本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和臨床檢測診斷領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測外周血egfr基因t790m突變的試劑盒及其方法。

背景技術(shù)：

肺癌是當(dāng)今最常見的惡性腫瘤之一，也是高致死率的癌癥之一，其中80～85％的患者為非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancers，nsclc)。根據(jù)《2012中國腫瘤登記年報(bào)》報(bào)道，我國癌癥發(fā)病率和死亡率分別為286/10萬人和181/10人萬，相當(dāng)于每分鐘就有5～6個人確診癌癥，平均每5位癌癥患者3個人死亡。在我國所有的腫瘤類別中，肺癌發(fā)病率和死亡率高居第一，高達(dá)54/10萬人和45/10萬人，換句話說，每分鐘確診的6位癌癥患者中，就有1位是肺癌，并且死亡率極高。

以表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)為靶點(diǎn)，實(shí)施小分子基因靶點(diǎn)向藥物(如易瑞沙)治療，在非小細(xì)胞肺癌的治療中日漸突出。大量研究表明，egfr突變與tki療效具有相關(guān)性，因此并非所有肺癌患者都可以從tki(酪氨酸激酶抑制劑)治療中獲益。攜帶egfr基因突變的nsclc患者在接受易瑞沙和特羅凱治療時療效顯著，但是研究發(fā)現(xiàn)egfr外顯子20上的t790m突變位點(diǎn)為耐藥位點(diǎn)，會抑制易瑞沙和特羅凱等藥物的療效。同時隨著tki藥物在臨床的廣泛推廣和應(yīng)用，約30～40％患者接受tki治療后出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)t790m基因隨之發(fā)生突變。因此在服用tki藥物之后，需要對t790m突變進(jìn)行定期監(jiān)控，以幫助醫(yī)生選擇最佳的治療方案。

目前大量的文獻(xiàn)和研究證實(shí)，通過無創(chuàng)性腫瘤診斷的方法可以進(jìn)行腫瘤的早期診斷，即通過檢測腫瘤患者外周血中游離的dna可以檢測到全身各處原發(fā)灶的多種異?；颍虼藢790m突變監(jiān)測可以通過對患者外周血中游離的dna進(jìn)行檢測。外周血中游離的dna為大小不一的dna片段，從幾bp到幾千bp。但是外周血中游離的dna在血液中的含量很低，故而t790m突變的dna含量就更少了，一般從1ml外周血中提取出來的dna含量低于1ng，約為10～500拷貝左右。目前市場中液體試劑盒的靈敏度和精密度很難達(dá)到檢測要求，同時在檢測的過程中加入5～10μl的dna模板量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動液比較大，因此很多實(shí)驗(yàn)室采用數(shù)字pcr(ddpcr)進(jìn)行檢測。數(shù)字pcr精確度很高，但是其對設(shè)備要求高，操作過程困難及通量限制使得其在臨床推廣上受到了極大的制約。不僅如此，市場上現(xiàn)有的的試劑產(chǎn)品都為液態(tài)試劑，在運(yùn)輸和保存過程中對于溫度具有嚴(yán)格的要求，具有明顯的略勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種檢測外周血中游離dna的egfr基因t790m突變的試劑盒及其方法，提高檢測的準(zhǔn)確度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于檢測外周血egfr基因t790m突變的組合物，其包括檢測t790m的引物對和探針，其中，檢測t790m的引物對由seqidno：1所示序列的上游引物和seqidno：2所示序列的下游引物組成，檢測t790m的探針為seqidno：3所示序列。

為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，上述用于檢測外周血egfr基因t790m突變的組合物還包括內(nèi)參引物對和內(nèi)參探針，其中，所述內(nèi)參引物對由seqidno：4所示序列的上游引物和seqidno：5所示序列的下游引物組成，所述內(nèi)參探針為seqidno：6所示序列。

優(yōu)選地，所有探針的5’-端標(biāo)記熒光基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)選自fam、hex、vic、joe、cy3、tamra；所有探針的的3’-端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，所述淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2、tamra；其中檢測t790m的探針和內(nèi)參探針的熒光基團(tuán)不同；更優(yōu)選地，檢測t790m的探針5’-端標(biāo)記fam，內(nèi)參探針5’-端標(biāo)記hex。

各引物及探針的核苷酸序列如表1所示。

表1引物及探針核苷酸序列表

本發(fā)明還提供一種含有上述組合物的用于檢測外周血egfr基因t790m突變的檢測體系。

優(yōu)選地，該檢測體系為凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系，其還包括凍干骨架，凍干保護(hù)劑，dntps和酶混合液。

