本發(fā)明屬于病原分子檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種植物病原真菌的分子檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

在使用ctab試劑法提取部分真菌dna或者使用真菌試劑盒提取含大量植物組織的真菌dna時(shí)，經(jīng)常會出現(xiàn)將dna溶解液進(jìn)行pcr擴(kuò)增并將產(chǎn)物電泳時(shí)，無條帶的情況，此時(shí)需要辨別是dna未提取成功，還是dna存在卻未進(jìn)行反應(yīng)。另外在病原菌的診斷中，最后pcr產(chǎn)物電泳無條帶，不能證明提取液中是不含有dna，還是不含有目的dna(方明，2006)。這兩種情況下，都需要證明總dna的存在。

另外，土壤中存在大量的微生物，桑園土壤中更含有細(xì)碎植物組織等植物成分存在，故土壤提取dna，理論上應(yīng)可提取到dna(袁小鳳等，2013)。分光光度計(jì)檢測dna濃度與純度機(jī)理為依靠dna溶液的吸光度即od值進(jìn)行換算，理想條件為只存在dna以及溶解液，但是若雜質(zhì)等存在，同樣會造成od值的變化，所以以od值作為dna濃度的檢測指標(biāo)不是完全精準(zhǔn)的。

its序列為目前用于真核生物快速鑒定使用最多的序列，也是用于真菌物種鑒定的主要條形碼(conradetal.,2012)。因?yàn)閕ts區(qū)上下游保守、中間變異略多、區(qū)段大小適中，易于擴(kuò)增與測序，可用于分析物種的進(jìn)化關(guān)系，可精確到屬，部分確定到種(whiteetal.,1990；張宇等，2012；周均亮等，2013)。而在擴(kuò)增真菌its區(qū)段，進(jìn)行真菌的鑒定時(shí)，通用的its引物組可擴(kuò)增部分植物的dna，包括桑樹，在植物病原真菌的dna擴(kuò)增上造成一定的干擾，在后續(xù)的dna條帶純化等方面。

現(xiàn)有技術(shù)中已有多組真菌通用檢測引物，如引物組its1/its4，引物組its4/its5等。但是均存在特異性不好活靈敏度不高的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有植物病原真菌檢測技術(shù)的缺陷和不足，以真菌rdna上18srrna和28srrna區(qū)段為靶基因設(shè)計(jì)真菌dna存在與否的檢測引物；該檢測引物可以以病葉、菌絲體、病斑葉片、土壤、枝條等任何包含真菌和植物的材料提取的總dna為模板，檢測結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高，擴(kuò)增條帶大小單一。尤其是對于含真菌或植物組織存在的材料總dna，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義，同時(shí)其可用于土壤等物質(zhì)的總dna存在性檢測。

本發(fā)明的目的是提供一種植物病原真菌的檢測引物組。

本發(fā)明另一目的是提供一種植物病原真菌的分子檢測方法。

本發(fā)明再一目的是提供一種植物病原真菌的分子檢測試劑盒。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

基于本發(fā)明人對多種真菌rdna的研究實(shí)驗(yàn)和分析總結(jié)，選擇18srrna和28srrna區(qū)段序列作為檢測的靶基因。

設(shè)計(jì)了一種植物病原真菌的檢測引物組，包括引物對d652f/d1568r和/或引物對a1956f/a2685r；所述引物對d652f/d1568r的上下游引物序列分別如seqidno.1和seqidno.2所示，所述引物對a1956f/a2685r的上下游引物序列分別如seqidno.3和seqidno.4所示。

具體地，上述引物對d652f/d1568r是快速檢測真菌dna存在的pcr引物組，檢測結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高。

引物對a1956f/a2685r是快速擴(kuò)增真菌its區(qū)段的引物組，檢測結(jié)果可靠、易于操作、擴(kuò)增條帶大小單一。

因此兩組引物對分別在真菌檢測中的應(yīng)用或在制備真菌檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用，以及引物對d652f/d1568r在真菌檢測或制備真菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，以及引物對a1956f/a2685r在真菌its區(qū)段擴(kuò)增(鑒定)或制備真菌its區(qū)段擴(kuò)增(鑒定)試劑盒中的應(yīng)用，都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

兩組引物的配合使用對于植物病原菌的檢測，尤其是對侵染早期的植物檢測和對泥土中病原菌的快速檢測，具有重要的意義。而且克服解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的pcr結(jié)果無條帶，以及擴(kuò)增植物病原真菌時(shí)多條帶的問題。

