：(5)所述的pcr反應(yīng)的目標(biāo)片段進(jìn)行檢測使用的方法是瓊脂糖凝膠電泳方法。(6)所述的pcr產(chǎn)物純化的具體實施步驟為：1)將pcr反應(yīng)液移至一干凈的1.5毫升的離心管中，加入240微升的bufferb3(從-20度冰箱取出)，充分混勻。2)將混合液全部移入吸附柱，靜置2分鐘后，9000×g離心30秒，將濾出液再次加入吸附柱中，再次過柱子，將吸附柱放入同一收集管中。3)向吸附柱中加入500微升的washsolution，9000×g離心30秒，棄掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一離心管中，并重復(fù)一次。4)將空吸附柱及收集管放入離心機(jī)，9000×g離心1分鐘。5)在吸附膜中央加入30微升te，室溫靜置2分鐘，9000×g離心1分鐘。將得到的dna置于-20度保存。5.本發(fā)明所述的二代測序的基本步驟為：(1)測序文庫構(gòu)建1)取dna模板79微升(共100納克)在1.5毫升低吸附的管子內(nèi)混合試劑成分，充分混勻后在室溫下孵育20分鐘。2)使用試劑來純化補(bǔ)平的dna，用1.8倍體積的磁珠到樣本中進(jìn)行純化。3)dna的末端修復(fù)以及片段上鏈接p和a接頭，在0.2毫升低吸附的管子內(nèi)混合試劑成分，充分混勻后再進(jìn)行pcr反應(yīng)。4)使用試劑來純化補(bǔ)平的dna，用1.0倍體積的磁珠到樣本中進(jìn)行純化。5)定量pcr方法定量文庫濃度，用熒光定量pcr的方法對于構(gòu)建好的文庫進(jìn)行定量，并根據(jù)定量的結(jié)果將文庫稀釋到100皮摩爾。(2)模板制備1)iononetouch2儀器準(zhǔn)備，將儀器電源打開后，進(jìn)行初始化。在初始化的過程中，注意廢液收集管中收集到的廢液的體積。2)添加iononetouchoil和ionpgmot2recorverysolution，在添加這些試劑前應(yīng)充分的將試劑顛倒混勻。3)擴(kuò)增反應(yīng)液準(zhǔn)備，按照實驗操作手冊，將擴(kuò)增反應(yīng)液依次加入反應(yīng)容器中，并顛倒混勻3次。4)運(yùn)行iononetouch2，在運(yùn)行儀器時應(yīng)注意，選擇本次測序所對應(yīng)的試劑盒類型：ionpgmtemplateot2400kit。(3)模板富集1)回收ionpgmtemplateot2400sphereparticles，按照操作說明中注意的問題，將isp模板進(jìn)行回收。2)配置melt-off溶液，取1.5ml離心管，按操作說明進(jìn)行配置。3)準(zhǔn)備dynabeadsmyonestreptavidinc1beads,將dynabeadsmyonestreptavidinc1beads充分震蕩后，吸取13微升于1.5毫升離心管中，置于磁力架上，將酒精取出后，加入dynabeadsmyonestreptavidinc1beadswashsolution130μl，然后充分震蕩混勻即可。4)準(zhǔn)備模板富集八連排，按照操作說明將8個孔內(nèi)的試劑依次加入即可。5)運(yùn)行es，將八連排放入凹槽，然后在收集管里加入10微升的中和緩沖液。6)運(yùn)行結(jié)束后，立即將收集管從儀器上取下，然后將試劑充分吹吸混勻。(4)上機(jī)測序1)打開pgm測序儀后，首先進(jìn)行pgm水洗。在w1中加入250毫升的18mω的去離子水，然后按下水洗按鈕即可。2)進(jìn)行pgm的初始化，按照操作說明，將w1、w2、w3中加入對應(yīng)的試劑，將一張干凈的芯片進(jìn)行初始化。在進(jìn)行初始化時，應(yīng)確保選擇的試劑類型與本次測序相匹配。3)準(zhǔn)備dntp溶液，在每個50ml的離心管里加入20微升的dntp溶液，然后換上新的sipper，旋緊。4)測序程序設(shè)定，用電腦訪問測序儀所對應(yīng)的服務(wù)器，然后根據(jù)本次測序所用的試劑、耗材，以及后續(xù)分析所要求的結(jié)果，進(jìn)行測序程序的設(shè)定。5)芯片的檢驗，取一張全新的芯片，然后做芯片檢測，如果通過，說明芯片沒有問題，可以進(jìn)行后續(xù)實驗步驟。6)上樣模板準(zhǔn)備，向所有的isp中加入controlionsphereparticles，作為對照。加入測序引物，進(jìn)行pcr反應(yīng)，使二者可以連接。在加入3微升的酶，然后室溫靜置5分鐘即可。7)芯片處理，將做完芯片檢測的芯片從測序儀上取下，將里面的液體吸出。