一種新的β-1,6-葡聚糖酶及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物及植物保護(hù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種新的β-?，6-葡聚糖酶及其編 碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物病害是農(nóng)作物高質(zhì)優(yōu)產(chǎn)的制約因素之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球因?yàn)橹参锊『?dǎo)致的 作物產(chǎn)量損失約占16%，每年直接經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)數(shù)億美元。在植物病害中，70%_80%的病 害是由植物病原真菌侵染所引起的。植物真菌病害不僅直接造成作物產(chǎn)量下降和品質(zhì)降 低，而且部分病原真菌在侵染農(nóng)作物的過(guò)程中，還能分泌多種人畜有害的毒素和代謝產(chǎn)物， 對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的安全造成極大的威脅。
[0003] 植物真菌病害控制難度大，生產(chǎn)上急需有效的控制手段，隨著高效、內(nèi)吸、選擇性 強(qiáng)的現(xiàn)代殺菌劑被開(kāi)發(fā)和廣泛應(yīng)用，植物病害得到了一定的控制。但是也面臨著植物對(duì)殺 菌劑抗性越來(lái)越嚴(yán)重和普遍的狀況，導(dǎo)致植物病害病害化學(xué)防治失敗，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)遭受巨大 損失。同時(shí)，殺菌劑在植物中積累，通過(guò)食物鏈的方式也會(huì)對(duì)動(dòng)物造成危害。另外，植物抗病 品種選育雖然安全可靠，但是選育過(guò)程十分耗時(shí)，因此廣譜抗真菌蛋白對(duì)抗病育種提高植 物抗病能力具有重要研究?jī)r(jià)值。
[0004] β-1，6-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁中的特有結(jié)構(gòu)，是專(zhuān)一性的抗真菌靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)β-1，6_葡聚糖酶在生防木霉重寄生過(guò)程有一定的作用，但對(duì)其在抗真菌過(guò)程中的作用還未受 到重視。到目前為止關(guān)于β-1，6-葡聚糖酶的報(bào)道也僅有少數(shù)幾例，來(lái)源于Trichoderma harzianum CECT 2413的一個(gè)酸性，6-葡聚糖酶BGN16 · 3 以及來(lái)源于Trichoderma harzianum的內(nèi)切型β-1，6-葡聚糖酶等。β-1，6-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁中重要的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，將 長(zhǎng)鏈的β-1，3-葡聚糖以及外層甘露聚糖交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，β-1，6-葡聚糖聯(lián)結(jié)的破壞將破 壞整個(gè)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。
[0005] β-l，6-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)能夠有效的裂解植物病原真菌細(xì)胞壁的重要組成 成分β-1，6-葡聚糖，從而破壞真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，裂解菌絲，達(dá)到生物防治的效果。因此這 種抗菌蛋白因其誘發(fā)植物自身抗性、可行性強(qiáng)、無(wú)種屬專(zhuān)一性、作用持久等特點(diǎn)，對(duì)抗病育 種具有重要價(jià)值。同時(shí)葡聚糖也是白色念珠菌以及造成灰指甲的病原真菌等人源致病菌 細(xì)胞壁含量最高的多糖，因此，β-l，6_葡聚糖酶同樣能夠破壞該類(lèi)病原真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)， 從而為外涂抗真菌藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)材料。