一種植物病原真菌的分子檢測方法，以待測樣本總dna為模板，利用引物對d652f/d1568r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物是否為900-1000bp大小的片段來判定待測樣本中是否提取到了植物病原真菌或植物的dna。

進(jìn)一步優(yōu)選地，在上述引物對d652f/d1568r擴(kuò)增檢測的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以待測樣本總dna為模板，利用引物對a1956f/a2685r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物是否為700bp-800bp大小的片段來判定待測樣本中是否含有植物病原真菌。

具體地，所述待測樣本可以為葉片、枝條、菌絲體或土壤等多種樣本。

優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系為：

其中，2×反應(yīng)緩沖液的組分為taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp。

優(yōu)選地，引物對d652f/d1568r擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。

優(yōu)選地，引物對a1956f/a2685r擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。

一種包含所述引物對d652f/d1568r和/或引物對a1956f/a2685r的植物病原真菌的分子檢測試劑盒，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種包含有引物對a1956f/a2685r的快速擴(kuò)增真菌its區(qū)段的試劑盒，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

試劑盒的使用方法如上分子檢測方法。

本發(fā)明以18srrna和和28srrna基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)了上述真菌的通用檢測引物，其具有很好的檢測靈敏性，在真菌的實(shí)際檢測應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和意義。引物組d652f/d1568r可用于檢測真菌和植物的dna的存在，檢測結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高，擴(kuò)增條帶大小單一；尤其是對于提取含真菌或植物組織存在的材料總dna，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。同時(shí)其可用于土壤等物質(zhì)的總dna存在性檢測。真菌its區(qū)段擴(kuò)增引物組可用于植物病原真菌等的擴(kuò)增，因其不會擴(kuò)增植物基因組dna，其特異性與便捷性要好于真菌通用引物its1/its4和its4/its5。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明設(shè)計(jì)獲得了一組特異性、靈敏性較好的快速檢測真菌的引物組，可用于真菌dna的存在性檢測，能夠準(zhǔn)確地判斷樣品是否含有真菌或植物dna，可為相關(guān)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供保障。還可輕松用于判定dna是否提取成功，以及分析部分pcr實(shí)驗(yàn)無條帶(失敗)的原因。

另外，本發(fā)明引物及相關(guān)試劑可組裝成試劑盒，使用方便。而且適用的pcr擴(kuò)增模板非常多樣，適用范圍廣，可以是多種樣品的dna，病葉、菌絲體、病斑葉片、土壤、枝條等提取的總dna為模板，大大增加了檢測對象的范圍。

重要的是，本發(fā)明的特異檢測引物和試劑盒均能夠在病原菌侵染早期就能夠特異性的檢測出來，為桑污葉病的早期檢測提供了一種簡單快速的方法。

附圖說明

圖1為引物對d652f/d1568r進(jìn)行真菌dna存在性檢測的結(jié)果。注：m：takaradl2000marker；1至8號反應(yīng)體系引物為真菌檢測性引物組d652f/d1568r，1為枝孢霉屬真菌(cladosporium)；2為青霉屬真菌(pencillum)；3為曲霉屬真菌(aspergillus)；4為桑里白粉病病原菌(phyllactiniamoricola)；5為桑葚小粒性菌核病病原菌(ciboriacarunculoides)；6為桑污葉病病原菌pseudocercosporamori(陽性對照)；7為銅綠假單胞菌(陰性對照)；8為水(空白對照)。

圖2為引物對a1956f/a2685r對不同材料提取的桑污葉病病原菌dna驗(yàn)證。注：mtakaradl5000marker；各泳道的dna模板提取材料分別為不同地區(qū)的桑污葉病病葉樣品。

圖3為不同真菌引物組靈敏度測試結(jié)果。注：m：takaradl2000marker；1至7為its1/its4引物組；2至14為its4/its5引物組；15至21為a1956f/a2685r引物組；22至28為d652/d568r引物組；1、8、15、22為枝孢霉屬真菌(cladosporium)；2、9、16、23為龍眼焦腐病菌(lasiodiplodiapseudotheobromae)；3、10、17、24為為曲霉屬真菌(aspergillus)；4、11、18、25為青霉屬真菌(pencillum)；5、12、19、26為桑污葉病病葉(pseudocercospora和mulberry)；6、13、20、27為桑樹dna；7、14、21、28為細(xì)菌銅綠假單胞菌(陰性對照)。

圖4為不同its引物組用于擴(kuò)增桑污葉病病原菌dna的結(jié)果。注：mtakaradl1000marker；1、2its1/its4引物組；3、4its4/its5引物組；5、6a1956f/a2685r引物組；1、3、5為桑葉病斑提取dna；2、4、6為洗脫子實(shí)體提取dna；7空白對照(水)。