8)芯片上樣，用移液器將30微升的樣本緩慢的旋入芯片內(nèi)，然后在甩片機(jī)上進(jìn)行進(jìn)樣孔朝向里-外-里三次甩片。9)運(yùn)行測序程序，將上樣好的芯片放在測序儀上，操作顯示屏，選擇之前設(shè)定好的測序程序，進(jìn)行測序。6.本發(fā)明所述引物在生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，提供了一種基于二代高通量測序技術(shù)，檢測疾病患者腸道菌群的多樣性及差異性的方法。在上述方法中，所述待測樣本可為疾病家系和正常家系的糞便樣本。如兒童自閉癥等。本發(fā)明在二代高通量測序的基礎(chǔ)上，設(shè)計了可以擴(kuò)增多種微生物的通用引物，建立了基于二代高通量測序技術(shù)，檢測疾病患者腸道菌群的多樣性及差異性的方法。與常規(guī)方法相比，本發(fā)明的方法是通過pcr技術(shù)對患者體內(nèi)的腸道菌群提取出來的dna進(jìn)行了v1-v2區(qū)域的擴(kuò)增，對患者體內(nèi)的腸道菌群的多樣性及差異性進(jìn)行了研究，并且利用iontorrent平臺進(jìn)行測序，僅兩天就可以對100個左右的樣本完成測序，大大節(jié)省了時間。附圖說明圖1自閉癥兒童糞便樣本與正常兒童糞便樣本之間群落微生物的差異的pcoa圖圖2自閉癥兒童糞便樣本與其母親的糞便樣本之間群落微生物的差異的pcoa圖圖3健康兒童糞便樣本與其母親的糞便樣本之間群落微生物的差異的pcoa圖具體實施方式在本發(fā)明的實施例1中，所述待測樣本為自閉癥兒童的糞便樣本，具體為正常兒童的糞便樣本30例，自閉癥兒童的糞便樣本59例。共測疾病樣本89例。采用上述方法，對不同患者體內(nèi)的腸道菌群進(jìn)行dna的提取，并將提取的dna進(jìn)行pcr反應(yīng)，對pcr反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化，構(gòu)建文庫，準(zhǔn)備上機(jī)測序，依次進(jìn)行以下步驟：1.糞便樣本取樣方法嚴(yán)格按照試驗操作流程進(jìn)行糞便樣本的取樣。2.糞便dna的提取方法用ctab法進(jìn)行糞便dna的提取。3.dna含量的判定對提取出的dna進(jìn)行nanodrop2000分光光度計檢測其純度，發(fā)現(xiàn)1.6＜o(jì)d260/od280＜2.0，提取dna總量均＞10納克/微升。4.細(xì)菌的特異性引物的選擇根據(jù)已有的引物、引物的tm值，設(shè)計pcr反應(yīng)程序時的解鏈溫度。5.pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系嚴(yán)格按照試劑配比進(jìn)行pcr反應(yīng)體系的配置。6.pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序嚴(yán)格按照pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行程序的設(shè)置。7.pcr產(chǎn)物的特異性檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測目標(biāo)片段是否在355bp左右。8.v1、v2區(qū)的特異性擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物的純化嚴(yán)格按照試驗操作流程，進(jìn)行pcr產(chǎn)物的純化。9.使用qubit進(jìn)行精確的dna濃度定量將60-90個左右的樣本進(jìn)行dna濃度的精確定量，然后根據(jù)測得的最小濃度，將所有的樣本進(jìn)行同一濃度的稀釋。10.測序文庫構(gòu)建將純化后的pcr反應(yīng)產(chǎn)物按照實驗操作流程加入ep管內(nèi)，進(jìn)行接頭的連接，末端修復(fù)等。11.模板制備將模板制備的儀器水洗后，進(jìn)行模板的制備。12.模板富集將模板富集的機(jī)器打開后，先提前運(yùn)行一次。然后，將收集管內(nèi)，加入中和緩沖液，運(yùn)行機(jī)器。13.上機(jī)測序?qū)⒏患瓿珊蟮哪０?，進(jìn)行加接頭、加測序反應(yīng)引物后，進(jìn)行芯片上樣，然后設(shè)定測序反應(yīng)程序，進(jìn)行上機(jī)測序。14.