本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及自閉癥生物標(biāo)志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自閉癥(asd，autismspectrumdisorders)或稱孤獨(dú)癥或者孤獨(dú)癥譜系障礙，是廣泛性發(fā)育障礙的一種亞型，以男性多見，起病于嬰幼兒期，主要表現(xiàn)為不同程度的言語發(fā)育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板，約有3/4的患者伴有明顯的精神發(fā)育遲滯。據(jù)美國疾病監(jiān)控與預(yù)防中心(cdc)數(shù)據(jù)，2015年其發(fā)病率1/45(即2.24％)。我國尚缺乏全國性流行病調(diào)查數(shù)據(jù)，若以1/100估算，預(yù)估我國asds患者將超過1000萬。

自閉癥(asd)作為一種兒童精神疾病嚴(yán)重影響患兒的社會功能，給患兒家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)，但是目前自閉癥通常根據(jù)量表進(jìn)行評估，沒有血液診斷方法和有效的治療方案，這樣診斷將依靠主觀經(jīng)驗(yàn)判斷，不僅不能對自閉癥的發(fā)病提供有效預(yù)警，而且診斷準(zhǔn)確率很低。因此研究自閉癥發(fā)病機(jī)理和可以體現(xiàn)其嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物，并及時針對病因進(jìn)行干預(yù)與治療是治療疾病、減輕社會負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了自閉癥生物標(biāo)志物；本發(fā)明還提供了用于診斷自閉癥的試劑盒；本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)。

本發(fā)明第一方面提供了自閉癥生物標(biāo)志物，包括腸道細(xì)菌的豐度和/或總數(shù)。

本發(fā)明第二方面提供了檢測上述生物標(biāo)志物的試劑組合在制備用于診斷自閉癥的試劑盒中的用途。

本發(fā)明第三方面提供了一種自閉癥診斷試劑盒，包括適用于檢測所述的生物標(biāo)志物的試劑組合；

在一優(yōu)選例中，所述適用于檢測權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)志物的試劑組合包括北京康為世紀(jì)的型號為cw2092s的stoolgen糞便dna提取試劑盒；

在一優(yōu)選例中，所述適用于檢測權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)志物的試劑組合還包括美國賽默飛世爾公司提供的試劑盒和美國illumina公司生產(chǎn)的truseqdna建庫試劑盒；

在一優(yōu)選例中，還包括分析所述生物標(biāo)志物在體內(nèi)是否異常的工具。

本發(fā)明第四方面提供了所述的生物標(biāo)志物或所述的試劑盒在篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明第五方面提供了一種篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)，包括：

核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品和對照樣品中提取核酸樣本；

核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的序列；以及

判斷裝置，所述判斷裝置與所述測序裝置相連，基于所述核酸樣本的序列對生物樣品和對照樣品中腸道菌群所含的權(quán)利要求1的自閉癥生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果判斷所述生物樣品是否易患自閉癥。

在一優(yōu)選例中，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括：

文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于基于所述核酸樣本，構(gòu)建所述核酸的文庫；以及

測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，對所述文庫進(jìn)行測序，以便確定所述核酸樣本的序列，

在一優(yōu)選例中，所述文庫構(gòu)建單元進(jìn)一步包括：

pcr擴(kuò)增模塊，所述pcr擴(kuò)增模塊中設(shè)置特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增。

在本文中，術(shù)語“生物標(biāo)志物”應(yīng)做廣義理解，其包括任何能夠反映異常狀態(tài)的任何可檢測生物指標(biāo)，可以包含基因標(biāo)志物，物種標(biāo)志物(種標(biāo)志物/屬標(biāo)志物)以及功能標(biāo)志物(ko/og標(biāo)志物)，其具有非常廣泛的用途，可用于疾病診斷、判斷疾病分期或者用來評價新藥或新療法在目標(biāo)人群中的安全性及有效性。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)自閉癥的致病與腸道細(xì)菌的豐度和/或總數(shù)有關(guān)，因此將腸道細(xì)菌的豐度和/或總數(shù)作為自閉癥的檢測標(biāo)志物，這樣自閉癥的診斷將不依靠主觀經(jīng)驗(yàn)判斷，不僅可以對自閉癥的發(fā)病提供有效預(yù)警，而且可對其進(jìn)行確診，克服了自閉癥的診斷較大程度的依賴于主觀經(jīng)驗(yàn)判斷的缺陷，極大提高了診斷準(zhǔn)確率。

附圖說明

圖1是第一期發(fā)現(xiàn)階段自閉癥組和對照組菌群豐度對比圖，縱軸均取log10后的數(shù)據(jù)結(jié)果，每個點(diǎn)代表一個樣品，**代表p值＜0.01，t檢驗(yàn)。

圖2是第一期發(fā)現(xiàn)階段自閉癥組和對照組菌群種類(細(xì)菌數(shù)量)對比圖，縱軸均取log10后的數(shù)據(jù)結(jié)果，每個點(diǎn)代表一個樣品，**代表p值＜0.01，t檢驗(yàn)。

圖3是第二期驗(yàn)證階段自閉癥組和對照組菌群豐度對比圖，縱軸均取log10后的數(shù)據(jù)結(jié)果，每個點(diǎn)代表一個樣品。***代表p值＜0.001，t檢驗(yàn)。

圖4是第二期驗(yàn)證階段自閉癥組和對照組菌群種類(細(xì)菌數(shù)量)對比圖，縱軸均取log10后的數(shù)據(jù)結(jié)果，每個點(diǎn)代表一個樣品。*代表p值＜0.05，t檢驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。