圖5為多種土壤提取dna中真菌dna檢測結(jié)果。注：m：takaradl1000marker；1.實(shí)驗(yàn)室桑樹種植區(qū)泥土；2.本實(shí)驗(yàn)回感實(shí)驗(yàn)區(qū)泥土；3.英德市英德蠶種場桑園泥土；4.英德市英德蠶種場泥土；5-8.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶桑教學(xué)實(shí)驗(yàn)園泥土，取自桑園的4個(gè)桑樹種植區(qū)域；9.桑污葉病子實(shí)體(陽性對照)；10.銅綠假單胞菌(陰性對照)；11.無菌水(空白對照)。

圖6為非病原菌真菌dna存在性檢測結(jié)果。注：m：takaradl2000marker；泳道1至8號引物為真菌檢測性引物組d652f/d1568r，9至16引物為為病原菌檢測性引物w1724f/w2196r；各泳道模版dna分別為：1、9為枝孢霉屬真菌(cladosporium)；2、10為青霉屬真菌(pencillum)；3、11為曲霉屬真菌(aspergillus)；4、12為桑里白粉病病原菌(phyllactiniamoricola)；5、13為桑葚小粒性菌核病病原菌(ciboriacarunculoides)；6、14為桑污葉病病原菌(陽性對照)；7為銅綠假單胞菌(陰性對照)；15為桑樹dna(陰性對照)；8、16為水(空白對照)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1檢測引物設(shè)計(jì)及pcr擴(kuò)增方法的建立

1、在ncbi核苷酸數(shù)據(jù)庫中下載多種屬真菌的rdna全長，并確定rdna各基因區(qū)段與轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)的核苷酸序列及其在rdna上的位置。

2、經(jīng)過對上述多種菌rdna全長分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了多對引物，通過大量的特異性和靈敏性檢測，最終選取了2對有代表性的引物組，引物序列如下：

d652f/d1568r引物組

上游引物d652f(seqidno.1)：5’ctgagaaacggctaccacatcc3’

下游引物d1568r(seqidno.2)：5’gcagacaaatcactccaccaacta3’

a1956f/a2685r引物組

上游引物a1956f(seqidno.3)：5’-tcggcaacgaccaccca-3’

下游引物a2685r(seqidno.4)：5’-ctacccagaagcatcctctacaaa-3’

3、pcr擴(kuò)增方法的建立

以病葉、枝條、土壤的總dna為模板，用上述的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

所述pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系為：

其中，2×反應(yīng)緩沖液的組分為taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp。

引物對d652f/d1568r擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。

引物對a1956f/a2685r擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。

反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小來判定待測樣本中是否含有植物病原真菌。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

第一對引物d652f/d1568r：pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到900-1000bp左右的dna片段判定真菌dna是否提取成功。當(dāng)能擴(kuò)增出900-1000bp的dna片段產(chǎn)物，即可判斷總dna提取成功。

第二對引物a1956f/a2685r：pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到700bp-800bp左右的dna片段判定實(shí)驗(yàn)是否成功。當(dāng)能擴(kuò)增出700bp-800bp的dna片段產(chǎn)物，即可判斷真菌dna存在。

4、結(jié)果的判定。

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果分別如附圖1～2所示，引物d652f/d1568r能擴(kuò)增植物與真菌的dna，得到結(jié)果為出現(xiàn)略小于1000bp的條帶，而引物a1956f/a2685r擴(kuò)增條帶為單一的條帶，不受植物dna的影響。

實(shí)施例2引物d652f/d1568r的靈敏性

1、分別以多種真菌的dna為模版，以真菌通用檢測引物its1/its4，its4/its5，以及引物組d652f/d1568r和a1956f/a2685r為引物進(jìn)行同樣pcr程序的反應(yīng)，查看瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

真菌通用引物its1/its4引物組

its1：5’tccgtaggtgaacctgcgg3’

its4：5’tcctccgcttattgatatgc3’

真菌通用引物its4/its5引物組

its4：5’tcctccgcttattgatatgc3’

its5：5’ggaagtaaaagtcgtaacaagg3’

2、引物的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖3所示。結(jié)果顯示，引物對d652f/d1568r的靈敏性要強(qiáng)于真菌通用引物組its1/its4，its4/its5。

實(shí)施例3引物a1956f/a2685r特異性檢測

1、以桑污葉病的病斑部分(植物桑樹+真菌)提取的總dna作為模版，以引物its1/its4，its4/its5，a1956f/a2685r作為引物進(jìn)行同樣pcr程序的反應(yīng)，查看瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