利用qiime進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(1)原始數(shù)據(jù)預(yù)處理原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去接頭、低質(zhì)量過濾等處理，獲得高質(zhì)量的reads序列，然后合并正反向reads，獲得16srdnav3+v4區(qū)擴(kuò)增子序列。利用flash軟件合并正方向reads，該軟件可以快速、準(zhǔn)確的檢測到正反向reads的overlap序列，并將合并后序列輸出，其準(zhǔn)確性在99％以上。(2)合并數(shù)據(jù)長度分布及質(zhì)量統(tǒng)計合并后數(shù)據(jù)使用fastqc軟件進(jìn)行指控分析，該軟件從原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計到數(shù)據(jù)質(zhì)量、序列長度、gc偏好、冗余等信息以網(wǎng)頁的形式展現(xiàn)出來，可以直觀的看出數(shù)據(jù)的指控信息。(3)配置文件的準(zhǔn)備配置文件中包含了混合擴(kuò)增子的各個樣本的重要信息，如樣本名稱、標(biāo)簽序列、引物序列、樣本處理、采集區(qū)域、采集時間等。(4)分離樣本序列根據(jù)配置文件標(biāo)簽序列信息分離樣本，統(tǒng)計各個樣本基本信息。(5)去除嵌合體采用denovo方式去除嵌合體序列，嵌合體檢查軟件為usearch61。(6)篩選操作分類單元(operationaltaxonomicunits，otus)將所有分離的高質(zhì)量樣本序列做聚類分析，聚類可以將一定同源性的序列聚為一類(默認(rèn)同源性為97％)，每一個otu代表一個物種。(7)分類學(xué)組成分析使用rdp分類器和greengenes參考數(shù)據(jù)集。(8)樣本內(nèi)多樣性分析(α多樣性分析)主要是稀疏曲線分析。(9)樣本間多樣性分析(β多樣性分析)數(shù)據(jù)產(chǎn)生的距離矩陣可被主坐標(biāo)分析(principalcoordinateanalysis,pcoa)可視化。(10)lefse分析lda分值直方圖、微生物群落差異分類圖及差異特征的相對豐度直方圖。本次實驗共測疾病樣本89例，其中正常兒童的糞便樣本30例，自閉癥患兒的糞便樣本59例。用數(shù)據(jù)分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控以及分析后，得出alpha多樣性分析，從而找到不同樣本之間群落微生物的差異(見圖1)。結(jié)果說明自閉癥兒童的腸道菌群要比正常兒童腸道菌豐富。在本發(fā)明的實施例2中，所述待測樣本為糞便樣本，具體為自閉癥兒童的糞便樣本59例，自閉癥兒童的母親的糞便樣本59例，共計樣本118例。采用上述方法，對不同患者體內(nèi)的腸道菌群進(jìn)行dna的提取，并將提取的dna進(jìn)行pcr反應(yīng)，對pcr反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化，構(gòu)建文庫，準(zhǔn)備上機(jī)測序，依次進(jìn)行以下步驟：1.糞便樣本取樣方法嚴(yán)格按照試驗操作流程進(jìn)行糞便樣本的取樣。2.糞便dna的提取方法用ctab法進(jìn)行糞便dna的提取。3.dna含量的判定對提取出的dna進(jìn)行nanodrop2000分光光度計檢測其純度，發(fā)現(xiàn)1.6＜o(jì)d260/od280＜2.0，提取dna總量均＞10納克/微升。4.細(xì)菌的特異性引物的選擇根據(jù)已有的引物、引物的tm值，設(shè)計pcr反應(yīng)程序時的解鏈溫度。5.pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系嚴(yán)格按照試劑配比進(jìn)行pcr反應(yīng)體系的配置。pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序嚴(yán)格按照pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行程序的設(shè)置。7.pcr產(chǎn)物的特異性檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測目標(biāo)片段是否在355bp左右。8.v1、v2區(qū)的特異性擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物的純化嚴(yán)格按照試驗操作流程，進(jìn)行pcr產(chǎn)物的純化。9.