一種表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子、其制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子，其制備方法及其在富集人中性粒細(xì)胞多肽中的應(yīng)用。本發(fā)明的炭疽致死因子磁性納米粒子通過氨基-羧基偶聯(lián)反應(yīng)，將炭疽致死因子連接在表面具有氨基和/或羧基的超順磁性納米粒子表面而得；其可快速、特異地富集人中性粒細(xì)胞多肽，以便進(jìn)行進(jìn)一步的檢測，從而方便了人中性粒細(xì)胞多肽作為腫瘤愈后生物標(biāo)志物的應(yīng)用，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】一種表面固載炭疸致死因子的磁性納米粒子、其制備方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能化磁性納米粒子【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與腫瘤微環(huán)境直接相關(guān)，所以關(guān)于腫瘤微環(huán)境的研究引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。腫瘤微環(huán)境中蛋白和多肽的表達(dá)通常是腫瘤相關(guān)的，很多腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞分泌的蛋白和多肽類分子被作為潛在的腫瘤微環(huán)境生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。
[0003]其中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的生物標(biāo)志物通常與腫瘤進(jìn)展時的變異相關(guān)，而腫瘤微環(huán)境中源自炎癥細(xì)胞的生物標(biāo)志物通常是來自不會隨著疾病發(fā)展發(fā)生變異且會與特殊類型的癌癥緊密相關(guān)的正常細(xì)胞。在這些生物標(biāo)志物中，我們最為關(guān)注的是潛在的愈后生物標(biāo)志物人中性粒細(xì)胞多肽(human human neutrophil peptides HNP1-3)。與其它復(fù)雜的癌癥特異性生物標(biāo)志物比較，HNP1-3已被明確提出作為很多癌癥的特征標(biāo)志物。它的豐度評價可以幫助人們從分子水平上理解疾病的發(fā)生，從而提供更有效的臨床意義的信息。盡管如此，現(xiàn)有繁冗的分離技術(shù)如HPLC或昂貴且不能廣泛應(yīng)用的所有生物標(biāo)志物的ELISA檢測方法都大大阻礙了 HNP1-3作為生物標(biāo)志物的實際應(yīng)用。因此，發(fā)展一種方便耐用而高效的HNP1-3分離方法值得我們?yōu)榇?付出努力。
[0004]近年來，分子納米技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用如火如荼。納米粒子巨大的比表面積使其具有異常高效的吸附性，還可進(jìn)一步對其表面進(jìn)行修飾從而賦予其吸附的選擇性。已經(jīng)證實納米粒子和生物分子巧妙的結(jié)合能夠應(yīng)用于設(shè)計新型納米傳感器。在眾多的納米粒子中，超順磁性納米粒子由于具有獨特的理化性質(zhì)而成為生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域的研究熱點。吸附在磁性納米粒子表面的物質(zhì)可以通過外磁場與磁性納米粒子本身一起被方便地分離出來，大大提高樣品富集的選擇性和速率。
[0005]炭疽致死因子是一類相對穩(wěn)定的金屬蛋白，它們的結(jié)構(gòu)和活性都是Zn2+依賴的。HNP1-3能夠高親度、特異性結(jié)合至炭疽致死因子的遠(yuǎn)離活性中心的一個區(qū)域位點，該結(jié)合過程不受炭疽致死因子的物理環(huán)境影響，即便是炭疽致死因子已經(jīng)和保護(hù)性抗原結(jié)合形成炭疽毒素，仍無法阻擋體內(nèi)外的炭疽致死因子與HNP1-3的結(jié)合。