下面參考具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本實(shí)施例運(yùn)用鳥槍法宏基因組測序來檢測分析健康人群和自閉癥患者的糞便樣本，繼而進(jìn)行統(tǒng)計檢驗(yàn)對比，以確定與自閉癥患者群相關(guān)的生物標(biāo)志物。具體步驟如下：

1.樣品來源

自閉癥組：來自深圳市兒童醫(yī)院心理科及言語治療科門診自閉癥患兒，收集時間為2015年7～12月。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)國際最新診斷標(biāo)準(zhǔn)，即《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第5版》(diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders，5thedition，dsm-5)，診斷為asd”需要非常多支持”的患兒；②年齡＜14歲；③性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他精神疾病(如精神分裂癥等)；②患有其他神經(jīng)發(fā)育障礙疾病；③患有遺傳代謝性疾?。虎芑加袊?yán)重神經(jīng)疾病以及顱腦損傷史等重大軀體疾病史。

對照組：來自深圳市兒童醫(yī)院兒保科體檢兒童。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無精神疾病，身體健康；②與患者組年齡及性別匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)同患者組。所有入組兒童家長對本研究知情并簽署知情同意書。

本研究經(jīng)深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

本研究分兩期：發(fā)現(xiàn)階段和驗(yàn)證階段。

第一期為發(fā)現(xiàn)階段，共收集22例自閉癥患兒，男18例，女4例；年齡2～6歲，平均(2±1)歲。共收集15名對照兒童，男8名，女7名；年齡1～6歲，平均(2±1)歲。兩組性別(fisher精確檢驗(yàn)p＞0.05)、年齡(student’sttest，p＞0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

第二期為驗(yàn)證階段，收集22例自閉癥患兒，男18例，女3例；年齡2～6歲，平均(2±1)歲。共收集16名對照兒童，男9名，女7名；年齡1～6歲，平均(2±1)歲。兩組性別(fisher精確檢驗(yàn)p＞0.05)、年齡(student’sttest，p＞0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.糞便采集與前期處理

參與者自行將糞便排在指定的糞便采集盆，然后準(zhǔn)備醫(yī)用一次性糞便采樣管，戴手套，采集糞便，采集中斷，避免因疏忽造成的污染，一旦發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)重新采樣，采集完成后迅速冷凍保存于-80℃冰箱。收集相關(guān)基礎(chǔ)信息，包括：姓名、性別、年齡、身高、體重、患病史、家庭住址、父母聯(lián)系方式等詳實(shí)的《健康情況信息表》；《飲食及生活習(xí)慣調(diào)查表》需重點(diǎn)收集的資料包括飲食習(xí)慣，是否母乳喂養(yǎng)，父母生活習(xí)慣、健康狀況及吸煙史，家庭所處氛圍，近期抗生素，酸奶，益生菌使用等。

糞便標(biāo)本收集完后，采用北京康為世紀(jì)的型號為cw2092s的stoolgen糞便dna提取試劑盒按照其說明書進(jìn)行基因組dna的提取。

3.宏基因組建庫和測序

取2ul已提取的dna樣品進(jìn)行定量，所用的試劑盒為美國賽默飛世爾公司提供的試劑盒(qubitdsdnabrassaykit)。利用美國illumina公司生產(chǎn)的truseqdna建庫試劑盒進(jìn)行建庫，文庫插入片段大小為200-500bp，該試劑盒連接在美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的自動化spri工作站上。每個文庫構(gòu)建完成后，采用美國安捷倫科技公司生產(chǎn)的agilent2100生物分析儀進(jìn)行質(zhì)控(qc，qualitycontrol)。通過qc后，即文庫濃度需在3ng/μl以上，該文庫用于后期測序，測序所用的平臺為illuminahiseq2500測序平臺，測序方式為150bp雙端測序。每個樣本測得1g以上的數(shù)據(jù)。

4.生物信息分析和統(tǒng)計

首先，過濾掉一些質(zhì)量差或含有接頭的序列。其次，所有測定的序列均對照人類基因組序列(參考hg19)以剔除人為污染的序列。再次，采用megan軟件(即megan5)(http：//ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan5/下載)v5的默認(rèn)參數(shù)，對鳥槍法宏基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行菌群分類(taxonomic)及功能(functional)profile分析，得到的taxonomicprofile結(jié)果為每一個樣本中注釋到界(superkingdom)門(phylum)綱(class)目(order)科(family)屬(genus)種(species)的細(xì)菌豐度。

然后，通過t檢驗(yàn)法分析疾病組和對照組的細(xì)菌總數(shù)和豐度是否差異顯著。

結(jié)果及分析：

在第一期發(fā)現(xiàn)階段，自閉癥患者腸道細(xì)菌的豐度顯著低于對照組(如圖1所示)，而且自閉癥患者腸道細(xì)菌的總數(shù)也顯著低于對照組(如圖2所示)，由此可見，自閉癥患者腸道菌群多態(tài)性顯著低于對照組。

在第二期驗(yàn)證階段，自閉癥患者腸道細(xì)菌的豐度顯著低于對照組(如圖3所示)，而且自閉癥患者腸道細(xì)菌的總數(shù)也顯著低于對照組(如圖4所示)，由此可見，自閉癥患者腸道菌群多態(tài)性顯著低于對照組。

綜上，自閉癥患者腸道菌群多態(tài)性顯著低于對照組，腸道菌群細(xì)菌的豐度和細(xì)菌的總數(shù)可以做為自閉癥患者的一個標(biāo)志物。