使用qubit進(jìn)行精確的dna濃度定量將60-90個左右的樣本進(jìn)行dna濃度的精確定量，然后根據(jù)測得的最小濃度，將所有的樣本進(jìn)行同一濃度的稀釋。10.測序文庫構(gòu)建將純化后的pcr反應(yīng)產(chǎn)物按照實驗操作流程加入ep管內(nèi)，進(jìn)行接頭的連接，末端修復(fù)等。11.模板制備將模板制備的儀器水洗后，進(jìn)行模板的制備。12.模板富集將模板富集的機(jī)器打開后，先提前運(yùn)行一次。然后，將收集管內(nèi)，加入中和緩沖液，運(yùn)行機(jī)器。13.上機(jī)測序?qū)⒏患瓿珊蟮哪０?，進(jìn)行加接頭、加測序反應(yīng)引物后，進(jìn)行芯片上樣，然后設(shè)定測序反應(yīng)程序，進(jìn)行上機(jī)測序。14.利用qiime進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(1)原始數(shù)據(jù)預(yù)處理原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去接頭、低質(zhì)量過濾等處理，獲得高質(zhì)量的reads序列，然后合并正反向reads，獲得16srdnav3+v4區(qū)擴(kuò)增子序列。利用flash軟件合并正方向reads，該軟件可以快速、準(zhǔn)確的檢測到正反向reads的overlap序列，并將合并后序列輸出，其準(zhǔn)確性在99％以上。(2)合并數(shù)據(jù)長度分布及質(zhì)量統(tǒng)計合并后數(shù)據(jù)使用fastqc軟件進(jìn)行指控分析，該軟件從原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計到數(shù)據(jù)質(zhì)量、序列長度、gc偏好、冗余等信息以網(wǎng)頁的形式展現(xiàn)出來，可以直觀的看出數(shù)據(jù)的指控信息。(3)配置文件的準(zhǔn)備配置文件中包含了混合擴(kuò)增子的各個樣本的重要信息，如樣本名稱、標(biāo)簽序列、引物序列、樣本處理、采集區(qū)域、采集時間等。(4)分離樣本序列根據(jù)配置文件標(biāo)簽序列信息分離樣本，統(tǒng)計各個樣本基本信息。(5)去除嵌合體采用denovo方式去除嵌合體序列，嵌合體檢查軟件為usearch61。(6)篩選操作分類單元(operationaltaxonomicunits，otus)將所有分離的高質(zhì)量樣本序列做聚類分析，聚類可以將一定同源性的序列聚為一類(默認(rèn)同源性為97％)，每一個otu代表一個物種。(7)分類學(xué)組成分析使用rdp分類器和greengenes參考數(shù)據(jù)集。(8)樣本內(nèi)多樣性分析(α多樣性分析)主要是稀疏曲線分析。(9)樣本間多樣性分析(β多樣性分析)數(shù)據(jù)產(chǎn)生的距離矩陣可被主坐標(biāo)分析(principalcoordinateanalysis,pcoa)可視化。(10)lefse分析lda分值直方圖、微生物群落差異分類圖及差異特征的相對豐度直方圖。本實施案例共測樣本118例，其中自閉癥兒童的糞便樣本59例，自閉癥兒童的母親的糞便樣本59例。用數(shù)據(jù)分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控以及分析后，將自閉癥兒童及其母親的糞便測序結(jié)果相對比，得出alpha多樣性分析，從而找到不同樣本之間群落微生物的差異(見圖2)。在本發(fā)明的實施例3中，所述待測樣本為糞便樣本，具體為健康兒童及其母親的糞便樣本。其中健康兒童的糞便樣本30例，健康兒童母親的糞便樣本30例，共計60例。采用上述方法，對不同患者體內(nèi)的腸道菌群進(jìn)行dna的提取，并將提取的dna進(jìn)行pcr反應(yīng)，對pcr反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化，構(gòu)建文庫，準(zhǔn)備上機(jī)測序，依次進(jìn)行以下步驟：1.糞便樣本取樣方法嚴(yán)格按照試驗操作流程進(jìn)行糞便樣本的取樣。2.糞便dna的提取方法用ctab法進(jìn)行糞便dna的提取。3.dna含量的判定對提取出的dna進(jìn)行nanodrop2000分光光度計檢測其純度，發(fā)現(xiàn)1.6＜o(jì)d260/od280＜2.0，提取dna總量均＞10納克/微升。4.細(xì)菌的特異性引物的選擇根據(jù)已有的引物、引物的tm值，設(shè)計pcr反應(yīng)程序時的解鏈溫度。