[0006] 目前來(lái)源于微生物的β-1，6_葡聚糖酶主要來(lái)源于哈茨木霉以及放線菌，但由于其 活性較低以及相關(guān)性質(zhì)的限制影響其應(yīng)用。因此開(kāi)發(fā)高活性廣譜高效抗菌β-1，6_葡聚糖酶 具有重要的研究?jī)r(jià)值以及應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)報(bào)道AFP、i3_l，3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶已經(jīng)被成功 應(yīng)用到作物抗病育種中，這也為β-1，6-葡聚糖酶在抗病性作物育種方面提供了方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種全新的β-l，6-葡聚糖酶及其編碼基因，所述酶可以通過(guò) 氨基酸序列基序(一級(jí)結(jié)構(gòu)）、二級(jí)結(jié)構(gòu)元件以及三級(jí)結(jié)構(gòu)元件和氨基酸序列在線BLAST比 對(duì)來(lái)識(shí)別。該β-l，6_葡聚糖酶為一種抗病原真菌的廣譜抗病蛋白。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供含有該β-1，6-葡聚糖酶基因的基因工程菌。
[0009] 本發(fā)明的又一目的是提供該基因以及該基因所編碼的蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明所述β-1，6-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列為:SEQ ID Ν0.1，該基因全長(zhǎng)(從 起始密碼子到終止密碼子)為3222bp，G+C含量為65.8 %，編碼1073個(gè)氨基酸，理論分子量大 小為116.13KD，等電點(diǎn)為5.37。
[0011]本發(fā)明所述的β_1，6-葡聚糖酶基因編碼的β-1，6-葡聚糖酶蛋白質(zhì)，其氨基酸序列 為:SEQ ID ^).2。所述的0-1，6-葡聚糖酶最適反應(yīng)?!1為7.〇，最適反應(yīng)溫度為5〇°(3，并在2〇 °C_50°C(lh)和pH 5.0-10.0(2處)之間保持活性穩(wěn)定，該蛋白為典型的財(cái)斤疊桶狀結(jié)構(gòu)，具 有專(zhuān)一性水解β-l，6-葡聚糖的功能。
[0012]本發(fā)明所述的β-1，6-葡聚糖水解酶的活性分布區(qū)域?yàn)锳TG起始端第79個(gè)堿基至第 1500個(gè)堿基，其核苷酸序列為:SEQ ID Ν0.4;氨基酸區(qū)域?yàn)棣说?7個(gè)氨基酸至第500個(gè)氨 基酸，其氨基酸序列為:SEQ ID N0.5。
[0013]由本發(fā)明所述的SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5序列中一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基取 代、缺失或者添加所得到的多肽或蛋白，具有與本發(fā)明所述的GluM蛋白相同的β-1，6-葡聚 糖水解酶活性的，也在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。
[0014] 本發(fā)明提供了 β-1，6-葡聚糖酶氨基酸序列在線BLAST序列比對(duì)，并構(gòu)建了該蛋白 的進(jìn)化樹(shù)，得到來(lái)源于不同粘細(xì)菌屬的與本發(fā)明的β-1，6-葡聚糖酶同源性高于50%的序 列，發(fā)現(xiàn)相關(guān)序列均被預(yù)測(cè)為通道蛋白（TonB Protein)，與β-l ,6-葡聚糖水解酶功能無(wú)關(guān)。 本發(fā)明隨機(jī)挑選具有代表性的九個(gè)與本發(fā)明所述的β-1，6-葡聚糖酶氨基酸序列同源性高 于50%，且來(lái)源于不同種類(lèi)粘細(xì)菌的同源蛋白或者假設(shè)蛋白進(jìn)行異源表達(dá)功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) 不同來(lái)源的同源蛋白均具有β-1，6-葡聚糖水解活性，這些蛋白也屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0015] 含有本發(fā)明所述的β-1，6-葡聚糖酶基因，所述的β-1，6-葡聚糖酶基因的變體，同 系物或片段，或所述的β-1，6-葡聚糖酶基因的活性分布區(qū)域的重組表達(dá)載體。
