本發(fā)明涉及一種病原菌的檢測試劑盒與檢測方法，特別是一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測試劑盒與檢測方法。

背景技術：

需鈉弧菌是海洋微生物中常見的兼性厭氧細菌，廣泛存在于河口入海處、近海岸的海水、海底沉積物及海生動物中，是一種條件致病菌，可導致水產(chǎn)養(yǎng)殖動物患病死亡，死亡率高達87.5-100%，嚴重危害我國海水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

目前鑒定弧菌的技術有：

1、經(jīng)典的生理生化鑒定方法，該法繁瑣、耗時、且要求操作人員有良好的專業(yè)素養(yǎng)；

2、細菌快速自動鑒定系統(tǒng)，該法需要昂貴的儀器設備和技術熟練的操作人員；

3、基于核酸的檢測技術，包括dna探針和pcr技術(聚合酶鏈式反應技術)，相對上述檢測技術而言，該技術具有快速、簡捷、靈敏等特點。

但是，目前針對該需鈉弧菌的研究主要停留在病原的分離和實驗室鑒定，還沒有一個快速檢測方法報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種新的三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測試劑盒，實現(xiàn)三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速、準確檢測。

本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供了應用上述試劑盒進行三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測的方法。

本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測試劑盒，其特點是，該試劑合由下列物品組成：

1)陰性對照，成份為1ml滅菌雙蒸水1支;

2)陽性對照，試劑成份為溶于1ml滅菌雙蒸水中100ng的需鈉弧菌（vibrionatriegens）xa1菌株dna1支；

3)含mg²⁺、dntp和dna聚合酶的pcr緩沖液1支；

4)引物對toxr-f/toxr-r

toxr-f為：5'-aatccgctttcctctgtt-3'1支；

toxr-r為：5'-ggcgttagcacaggtaca-3'1支；

5)引物對vhh-f/vhh-r

vhh-f：5'-aatgtcatccgccaacga-3'1支；

vhh-r：5'-ccgtcaggcgaatcaatg-3'1支；

6)滅菌雙蒸水1支；

7)包裝盒子，一塊泡沫板，其大小與包裝盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應放置于這些小孔中；將陽性對照單獨存放；試劑盒于-20°c保存。

本發(fā)明方法中所涉及的菌株需鈉弧菌（vibrionatriegens）xa1，已經(jīng)在《三疣梭子蟹病原-需鈉弧菌的分離和分子鑒定》中公開，上述公開文獻發(fā)表于世界水產(chǎn)學會雜志（journaloftheworldaquaculturesociety），2016，47(6):854-861。

菌株需鈉弧菌（vibrionatriegens）xa1為公知公用材料，現(xiàn)保存在淮海工學院海洋生命與水產(chǎn)學院實驗室，在本專利申請日起二十年內(nèi)，公眾如果需要，淮海工學院海洋生命與水產(chǎn)學院實驗室可對外發(fā)放。

本發(fā)明所述的一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測試劑盒，其進一步優(yōu)選的技術方案是，引物設計的設計方法如下：參照genbank上收錄需鈉弧菌的溶血素vhh基因序列dq663483和跨膜轉錄激活蛋白toxr基因序列jf930637設計兩對引物。

本發(fā)明還公開了一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測方法，其特點是，利用以上技術方案所述的試劑盒進行三疣梭子蟹需鈉弧菌病原雙重pcr檢測方法；檢測前準備細菌基因組提取試劑盒；檢測步驟如下：

（1）dna模板的提取：將1ml過夜培養(yǎng)的需鈉弧菌（vibrionatriegens）xa1菌液，12,000g離心1min，盡量棄上清；加入100μllb11和20μl蛋白酶k，震蕩至菌體徹底懸浮；55°c孵育20min；加入20μlrnasea混勻靜置2min；加入400μlbb11渦旋30s；將全部液體加入離心柱中，12,000g離心30s，棄流出液；加入500μlcb11，12,000g離心30s，棄流出液；再加入500μlcb11，12,000g離心30s，棄流出液；加入500μlwb11，12000g離心30s，棄流出液；再加入500μlwb11，12,000g離心30s，棄流出液；12000g離心2min，徹底去除殘留的wb11；將離心柱轉移至一個新的1.5ml離心管中，在柱的中央加入100μl預熱的洗脫液室溫靜置5min，12000g離心1min，洗脫dna；再將洗脫液置于離心柱中，室溫靜置5min，12000g離心1min，得dna模板，-20°c保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）pcr預混合液的配制，分別采用以下方法：