有趣的是，HNP1-3與炭疽致死因子的結(jié)合具有Zn2+的可逆性，當(dāng)用EDTA螯合除去Zn2+時，炭疽致死因子會失活并釋放結(jié)合到的HNP1-3 ;而當(dāng)再加入Zn2+時，炭疽致死因子會被復(fù)性，再次具有結(jié)合HNP1-3的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提出一種表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子，其制備方法，以及其在富集人中性粒細(xì)胞多肽中的應(yīng)用；本發(fā)明的表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子可快速、特異地富集人中性粒細(xì)胞多肽，以便進(jìn)行進(jìn)一步的檢測，從而方便了人中性粒細(xì)胞多肽作為腫瘤愈后生物標(biāo)志物的應(yīng)用，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
[0007]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]第一方面，本發(fā)明提供了一種表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子，其通過氨基-羧基偶聯(lián)反應(yīng)，將炭疽致死因子連接在表面具有氨基和/或羧基的超順磁性納米粒子表面而得。
[0009]上述磁性納米粒子中，作為優(yōu)選，所述表面具有氨基和/或羧基的超順磁性納米粒子包括超順磁性納米粒子、保護(hù)層和表面修飾層；
[0010]優(yōu)選地,所述超順磁性納米粒子為Fe3O4納米粒子，F(xiàn)e2O3納米粒子或FePt納米粒子，更優(yōu)選為Fe3O4納米粒子；
[0011]優(yōu)選地，所述保護(hù)層為二氧化硅、二氧化鈦或聚苯乙烯保護(hù)層，更優(yōu)選為二氧化硅保護(hù)層；
[0012]優(yōu)選地，所述表面修飾層具有裸露的氨基和/或羧基。
[0013]第二方面，本發(fā)明提供了第一方面所述磁性納米粒子的制備方法，包括以下步驟:
[0014](I)制備Fe304、Fe2O3或FePt超順磁性納米粒子；
[0015](2)將步驟⑴所得超順磁性納米粒子包覆二氧化硅、二氧化鈦或聚苯乙烯保護(hù)層；
[0016](3)將步驟(2)所得保護(hù)層包覆的超順磁性納米粒子進(jìn)行氨基化和/或羧基化修飾；
[0017](4)步驟⑶所得氨基化和/或羧基化修飾的超順磁性納米粒子表面的氨基和/或羧基與炭疽致死因子表面的羧基和/或氨基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得所述表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子。
[0018]上述制備方法中，作為優(yōu)選，步驟(1)為采用共沉淀法制備Fe3O4超順磁性納米粒子，具體步驟包括:
[0019](I’ )分別將Fe3+鹽和Fe2+鹽溶于水中，通入氮氣保護(hù)；
[0020]優(yōu)選地，所述Fe3+鹽為FeCl3或其各種水合物，優(yōu)選為FeCl3.6H20 ；
[0021]優(yōu)選地，所述Fe2+鹽為FeCl2、FeSO4或其各種水合物，優(yōu)選為FeCl2.4H20 ；
[0022]優(yōu)選地，所述Fe3+與所述Fe2+的摩爾比為(1.3~2.5): 1、優(yōu)選為(1.9~2.1):1、更優(yōu)選為(2~2.05):1 ；
[0023](2’)氮氣保護(hù)下，向步驟0- )所得溶液中加入氨水至pH為8~14、優(yōu)選為9~12、更優(yōu)選為11，反應(yīng)0.5~2h、優(yōu)選0.5~lh、更優(yōu)選為0.5h ；
[0024]優(yōu)選地，加入氨水的時間不超過3s ；
[0025]優(yōu)選地，加入氨水期間及反應(yīng)期間，保持?jǐn)嚢枞芤海?br> [0026](3’ )對步驟(2’ )所得反應(yīng)液進(jìn)行磁分離，對所分離產(chǎn)物進(jìn)行洗滌，得Fe3O4超順磁性納米粒子；
[0027]優(yōu)選地，以銣鐵硼磁鐵進(jìn)行磁分離；
[0028]優(yōu)選地，先以水、再以無水乙醇對分離產(chǎn)物進(jìn)行洗滌，洗滌后真空干燥即得Fe3O4超順磁性納米粒子。
[0029]作為優(yōu)選，步驟(2)為用二氧化硅包覆Fe3O4超順磁性納米粒子，具體包括:[0030]將Fe3O4超順磁性納米粒子以10 μ g_50mg/mL、優(yōu)選0.5mg-10mg/mL、更優(yōu)選lmg/mL的濃度分散于水中，加入體積比為(2-3):1、優(yōu)選為2.5:1的水和正硅酸乙酯的混合溶液，反應(yīng)(2-4)小時、優(yōu)選為3小時后，加入體積比為(3-5):1、優(yōu)選為4:1的乙醇和正硅酸乙酯的混合溶液，氮氣保護(hù)下反應(yīng)12-16小時后，磁分離并洗滌所得產(chǎn)物，干燥后得二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子。