優(yōu)選地，所述凍干骨架包括0.1％～0.5％甲基纖維素(mc)和/或0.5％～5％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)；所述凍干保護(hù)劑包括1％～5％的海藻糖；所述dntps包括0.1～0.3mm的datp、dctp、dgtp和dutp；所述酶混合液包括1～3uhotstarttaqdna聚合酶、1～2uung酶。

本發(fā)明還提供一種含有上述組合物的用于檢測外周血egfr基因t790m突變的試劑盒。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括陽性參考品和陰性參考品。

最后，本發(fā)明提供一種用于非診斷和非治療目的的采用上述試劑盒來檢測外周血egfr基因t790m突變的方法，其包括熒光pcr反應(yīng)體系的凍干程序，其包括如下步驟：

1)將預(yù)先配置的熒光pcr反應(yīng)體系按50μl分裝到八聯(lián)排管中；

2)-60℃預(yù)凍4h；

3)-45℃抽真空大氣壓小于100mtorr，作用時間為20h；

4)25℃抽真空大氣壓小于100mtorr，作用時間為2h；

經(jīng)過上述處理獲得凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系。

優(yōu)選地，所述每一凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系的重量約為2～3mg。

優(yōu)選地，上述檢測外周血egfr基因t790m突變的方法還包括熒光pcr反應(yīng)體系的擴(kuò)增程序，其包括如下步驟：

a)分別向凍干的八聯(lián)排管中的熒光pcr反應(yīng)體系中加入50μl樣本、陽性參考品、陰性參考品和洗脫液；

b)按照下述條件進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)：

優(yōu)選地，上述檢測外周血egfr基因t790m突變的方法還包括熒光pcr反應(yīng)體系的擴(kuò)增程序檢測結(jié)果的分析，在此反應(yīng)體系中，檢測t790m的探針在5’-端標(biāo)記fam基團(tuán)，內(nèi)參探針在在5’-端標(biāo)記hex基團(tuán)，該檢測結(jié)果的分析包括如下步驟：

i)陰性對照無“s”曲線；

ii)陽性對照有“s”曲線，且ct值小于25；

iii)樣本孔hex通道觀察到擴(kuò)增曲線，且ct值小于30；

同時滿足上述要求后，樣本孔fam通道觀察到擴(kuò)增曲線，且cthex-ctfam絕對值<15循環(huán)，則樣本中含有t790m突變。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明所采用的試劑盒和方法通過從患者外周血中富集所有的游離dna，采用熒光pcr反應(yīng)進(jìn)行突變檢測，降低通過手術(shù)或穿刺對患者造成的傷害，同時本發(fā)明所采用的獨(dú)特的凍干技術(shù)會顯著提高熒光pcr反應(yīng)檢測低拷貝突變的能力。

附圖說明

圖1是樣本中提取dna擴(kuò)增曲線的示意圖，樣本檢測結(jié)果為陽性；

圖2是陽性對照和陰性對照擴(kuò)增曲線的示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種用于檢測外周血egfr基因t790m突變的組合物，包括由seqidno：1所示序列的上游引物和seqidno：2所示序列的下游引物組成檢測t790m的引物對和seqidno：3所示序列的檢測t790m的探針；還包括由seqidno：4所示序列的上游引物和seqidno：5所示序列的下游引物組成的內(nèi)參引物對和seqidno：6所示序列的內(nèi)參探針；其中各探針的5’-端標(biāo)記熒光基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)選自fam、hex、vic、joe、cy3、tamra；所有探針的的3’-端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，所述淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2、tamra。引物及探針的核苷酸序列詳見表1。

本發(fā)明還提供一種含有上述組合物的用于檢測外周血egfr基因t790m突變的檢測體系，該檢測體系為凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系，其還包括凍干骨架、凍干保護(hù)劑、dntps和酶混合液。

本發(fā)明還提供一種含有上述檢測體系的用于檢測外周血egfr基因t790m突變的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒還包括陽性參考品和陰性參考品。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1-從肺小細(xì)胞癌患者外周血中提取dna

從肺小細(xì)胞癌患者外周血中提取dna的具體操作方式如下：

樣本收集和處理：

(1)選取10例腫瘤患者，每位抽取5ml靜脈血分別放入edta抗凝管中。

(2)將收集的新鮮外周血離心，800g10min，用移液器將上層上清移入無核酸酶污染的離心管中。

(3)再經(jīng)過8000g離心5min，取上清液于無核酸酶污染的離心管中，-80℃保存，備用。

(4)需要在4h內(nèi)將外周血進(jìn)行離心處理，分離出的血漿可于4℃短期放置，建議盡快進(jìn)行外周血dna提取，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)施例2-外周血游離dna提取