使用前將試劑盒中需用試劑離心數(shù)秒鐘后，按下列方式加入各種成分，除dna模板外的各試劑預先加入混合好后，最后加入提取的dna模板、陽性對照或陰性對照，加dna模板的區(qū)域與加入其它試劑的區(qū)域分開，總體積為25μl；

pcr預混合液加入方式:

含mg²⁺、dntp和dna聚合酶的pcr緩沖液13μl

引物對toxr-f/toxr-r各2μl

引物對vhh-f/vhh-r各1μl

滅菌雙蒸水4-5μl

dna模板或陽性對照或陰性對照1-2μl

總體積：25μl

（3）將pcr預混合液裝入pcr反應管，置于基因擴增儀中，如儀器無熱蓋，加入1-2滴石蠟油封蓋；設置pcr循環(huán)參數(shù)如下，進行擴增：

95℃預變性5min后，

94℃變性1min、53.3℃退火45s、72℃延伸1min，30個循環(huán)，

最后72℃延伸10min；

（4）擴增反應結束后取加入2μl溴酚藍與3μlpcr混合液混勻，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓按長度5v/cm電泳30-40min后于紫外分析儀下觀查結果:若在308bp和526bp處出現(xiàn)條帶，則證明需鈉弧菌為陽性，說明陽性對照或待測樣品中攜帶需鈉弧菌；否則為陰性，說明陰性對照或待測樣品中不攜帶需鈉弧菌。

以上所述的一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測方法，進一步優(yōu)選的技術方案是，dna模板的提取過程中：過夜培養(yǎng)的需鈉弧菌（vibrionatriegens）xa1菌液培養(yǎng)方法如下：取2.6g2216e固體培養(yǎng)基加過濾海水至100ml，調ph值為7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘后倒平板；超凈臺內(nèi)劃線接種需鈉弧菌（vibrionatriegens）xa1，28℃培養(yǎng)24小時后，挑取單菌落至2ml2216e液體培養(yǎng)基中28℃過夜培養(yǎng)。

在蝦蟹養(yǎng)殖過程中，通過采用本發(fā)明試劑盒與檢測方法對養(yǎng)殖對象和養(yǎng)殖水體進行定期檢測，實現(xiàn)海水甲殼動物需鈉弧菌病原的動態(tài)監(jiān)測，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)某一動物攜帶有該病原，則及時使用相應藥物進行早期防治，避免病原在水產(chǎn)動物間的擴散傳播，減少需鈉弧菌病害給水生甲殼動物養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大損失，從而對海水甲殼動物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展起到積極有效的作用。在水產(chǎn)動物苗種病原檢測中，本發(fā)明方法可以對需鈉弧菌進行精準檢測，確保所選親本和放養(yǎng)的蟹/蝦苗不攜帶需鈉弧菌病原，減少養(yǎng)殖過程中需鈉弧菌病害的發(fā)生。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明設計了一種快速特異的雙重pcr檢測試劑盒與檢測方法，實現(xiàn)對需鈉弧菌精準檢測。該檢測方法的優(yōu)點主要體現(xiàn)在一下幾方面：1）基于溶血素（vhh）基因和跨膜轉錄激活蛋白（toxr）基因為靶目標，針對基因特異性區(qū)域設計引物進行pcr檢測，結果僅對需鈉弧菌呈現(xiàn)陽性，其它弧菌和細菌都是陰性，避免16srrna-pcr檢測方法假陽性的出現(xiàn)，具有較高的特異性；2）該檢測方法具有較高的靈敏性，最低可以檢測出13.2pg的需鈉弧菌基因組dna。3）利用優(yōu)化好的pcr體系進行檢測，操作簡單，不需要專門技術人員，而且全程時間很短，耗時少。

附圖說明

圖1為實施例4中需鈉弧菌pcr特異性檢測結果圖。圖中：m：dl2000marker，1：需鈉弧菌vhh基因單一pcr結果；2：需鈉弧菌toxr基因單一pcr結果；3：需鈉弧菌vhh基因和toxr基因雙重pcr結果；4：霍亂弧菌雙重pcr結果；5：副溶血弧菌雙重pcr結果；6：河口弧菌雙重pcr結果；7：鰻弧菌雙重pcr結果；8：嗜水氣單胞菌雙重pcr結果；9：哈氏弧菌雙重pcr結果；10：殺鮭氣單胞菌雙重pcr結果；11：美人魚弧菌雙重pcr結果；12：溫和氣單胞菌雙重pcr結果；13：創(chuàng)傷弧菌雙重pcr結果。