[0031] 作為優(yōu)選，步驟(3)為:使用氨基化硅烷偶聯(lián)劑或羧基化硅烷偶聯(lián)劑對二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子進(jìn)行氨基化或羧基化修飾，得到表面帶有氨基或羧基的二氧化娃包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子；
[0032]優(yōu)選地，所述氨基化硅烷偶聯(lián)劑YSiX3，其中Y為氨基，X為可水解基團(tuán)；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述X為Cl，OMe, OEt, 0C2H40CH3, 0SiMe3或OAc ;最優(yōu)選地，所述氨基化硅烷偶聯(lián)劑
為氣丙基二乙氧基硅烷;
[0033]優(yōu)選地，所述羧基化硅烷偶聯(lián)劑為Y’ SiX3，其中Y’為酯基或羧基，X為可水解基團(tuán)；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 X 為 Cl，OMe，OEt, 0C2H40CH3, 0SiMe3 或 OAc ；
[0034]進(jìn)一步優(yōu)選地,步驟(3)具體為:
[0035](i)將二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子分散于水中，濃度為5 μ g_50mg/mL,優(yōu)選為 20 μ g-10mg/mL,更優(yōu)選為 0.5mg/mL ；
[0036](ii)每IOOmL步驟⑴所得二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子水溶液中加入氨基化或羧基化硅烷偶聯(lián)劑5 μ L-5mL、優(yōu)選為10 μ L_lmL、更優(yōu)選為100 μ L，反應(yīng)0-120小時、優(yōu)選6-96小時、更優(yōu)選24小時，磁分離并洗滌所得產(chǎn)物，得到表面帶有氨基或羧基的二氧化娃包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子。
[0037]作為優(yōu)選，步驟(3)為先對二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子進(jìn)行氨基化修飾，再在修飾的氨基位點上接枝主鏈碳原子數(shù)為3到15的二元酸，得到表面帶有羧基的二氧化娃包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子；
[0038]在具體實施方案中，所述二元酸為丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一二酸、十二二酸、十三二酸、十四二酸或十五二酸。
[0039]在此類實施方案中，所述二元酸的用量相對于超順磁性納米粒子表面的氨基過量，并且，二元酸的其中一個羧基與超順磁性納米粒子表面的氨基反應(yīng)，另一個羧基裸露，從而形成表面帶羧基的二氧化娃包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子。
[0040]優(yōu)選地，所述羧基化修飾是在1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的存在下進(jìn)行。
[0041]作為優(yōu)選，步驟(4)具體包括:
[0042]在1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的存在下，將氨基化和/或羧基化修飾的二氧化硅包覆的超順磁性納米粒子、優(yōu)選Fe3O4超順磁性納米粒子與炭疽致死因子進(jìn)行接枝反應(yīng)；
[0043]優(yōu)選地，在所述接枝反應(yīng)前、后或同時，優(yōu)選地，在所述接枝反應(yīng)后，用2-2-氨基乙氧基乙醇封閉所述超順磁性納米粒子上的多余的羧基位點。
[0044]第三方面，本發(fā)明提供了一種表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子，由第二方面任一項所述制備方法制得。