2、引物的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖4所示。結(jié)果顯示，引物組a1956f/a2685r條帶為單一條帶，條帶清晰，特異性強(qiáng)于真菌通用引物組its1/its4和its4/its5。

實(shí)施例4患病桑園泥土中的總dna提取檢測

1、土壤總dna的提取

土壤中真菌dna的提取理念參考林福呈等(2010)的方法，并做修改。步驟如下：

采集自不同桑區(qū)的每份的泥土采集量超過10克，對采集的泥土樣品進(jìn)行充分研磨，去除不能研磨的石籽與沙礫，稱取研磨后的泥土0.5克，采用試劑盒g(shù)enview進(jìn)行dna的提取，提取方法略作改動(dòng)。

所用于提取dna的泥土樣品呈粉末狀，不適合使用液氮研磨；且為保證提取dna的含量，使用的樣品量遠(yuǎn)多于試劑盒要求的100mg或30mg，為避免浪費(fèi)試劑盒材料，將對實(shí)驗(yàn)步驟略作改動(dòng)。

稱取研磨后的泥土0.5克，加入試劑bufferp1體積為1ml，且加入蛋白酶k與rnasea，進(jìn)行水浴消化處理，時(shí)間為65℃3小時(shí)左右，期間不斷震蕩混勻，后加入500μl氯仿，振蕩混勻5分鐘，后12000r/min離心10分鐘，取上清；加入700μl的buffergf2(鹽溶液使dna析出)，混勻；吸取混合液于離心柱中，靜置2分鐘，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入700μl的bufferwf1(高濃度乙醇洗去鹽分)，靜置2分鐘，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入700μl的bufferwf2(75％乙醇)，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入500μl的bufferwf2，12000r/min，離心1分鐘，棄濾液；再次12000r/min離心2分鐘，棄濾液棄收集管；將離心柱裝入1.5ml離心管中，加入50μl洗脫液elution(溶解dna)，室溫放置5分鐘，12000r/min離心2分鐘；重復(fù)上一步驟，即獲得純度較高的總dna。

2、pcr檢測

以步驟1得到的各材料提取dna為模板，用dna檢測引物d652f/d1568r進(jìn)行pcr反應(yīng)。

反應(yīng)結(jié)果如附圖5所示，證明多種土壤中均可檢測到真菌的dna。

實(shí)施例5其他真菌的dna存在性檢測

1、以實(shí)驗(yàn)室分離到的幾種主要真菌作為對照組，提取dna，并以桑污葉病病原菌特異檢測引物作為對照實(shí)驗(yàn)組，用于確定部分實(shí)驗(yàn)中pcr無條帶卻存在dna的情況。

2、pcr檢測

以步驟1得到的各材料提取dna為模板，用dna檢測引物d652f/d1568r與桑污葉病病原菌特異檢測引物w1726f/w2196r進(jìn)行pcr反應(yīng)。

桑污葉病病原菌特異檢測引物組w1726f/w2196r(擴(kuò)增產(chǎn)物473bp)：

w1724f：5’gctacactgacagagccaacg3’

w2196r：5’gctacactgacagagccaacg3’。

3、反應(yīng)結(jié)果如附圖6所示，本發(fā)明的真菌檢測引物d652f/d1568r有目的條帶，而桑污葉病病原真菌檢測引物w1726f/w2196r無條帶。證明實(shí)驗(yàn)總dna提取成功，且總dna中無目的真菌(桑污葉病病原真菌)dna存在。

因?yàn)閷?shí)際情況下，部分pcr實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳無條帶的情況需區(qū)分看待，即可能有如下2種情況：

(1)總dna提取成功，體系中有dna存在，無目的真菌dna存在；

(2)總dna未提取成功，無總dna存在(dna提取環(huán)節(jié)失敗)。

因此，上述結(jié)果證明了本發(fā)明的真菌檢測引物組d652f/d1568r可克服如上情況，具有較高的靈敏性，只要dna提取成功，即有擴(kuò)增條帶?？奢p松用于判定dna是否提取成功，以及分析部分pcr實(shí)驗(yàn)無條帶(失敗)的原因。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種植物病原真菌的分子檢測方法及試劑盒

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>上游引物d652f

<400>1

ctgagaaacggctaccacatcc22

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>下游引物d1568r

<400>2

gcagacaaatcactccaccaacta24

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>上游引物a1956f

<400>3

tcggcaacgaccaccca17

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>下游引物a2685r

<400>4

ctacccagaagcatcctctacaaa24