采用上海默禮生物醫(yī)藥科技有限公司的核酸提取試劑盒提取dna，具體操作如下：

(1)10份分離好的血漿分別取1～2ml，加入與血漿等體積的裂解液(lb)和20μl蛋白酶k(20mg/ml)，充分混勻。

(2)56℃孵育30min。

(3)加入與血漿等體積的等體積的結(jié)合液(bb)和50mg1μm超順磁珠和與血漿等體積的等體積的無水乙醇，充分混勻，65℃孵育10min，每隔2min混勻一次。

(4)將樣本瞬時離心后放置于磁力架上，吸附2min，盡量吸干、棄去液體。

(5)加入500μl洗滌液1(wb1)充分混勻洗滌1次。

(6)加入500μl洗滌液2(wb2)充分混勻洗滌1-2次。

(7)將洗滌后樣本放置于磁力架上，吸附2min，盡量吸干、棄去液體，放置2-5min，使殘留的乙醇揮發(fā)掉，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(8)加入50～100μl洗脫液、生理鹽水或無菌水，充分混勻，室溫(或56℃，可以提高得率)孵育5min，混勻后于磁力架上吸附2min，收集液體，即為提取的dna溶液。

實(shí)施例3-制備凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系

制備凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系的步驟如下：

(1)在預(yù)先配置的熒光pcr反應(yīng)體系按50μl分裝到八聯(lián)排管中；

(2)-60℃預(yù)凍4h；

(3)-45℃抽真空大氣壓小于100mtorr，作用時間為20h；

(4)25℃抽真空大氣壓小于100mtorr，作用時間為2h。

通過上述處理，經(jīng)過上述處理獲得凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系，其中所述每一凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系的重量約為2～3mg。

上述熒光pcr反應(yīng)體系的組成如下：引物和探針濃度各300nm，由seqidno：1所示序列的上游引物和seqidno：2所示序列的下游引物組成檢測t790m的引物對和seqidno：3所示序列的檢測t790m的探針；由seqidno：4所示序列的上游引物和seqidno：5所示序列的下游引物組成的內(nèi)參引物對和seqidno：6所示序列的內(nèi)參探針；凍干骨架；凍干保護(hù)劑；dntps；酶混合液；其中所述凍干骨架包括0.1％～0.5％甲基纖維素(mc)和/或0.5％～5％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)等；所述凍干保護(hù)劑包括1％～5％的海藻糖；所述dntps包括0.1～0.3mm的datp、dctp、dgtp和dutp；所述酶混合液包括1～3uhotstarttaqdna聚合酶，1～2uung酶。

在反應(yīng)體系中，檢測t790m的探針5’-端標(biāo)記fam，內(nèi)參探針5’-端標(biāo)記hex，探針3’-端標(biāo)記bhq1、bhq2、tamra中的一種。

實(shí)施例4-凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系擴(kuò)增臨床樣本dna

在試劑準(zhǔn)備間、樣本處理間和擴(kuò)增間完成pcr的準(zhǔn)備工作，按照下面方法進(jìn)完成加樣工作：

(1)陽性參考品和陰性參考品，8000rpm離心2min后，加入500μl水溶解。

(2)按實(shí)施例3準(zhǔn)備凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系，按照樣本數(shù)(n)、陽性參考品、陰性參考品和pcr參考品準(zhǔn)備反應(yīng)體系，即n＝3。

(3)分別向凍干的八聯(lián)排管中的熒光pcr反應(yīng)體系中加入50μl樣本、陽性參考品、陰性參考品和洗脫液(或生理鹽水或無菌水)。

(4)蓋好管蓋瞬時離心，上機(jī)。

(5)擴(kuò)增程序：

(6)檢測結(jié)果說明：

1)陰性對照無“s”曲線；(如圖2所示)

2)陽性對照有“s”曲線，且ct值小于25；(如圖1所示)

3)樣本孔hex通道觀察到擴(kuò)增曲線，且ct值小于30；

同時滿足上述要求后，樣本孔fam通道觀察到擴(kuò)增曲線，且cthex-ctfam絕對值<15循環(huán)，則樣本中含有t790m突變。

(7)10例臨床樣本結(jié)果分析

10例樣本的檢測結(jié)果與數(shù)字pcr檢測結(jié)果完全一致，因此采用凍干方法開發(fā)的t790m檢測試劑盒，其檢測的靈敏性較好，可以替代數(shù)字pcr向臨床推廣。

由上述實(shí)施例可知，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針靈敏度高且特異性好，該技術(shù)操作簡單、生物風(fēng)險(xiǎn)小、結(jié)果準(zhǔn)確度高，具有非常廣的應(yīng)用前景。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>上海默禮生物醫(yī)藥科技有限公司

<120>一種用于檢測外周血egfr基因t790m突變的試劑盒及其方法

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