[0045]第四方面，本發(fā)明提供了一種富集人中性粒細(xì)胞多肽的方法，使用第一方面或第三方面所述表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子進(jìn)行富集。
[0046]使用本發(fā)明所述表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子富集人中性粒細(xì)胞多肽及后續(xù)檢測的流程如圖1所示。
[0047]本發(fā)明所述表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子可從PBS緩沖液、去離子水、唾液、眼淚、血清、胎牛血清中富集人中性粒細(xì)胞多肽，但不限于這些樣品。所獲得的磁性納米粒子上的特異性結(jié)合的中性粒細(xì)胞多肽不僅可以進(jìn)行MALD1-T0F分析檢測，而且經(jīng)EDTA處理后，被釋放進(jìn)入溶液，可以進(jìn)一步進(jìn)行HPLC等定量分析。釋放中性粒細(xì)胞多肽后的炭疽致死因子磁性納米粒子，可以經(jīng)Zn2+復(fù)性后再次應(yīng)用于中性粒細(xì)胞多肽的富集分離。
[0048]本發(fā)明利用炭疽致死因子與HNP1-3之間的特異性、可逆性結(jié)合，將其與磁分離技術(shù)有機(jī)結(jié)合，再借助傳統(tǒng)的MALD1-T0F-MS技術(shù)和HPLC技術(shù)，實現(xiàn)了 HNP1-3的富集和富集后的進(jìn)一步檢測 ；所提供的表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子可快速、特異地富集HNP1-3，大大簡化了人中性粒細(xì)胞多肽HNP1-3的富集分離檢測過程，具有很好的臨床引用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1是實施例1所得炭疽致死因子磁性納米粒子富集人中性粒細(xì)胞多肽及后續(xù)檢測的流程示意圖；
[0050]圖2是Fe3O4磁性納米粒子(a)及SiO2包覆的Fe3O4磁性納米粒子(b)的透射電鏡照片；
[0051]圖3實施例1各步驟所得磁性納米粒子在pH中性的水溶液中的表面電位變化圖譜；
[0052]圖4是實施例1各步驟所得磁性納米粒子的紅外吸收光譜；
[0053]圖5是實施例1中所得Fe3O4、Fe3O4OSiO2以及Fe3O4OAPS磁性納米粒子的磁回滯曲線.[0054]圖6是實施例1所得炭疽致死因子磁性納米粒子(即AMNP)在磁場中5秒和非磁場作用下的光學(xué)照片；
[0055]圖7是MALD1-T0F分析AMNP與HNPl的可逆性結(jié)合；
[0056]圖8是AMNP從人血清溶液中富集HNPl后的MALD1-T0F檢測圖；
[0057]圖9是AMNP、Fe3O4OCOOH從溶液中富集HNPl的MALD1-T0F檢測圖；
[0058]圖10是AMNP從GSH (即谷胱甘肽)和TCEP HCl (即三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽)的溶液中富集還原態(tài)HNPl的MALD1-T0F檢測圖，如下面兩條線所示；上面第一條線為:TCEPHCl溶液中的還原態(tài)HNPl的MALD1-T0F檢測圖；
[0059]圖11是AMNP從胎牛血清樣品中富集HNPl后的MALD1-T0F檢測圖；
[0060]圖12是AMNP從人血清樣品中富集HNPl后的MALD1-T0F檢測圖；
[0061]圖13是AMNP從人唾液樣品中富集HNPl后的MALD1-T0F檢測圖；
[0062]圖14是AMNP從人淚液樣品中富集HNPl后的MALD1-T0F檢測圖。
【具體實施方式】
[0063]下面通過具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。[0064]實施例1表面固載炭疽致死因子磁性納米粒子的制備
[0065](I) Fe3O4超順磁性納米粒子的制備
[0066]稱量54.0毫克FeCl3.6H20和212.72毫克FeCl2.4H20混合溶于52毫升水中，700rpm攪拌至完全溶解，向其中加入5毫升NH3.H2O與43毫升水的混合溶液，(3S內(nèi)加入完畢)，氮氣保護(hù)下反應(yīng)30分鐘后停止反應(yīng)，將產(chǎn)物磁吸、水洗澄清后，向其中加入100毫升水分散，備用。
[0067]所得Fe3O4磁性納米粒子的透射電鏡照片如圖2a所示，其尺寸在10納米左右。