5.pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系嚴(yán)格按照試劑配比進(jìn)行pcr反應(yīng)體系的配置。6.pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序嚴(yán)格按照pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行程序的設(shè)置。7.pcr產(chǎn)物的特異性檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測目標(biāo)片段是否在355bp左右。8.v1、v2區(qū)的特異性擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物的純化嚴(yán)格按照試驗操作流程，進(jìn)行pcr產(chǎn)物的純化。9.使用qubit進(jìn)行精確的dna濃度定量將60-90個左右的樣本進(jìn)行dna濃度的精確定量，然后根據(jù)測得的最小濃度，將所有的樣本進(jìn)行同一濃度的稀釋。10.測序文庫構(gòu)建將純化后的pcr反應(yīng)產(chǎn)物按照實驗操作流程加入ep管內(nèi)，進(jìn)行接頭的連接，末端修復(fù)等。11.模板制備將模板制備的儀器水洗后，進(jìn)行模板的制備。12.模板富集將模板富集的機(jī)器打開后，先提前運(yùn)行一次。然后，將收集管內(nèi)，加入中和緩沖液，運(yùn)行機(jī)器。13.上機(jī)測序?qū)⒏患瓿珊蟮哪０?，進(jìn)行加接頭、加測序反應(yīng)引物后，進(jìn)行芯片上樣，然后設(shè)定測序反應(yīng)程序，進(jìn)行上機(jī)測序。14.利用qiime進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(1)原始數(shù)據(jù)預(yù)處理原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去接頭、低質(zhì)量過濾等處理，獲得高質(zhì)量的reads序列，然后合并正反向reads，獲得16srdnav3+v4區(qū)擴(kuò)增子序列。利用flash軟件合并正方向reads，該軟件可以快速、準(zhǔn)確的檢測到正反向reads的overlap序列，并將合并后序列輸出，其準(zhǔn)確性在99％以上。(2)合并數(shù)據(jù)長度分布及質(zhì)量統(tǒng)計合并后數(shù)據(jù)使用fastqc軟件進(jìn)行指控分析，該軟件從原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計到數(shù)據(jù)質(zhì)量、序列長度、gc偏好、冗余等信息以網(wǎng)頁的形式展現(xiàn)出來，可以直觀的看出數(shù)據(jù)的指控信息。(3)配置文件的準(zhǔn)備配置文件中包含了混合擴(kuò)增子的各個樣本的重要信息，如樣本名稱、標(biāo)簽序列、引物序列、樣本處理、采集區(qū)域、采集時間等。(4)分離樣本序列根據(jù)配置文件標(biāo)簽序列信息分離樣本，統(tǒng)計各個樣本基本信息。(5)去除嵌合體采用denovo方式去除嵌合體序列，嵌合體檢查軟件為usearch61。(6)篩選操作分類單元(operationaltaxonomicunits，otus)將所有分離的高質(zhì)量樣本序列做聚類分析，聚類可以將一定同源性的序列聚為一類(默認(rèn)同源性為97％)，每一個otu代表一個物種。(7)分類學(xué)組成分析使用rdp分類器和greengenes參考數(shù)據(jù)集。(8)樣本內(nèi)多樣性分析(α多樣性分析)主要是稀疏曲線分析。(9)樣本間多樣性分析(β多樣性分析)數(shù)據(jù)產(chǎn)生的距離矩陣可被主坐標(biāo)分析(principalcoordinateanalysis,pcoa)可視化。(10)lefse分析lda分值直方圖、微生物群落差異分類圖及差異特征的相對豐度直方圖。本實施案例共測樣本60例，其中健康兒童的糞便樣本30例，健康兒童母親的糞便樣本30例。用數(shù)據(jù)分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控以及分析后，將健康兒童及其母親的糞便測序結(jié)果相對比，得出alpha多樣性分析，從而找到不同樣本之間群落微生物的差異(見圖3)。當(dāng)前第1頁12