圖2為需鈉弧菌雙重pcr靈敏性檢測結果圖；圖中：m是marker，1：132μg/ml，2：13.2μg/ml，3：1.32μg/ml，4：1.32×10^-1μg/ml，5：1.32×10^-2μg/ml,6：1.32×10^-3μg/ml,7：1.32×10^-4μg/ml,8：1.32×10^-5μg/ml,9：1.32×10^-6μg/ml。

具體實施方式

以下參照附圖，進一步描述本發(fā)明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發(fā)明，而不構成對其權利的限制。

實施例1，一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測試劑盒，該試劑合由下列物品組成:

1)陰性對照，成份為1ml滅菌雙蒸水1支;

2)陽性對照，試劑成份為溶于1ml滅菌雙蒸水中100ng的需鈉弧菌（vibrionatriegens）xa1菌株dna1支；

3)含mg²⁺、dntp和dna聚合酶的pcr緩沖液1支；

4)引物對toxr-f/toxr-r

toxr-f為：5'-aatccgctttcctctgtt-3'1支；

toxr-r為：5'-ggcgttagcacaggtaca-3'1支；

5)引物對vhh-f/vhh-r

vhh-f：5'-aatgtcatccgccaacga-3'1支；

vhh-r：5'-ccgtcaggcgaatcaatg-3'1支；

6)滅菌雙蒸水1支；

7)包裝盒子，一塊泡沫板，其大小與包裝盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應放置于這些小孔中；將陽性對照單獨存放；試劑盒于-20°c保存。

實施例2，利用實施例1所述的試劑盒進行三疣梭子蟹需鈉弧菌病原雙重pcr檢測方法；檢測前準備北京全式金生物技術有限公司提供的細菌基因組提取試劑盒；檢測步驟如下:

（1）dna模板的提取：將1ml過夜培養(yǎng)的需鈉弧菌（vibrionatriegens）xa1菌液，12,000g離心1min，盡量棄上清；加入100μllb11和20ul蛋白酶k，震蕩至菌體徹底懸??；55°c孵育20min；加入20μlrnasea混勻靜置2min；加入400μlbb11渦旋30s；將全部液體加入離心柱中，12,000g離心30s，棄流出液；加入500μlcb11，12,000g離心30s，棄流出液；再加入500μlcb11，12,000g離心30s，棄流出液；加入500μlwb11，12000g離心30s，棄流出液；再加入500μlwb11，12,000g離心30s，棄流出液；12000g離心2min，徹底去除殘留的wb11；將離心柱轉移至一個新的1.5ml離心管中，在柱的中央加入100μl預熱的洗脫液室溫靜置5min，12000g離心1min，洗脫dna；再將洗脫液置于離心柱中，室溫靜置5min，12000g離心1min，得dna模板，-20°c保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）pcr預混合液的配制，分別采用以下方法：

使用前將試劑盒中需用試劑離心數(shù)秒鐘后，按下列方式加入各種成分，除dna模板外的各試劑預先加入混合好后，最后加入提取的dna模板、陽性對照或陰性對照，加dna模板的區(qū)域與加入其它試劑的區(qū)域分開，總體積為25μl；

pcr預混合液加入方式:

含mg²⁺、dntp和dna聚合酶的pcr緩沖液13μl

引物對toxr-f/toxr-r各2μl

引物對vhh-f/vhh-r各1μl

滅菌雙蒸水4-5μl

dna模板或陽性對照或陰性對照1-2μl

總體積：25μl

（3）將pcr預混合液裝入pcr反應管，置于基因擴增儀中，如儀器無熱蓋，加入1-2滴石蠟油封蓋；設置pcr循環(huán)參數(shù)如下，進行擴增：

95℃預變性5min后，

94℃變性1min、53.3℃退火45s、72℃延伸1min，30個循環(huán)，

最后72℃延伸10min；

（4）擴增反應結束后取加入2μl溴酚藍與3μlpcr混合液混勻，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓按長度5v/cm電泳30-40min后于紫外分析儀下觀查結果:若在308bp和526bp處出現(xiàn)條帶，則證明需鈉弧菌為陽性，說明陽性對照或待測樣品中攜帶需鈉弧菌；否則為陰性，說明陰性對照或待測樣品中不攜帶需鈉弧菌。

實施例3，三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測試劑盒及檢測方法應用實驗。采用實施例1的試劑盒與實施例2記載的檢測方法：