[0068](2) 二氧化硅包覆Fe3O4超順磁性納米粒子(本文簡稱Fe3O4OSiO2)
[0069]取50毫升步驟(1)所得Fe3O4納米粒子溶液，向其中加入50毫升水和20微升正硅酸乙酯(Na2SiO3)的混合溶液，反應(yīng)3小時后，向其中加入80微升正硅酸乙酯與20微升乙醇的混合溶液，氮氣保護(hù)下反應(yīng)過夜，24小時后，水洗至上清澄清。加入50毫升水分散沉淀，得Fe3O4OSiO2超順磁性納米 粒子儲備液，備用。
[0070]所得Fe3O4OSiO2超順磁性納米粒子的透射電鏡照片如圖2b所示，其尺寸在100納
米左右。
[0071](3) Fe3O4OSiO2超順磁性納米粒子的氨基化修飾
[0072]取25毫升步驟(2)所得Fe3O4OSiO2儲備液，向其中加入75毫升水?dāng)嚢杈鶆蚝?，向其中加入氨丙基三乙氧基硅?APS) 100微升，氮氣保護(hù)下，攪拌均勻并充分反應(yīng)48小時和20微升后，停止反應(yīng)，并反復(fù)水洗產(chǎn)物，將沉淀分散于25毫升體系，獲得氨基化修飾的二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子(本文簡稱Fe3O4(MPS)儲備液，備用。
[0073]⑷Fe3O4IiAPS超順磁性納米粒子的羧基化修飾
[0074]將121.84毫克(過量的)辛二酸溶于45毫升PBS緩沖液中，向其中加入26.84毫克1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，攪拌15分鐘獲得澄清透明溶液，向其中加入58毫克N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和5毫升步驟(3)所得氨基化修飾的二氧化娃包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子儲備液,攪拌均勻，繼續(xù)反應(yīng)24小時后終止反應(yīng),磁洗數(shù)次后，將產(chǎn)物分散于5毫升水中，獲得表面帶裸露羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子(本文簡稱Fe3O4IgCOOH)分散液，備用。
[0075]該步驟中，辛二酸的一個羧基與Fe3O4IgAPS表面的氨基接枝，另一個羧基裸露，從而形成表面帶羧基的二氧化娃包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子。
[0076](5)炭疽致死因子的固載
[0077]取10微升步驟(4)所得Fe3O4OCOOH超順磁性納米粒子分散液，向其中加入7.72微升(8.10微克)2-2-氨基乙氧基乙醇和0.08微摩爾(即35.34微克)EDC，作用15分鐘后，向其中加入0.2微摩爾(即23微克)NHS，反應(yīng)15分鐘后，向其中加入10微克炭疽致死因子(ALF，商購獲得)，繼續(xù)反應(yīng)24小時后，磁吸水洗產(chǎn)物，獲得本發(fā)明的表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子(本文簡稱AMNP，又稱為Fe3O4OALF)，將產(chǎn)物分散于10微升水中，備用于中性粒細(xì)胞多肽的富集和檢測。
[0078]對上述各步所得磁性納米粒子分別進(jìn)行如下檢測:
[0079](i)在pH中性的水溶液中的表面電位變化
[0080]上述各步所得磁性納米粒子的表面電位變化圖譜如圖3所示，圖3顯示:磁性納米粒子在pH中性的水溶液中的表面電位從Fe3O4納米粒子時的-7.8mV,到Fe3O4OSiO2時的-35mV，再到Fe3O4OAPS時的16mV和Fe3O4OCOOH時的_10mV，表明每一步化學(xué)修飾的成功實現(xiàn)。
[0081](ii)紅外吸收光譜檢測
[0082]上述各步所得磁性納米粒子的紅外吸收光譜如圖4所示，圖4顯示:與未經(jīng)任何修飾的Fe3O4磁性納米粒子相比,Fe3O4OSiO2在1047(^1處出現(xiàn)了新的對應(yīng)于V S1-O-Si^振動，繼而Fe3O4OAPS在1511CHT1和1468cm_1處出現(xiàn)了分別對應(yīng)于δ NH和v CH2的振動，然后Fe3O4IgCOOH樣品在1528，1406cm_1處出現(xiàn)了酰胺帶和v C - O振動，這些也表明每一步化學(xué)修飾的成功實現(xiàn)。
[0083](iii)磁回滯曲線