[0016] 本發(fā)明所述的β-1，6-葡聚糖酶基因、該基因的活性分布區(qū)域、含有該基因的重組 表達(dá)載體、含有該基因的宿主菌在構(gòu)建抗真菌病害植物中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明提供了含有上述β-l，6-葡聚糖酶基因序列的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn) 導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述基因序列直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明提供了一種抗植物病原真菌的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建過(guò)程包括兩 個(gè)主要內(nèi)容：
[0019] (1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌；
[0020] (2)所述的表達(dá)載體含有SEQ ID NO. 1或者SEQ ID Ν0.4所述的β-1，6-葡聚糖酶的 DNA編碼序列，或者攜帶與SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.5所述氨基酸序列的變體、或者活性 多肽片段、或活性多肽衍生物，且編碼產(chǎn)物具備β-1，6-葡聚糖酶活性的基因序列；
[0021] 轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建過(guò)程為:將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟⑴農(nóng)桿菌接觸，從而 使β-1，6-葡聚糖酶基因編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或者組織或者器官，并且整合到植物細(xì)胞的 染色體。通過(guò)對(duì)上述轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞或者組織或者器官進(jìn)行再生植株后，得到含有目的基 因的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)植株進(jìn)行病原菌抗性鑒定，植株具有良好的抗性水平。本專(zhuān)利以擬 南芥和水稻作為轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟆?br>[0022] 本發(fā)明所述的β-1，6_葡聚糖酶GluM在植物病害的生物防治方面的應(yīng)用。本發(fā)明所 述的β-l，6_葡聚糖酶GluM為一種廣譜抗真菌蛋白，本專(zhuān)利以典型的氣傳病害-稻瘟病菌進(jìn) 行生物防治實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示良好的抗性水平。
[0023] 本發(fā)明所述的β-l，6_葡聚糖酶GluM優(yōu)選在防治和控制植物病原真菌對(duì)植物的損 害中的應(yīng)用。
[0024] 其中，所述的植物病原真菌對(duì)植物的損害選自半知菌亞門(mén)真菌導(dǎo)致的病害:黃瓜 枯萎病，棉花枯萎病，棉花黃枯萎病，草莓枯萎病，水稻稻瘟病，水稻紋枯病，卵菌門(mén)疫霉屬 真菌導(dǎo)致的病害:大豆疫霉菌，辣椒疫霉菌;鞭毛菌亞門(mén)單軸霉屬真菌導(dǎo)致的病害:葡萄霜 霉?。蛔幽揖鷣嗛T(mén)單囊殼屬真菌導(dǎo)致的病害:草莓白粉病;所述的植物選自小麥、玉米、大 豆、水稻、黃瓜、番茄、草莓、棉花或擬南芥。
[0025] 本發(fā)明提供了用于檢測(cè)β-1，6_葡聚糖酶或者變體或者截短片段存在的抗體，檢測(cè) 為陽(yáng)性且具有β-1，6_葡聚糖水解酶活性的蛋白或者肽段即為本專(zhuān)利所述的β-1，6_葡聚糖 酶GluM或者變體或者截短片段。制備該抗體所用的肽段序列為SEQ ID Ν0.9或10或11。 [0026] 專(zhuān)利補(bǔ)充說(shuō)明
[0027] 1.本專(zhuān)利描述了一種新的外膜型糖苷水解酶GluM，所述酶能夠有效的水解酵母葡 聚糖，昆布多糖，石耳素等以β-1，6-糖苷鍵連接的多糖，尤其對(duì)短鏈β-1，6-糖苷鍵連接多糖 活性最好。
[0028] 2.本專(zhuān)利所述β-1，6-葡聚糖酶GluM"變體"是指這樣的蛋白，由于氨基酸的插入、 缺失、突變、或取代而與本發(fā)明的參考氨基酸序列有差異。關(guān)于確定參考氨基酸序列中的哪 些氨基酸殘基可以取代、添加或缺失的指引，可以通過(guò)比較特定參考多肽的序列與同源多 肽的序列，并使高度同源區(qū)（保守區(qū)）中被改變的氨基酸序列數(shù)目最小化，或通過(guò)用共有序 列代替這些氨基酸來(lái)找到。變體蛋白可以具有被取代的氨基酸，但同時(shí)仍保留參考蛋白的 功能活性。"變體