[0084]Fe304、Fe304@Si02 以及 Fe3O4OAPS 的磁回滯曲線如圖 5 所示，圖 5 顯示:Fe3O4、Fe3O4OSiO2以及Fe3O4IiAPS磁性納米粒子保持了超順磁性質(zhì)和較高的飽和磁化率。
[0085](iv)表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子(AMNP)的超順磁性檢測
[0086]AMNP在磁場中5秒和非磁場作用下的光學(xué)照片如圖6所不，圖6結(jié)果表明:AMNP具有良好的超順磁性。
[0087]實施例2AMNP 與HNPl的可逆件結(jié)合
[0088]采用MALD1-T0F分析AMNP與HNPl的可逆性結(jié)合，結(jié)果如圖7所示:
[0089]將實施例1所得AMNP (活化的)與HNPl結(jié)合后，經(jīng)EDTA螯合除去表面炭疽致死因子中的Zn2+致其失活，失活的AMNP會釋放所有的HNPl (圖7，通道I)，致使AMNP顆粒上沒有可以檢測到的HNPl (圖7，通道2)。向失活的AMNP加入Zn2+，失活的AMNP將重新復(fù)活，并可以第二次用于HNPl的選擇性吸附，MALD1-T0F可以分析檢測到結(jié)合的HNPl (圖7，通道3);這些新結(jié)合的HNPl會由于AMNP再次失去Zn2+而(EDTA螯合除去炭疽致死因子中的Zn2+)而被釋放，得到的失活A(yù)MNP上沒有MALD1-T0F可檢測到的HNPl (圖7，通道4);再次加入Zn2+，會伴隨著AMNP的第二次復(fù)性，并可應(yīng)用于HNPl的第三次檢測(圖7，通道5)，但是第三次檢測所結(jié)合的HNPl無法通過EDTA的再次螯合滅活A(yù)MNP而被完全釋放(圖7，通道6)，上述各MALD1-T0F分析的檢測體積均為I微升。
[0090]實施例3AMNP對HNPl的富集實例
[0091 ] 圖8為使用I微升實施例1所得AMNP溶液，從650微升人血清溶液(HNP1濃度為
0.8微克/毫升)中富集獲得的AMNP-HNP1的MALD1-T0F譜，圖8顯示:AMNP能夠從溶液中富集到HNPI。
[0092]圖9為AMNP從溶液中富集HNPl的另一個實例，圖9顯示:AMNP能夠從溶液中富集到HNPl形成AMNP-HNP1復(fù)合物，但是Fe3O4OCOOH無法富集到溶液中的HNPl。
[0093]圖10是AMNP從GSH (即谷胱甘肽)和TCEP HCl (即三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽)的溶液中富集還原態(tài)HNPl的MALD1-T0F檢測圖。其中，上面第一條線為TCEP HCl溶液中的還原態(tài)HNPl的MALD1-T0F檢測圖；下面兩條線分別顯示AMNP從GSH和TCEP HCl的溶液中富集還原態(tài)HNPl的結(jié)果，結(jié)果表明:AMNP無法富集還原態(tài)的HNPl。
[0094]實施例4AMNP應(yīng)用于胎牛血清樣品中的HNPl的富集和MALDI檢測
[0095]取I微升上述AMNP磁性納米粒子溶液，加至7.5微升含有40微克/毫升HNPl的胎牛血清溶液中，作用半小時后，磁吸分離獲得吸附有中性粒細(xì)胞多肽的磁性顆粒，再用MALD1-T0F進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖11所示。[0096]圖11顯示了 I微升AMNP溶液與7.5微升含40微克/毫升HNPl的胎牛血清溶液作用后形成的AMNP-HNP1復(fù)合物的MALD1-T0F分析(上面的線)；對比而言，在同樣的檢測條件下，單純使用MALD1-T0F分析技術(shù)卻無法分析出上述胎牛血清溶液中的HNPl (下面的線)，再次表明了 AMNP對胎牛血清溶液中HNPl的特異性富集作用。
[0097]實施例5AMNP應(yīng)用于人血清樣品中的HNPl的富集和MALDI檢測
[0098]取I微升上述AMNP磁性納米粒子溶液，加至5微升含有100微克/毫升HNPl的人血清溶液中，作用半小時后，磁吸分離獲得吸附有中性粒細(xì)胞多肽的磁性顆粒，再用MALD1-T0F進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖12所示。
[0099]圖12顯示了上述I微升AMNP溶液與5微升含100微克/毫升HNPl的胎牛血清溶液作用后形成的AMNP-HNP1復(fù)合物的MALD1-T0F分析(上面的線)；對比而言，在同樣的檢測條件下，單純使用MALD1-T0F分析技術(shù)卻無法分析出上述人血清溶液中的HNPl (下面的線)，再次表明了 AMNP對人血清溶液中HNPl的特異性富集作用。
[0100]實施例6AMNP應(yīng)用于人唾液樣品中的HNPl的富集和MALDI檢測
[0101]取I微升上述AMNP磁性納米粒子溶液，加至400微升健康人唾液中，作用半小時后，磁吸分離獲得吸附有中性粒細(xì)胞多肽的磁性顆粒，再用MALD1-T0F進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖13所示。
[0102]實施例7AMNP應(yīng)用于人淚液樣品中的HNPl的富集和MALDI檢測
[0103]取I微升上述AMNP磁性納米粒子溶液，加至280微升健康人淚液中，作用半小時后，磁吸分離獲得吸附 有中性粒細(xì)胞多肽的磁性顆粒，再用MALD1-T0F進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖14所示。
[0104] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于上述，SP不意味著本發(fā)明必須依賴上述才能實施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子，其特征在于，通過氨基-羧基偶聯(lián)反應(yīng)，將炭疽致死因子連接在表面具有氨基和/或羧基的超順磁性納米粒子表面而得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米粒子，其特征在于，表面具有氨基和/或羧基的超順磁性納米粒子包括超順磁性納米粒子、保護(hù)層和表面修飾層； 優(yōu)選地，所述超順磁性納米粒子為Fe3O4納米粒子,Fe2O3納米粒子或FePt納米粒子,更優(yōu)選為Fe3O4納米粒子； 優(yōu)選地，所述保護(hù)層為二氧化硅、二氧化鈦或聚苯乙烯保護(hù)層，更優(yōu)選為二氧化硅保護(hù)層； 優(yōu)選地，所述表面修飾層具有裸露的氨基和/或羧基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的磁性納米粒子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備Fe304、Fe2O3或FePt超順磁性納米粒子； (2)將步驟(1)所得超順磁性納米粒子包覆二氧化硅、二氧化鈦或聚苯乙烯保護(hù)層； (3)將步驟(2)所得保護(hù)層包覆的超順磁性納米粒子進(jìn)行氨基化和/或羧基化修飾； (4)步驟(3)所得氨基化和/或羧基化修飾的超順磁性納米粒子表面的氨基和/或羧基與炭疽致死因子表面的羧基和/或氨基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得所述表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)為采用共沉淀法制備Fe3O4超順磁性納米粒子，具體步驟包括: 0- )分別將Fe3+鹽和Fe2+鹽溶于水中，通入氮氣保護(hù)； 優(yōu)選地，所述Fe3+鹽為FeCl3或其各種水合物，優(yōu)選為FeCl3.6H20 ； 優(yōu)選地，所述Fe2+鹽為FeCl2、FeSO4或其各種水合物，優(yōu)選為FeCl2.4H20 ； 優(yōu)選地，所述Fe3+與所述Fe2+的摩爾比為(1.3~2.5): 1、優(yōu)選為(1.9~2.1):1、更優(yōu)選為(2~2.05):1 ； (2’ )氮氣保護(hù)下，向步驟0- )所得溶液中加入氨水至pH為8~14、優(yōu)選為9~12、更優(yōu)選為11，反應(yīng)0.5~2h、優(yōu)選0.5~lh、更優(yōu)選為0.5h ； 優(yōu)選地，加入氨水的時間不超過3s ； 優(yōu)選地，加入氨水期間及反應(yīng)期間，保持?jǐn)嚢枞芤海? (3’ )對步驟(2’ )所得反應(yīng)液進(jìn)行磁分離，對所分離產(chǎn)物進(jìn)行洗滌，得Fe3O4超順磁性納米粒子； 優(yōu)選地，以銣鐵硼磁鐵進(jìn)行磁分離； 優(yōu)選地，先以水、再以無水乙醇對分離產(chǎn)物進(jìn)行洗滌，洗滌后真空干燥即得Fe3O4超順磁性納米粒子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)為用二氧化硅包覆Fe3O4超順磁性納米粒子，具體步驟包括: 將Fe3O4超順磁性納米粒子以10 μ g_50mg/mL、優(yōu)選0.5mg-10mg/mL、更優(yōu)選lmg/mL的濃度分散于水中，加入體積比為(2-3):1、優(yōu)選為2.5:1的水和正硅酸乙酯的混合溶液，反應(yīng)(2-4)小時、優(yōu)選為3小時后，加入體積比為(3-5):1、優(yōu)選為4:1的乙醇和正硅酸乙酯的混合溶液，氮氣保護(hù)下反應(yīng)12-16小時后，磁分離并洗滌所得產(chǎn)物，干燥后得二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)為:使用氨基化硅烷偶聯(lián)劑或羧基化硅烷偶聯(lián)劑對二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子進(jìn)行氨基化或羧基化修飾，得到表面帶有氨基或羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子； 優(yōu)選地，所述氨基化硅烷偶聯(lián)劑YSiX3，其中Y為氨基，X為可水解基團(tuán)；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述X為Cl，OMe, OEt, 0C2H40CH3, 0SiMe3或OAc ;最優(yōu)選地，所述氨基化硅烷偶聯(lián)劑為氨丙基二乙氧基硅烷; 優(yōu)選地，所述羧基化硅烷偶聯(lián)劑為Y’ SiX3，其中Y’為酯基或羧基，X為可水解基團(tuán)；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 X 為 Cl, OMe, OEt, 0C2H40CH3, 0SiMe3 或 OAc ； 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(3)包括以下步驟: (i)將二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子分散于水中，濃度為5μ g-50mg/mL，優(yōu)選為 20 μ g-10mg/mL,更優(yōu)選為 0.5mg/mL ； (ii)每IOOmL步驟(i)所得二氧化娃包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子水溶液中加入氨基或羧基硅烷偶聯(lián)劑5 μ L-5mL、優(yōu)選為10 μ L_lmL、更優(yōu)選為100 μ L，反應(yīng)0-120小時、優(yōu)選6-96小時、更優(yōu)選24小時，磁分離并洗滌所得產(chǎn)物，得到表面帶有氨基或羧基的二氧化娃包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)為:先對二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子進(jìn)行氨基化修飾，再在修飾的氨基位點上接枝主鏈碳原子數(shù)為3到15的二元酸，得到表面帶有羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超順磁性納米粒子； 優(yōu)選地，所述羧基化修飾是在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的存在下進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)為: 在1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的存在下，將氨基化和/或羧基化修飾的二氧化娃包覆的超順磁性納米粒子、優(yōu)選Fe3O4超順磁性納米粒子與炭疽致死因子進(jìn)行接枝反應(yīng)； 優(yōu)選地，在所述接枝反應(yīng)前、后或同時，優(yōu)選地，在所述接枝反應(yīng)后，用2-2-氨基乙氧基乙醇封閉所述超順磁性納米粒子上的多余的羧基位點。
9.一種表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子，由權(quán)利要求3-8任一項所述制備方法制得。
10.一種富集人中性粒細(xì)胞多肽的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1、2或8所述表面固載炭疽致死因子的磁性納米粒子進(jìn)行富集。
【文檔編號】C07K17/14GK103980365SQ201410241919
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】梁興杰, 趙元元, 鄒國漳, 李志鵬, 陳飛, 張旭, 李盛亮, 王義峰, 王東亮, 姜永剛, 甘雅玲 申請人:國家納米科學(xué)中心