實驗內(nèi)容:采用淮海工學院提供的引物、實驗材料及實驗方法，對連云港市贛榆區(qū)10個不同蝦蟹養(yǎng)殖池塘的海水、三疣梭子蟹和對蝦進行隨機取樣，共收集30個三疣梭子蟹、30個對蝦和30個水樣，然后分別用本研究的雙重pcr、16srrna-pcr和體外培養(yǎng)等方法進行檢測。

實驗結果是18個梭子蟹、9個對蝦和15個水樣雙重pcr結果是陽性，22個梭子蟹、17個對蝦和20個水樣16srrna-pcr結果是陽性，基于pcr結果分別對雙重pcr和16srrna-pcr檢測都為陽性以及雙重pcr和16srrna-pcr分別為陽性的樣本做弧菌體外培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)雙重pcr和16srrna-pcr結果都很亮的樣本能夠分離到弧菌，pcr條帶略弱的樣本有的出現(xiàn)弧菌生長，有的一直不見弧菌生長，即使將培養(yǎng)時間延長1周。因此，利用該方法的高靈敏度，在水產(chǎn)甲殼動物弧菌病原檢測中，雙重pcr方法能檢測出水產(chǎn)甲殼動物是否處于需鈉弧菌感染的初期，而分離培養(yǎng)方法只能檢測到感染的中后期。另一方面，利用雙重pcr方法的高特異性，雙重pcr法不會像16srrna-pcr方法一樣造成錯檢，因此雙重pcr檢測方法更適宜于微量需鈉弧菌的檢測，可對海水甲殼動物弧菌感染早期和中期進行臨床檢測。

實施例4，三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重pcr快速檢測試劑盒及檢測方法研究實驗：

引物設計：

參照genbank上收錄需鈉弧菌的溶血素（vhh）基因序列（dq663483）和跨膜轉錄激活蛋白（toxr）基因序列（jf930637）設計兩對引物：

toxr-f：aatccgctttcctctgtt和toxr-r：ggcgttagcacaggtaca（片段大小為308bp）

vhh-f：aatgtcatccgccaacga和vhh-r：ccgtcaggcgaatcaatg（片段大小為526bp）送上海英俊生物技術有限公司合成。

需鈉弧菌實驗室培養(yǎng)

取2.6g杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的2216e固體培養(yǎng)基加過濾海水至100ml，調ph值為7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘后倒平板。超凈臺內(nèi)劃線接種需鈉弧菌，28℃培養(yǎng)24小時后，挑取單菌落至2ml2216e液體培養(yǎng)基中28℃過夜培養(yǎng)。

需鈉弧菌基因組dna的提取

取1ml菌懸液用北京全式金生物技術有限公司提供的細菌基因組提取試劑盒提取需鈉弧菌基因組dna，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

pcr體系的建立與優(yōu)化

通過一系列實驗，對各引物濃度、退火溫度和延伸時間等反應體系和參數(shù)進行調整和優(yōu)化，最終確定需鈉弧菌病原雙重pcr反應最佳體系為：13μl的2×mastermix（包含mg²⁺、dntp和dna聚合酶），10μmol/l引物vhh-f/vhh-r各1μl、tox-f/tox-r各2μl，基因組dna100ng、雙蒸水補足到25μl。pcr反應條件為：95℃預變性5min后，94℃變性1min、53.3℃退火45s、72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

pcr特異性檢測

將對照的水產(chǎn)動物常見病原：霍亂弧菌（vibriocholerae）、副溶血弧菌（vibrioparahaemolyticus）、河口弧菌（vibrioaestuarianus）、鰻弧菌(vibrioanguillarum)、嗜水氣單胞菌（aeromonashydrophila）、哈氏弧菌(vibrioharveyi)、殺鮭氣單胞菌（aeromonassalmonicidasubsp）、美人魚弧菌(vibriodamsela)、溫和氣單胞菌（aeromonassobria）和創(chuàng)傷弧菌（vibriovulnificus）的基因組dna分別進行pcr體系和條件優(yōu)化，最后將所有pcr結果利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，需鈉弧菌單一和雙重pcr以及其它細菌病原雙重pcr結果見圖1。由圖可以看出，無論是單一pcr還是雙重pcr，需鈉弧菌都能擴增出目的條帶，而其它細菌都沒有條帶，表明本實驗設計的pcr引物具有很好的特異性。

pcr靈敏性檢測

將原始濃度為132μg/ml的需鈉弧菌dna進行10倍體系梯度稀釋，利用上面優(yōu)化的pcr體系和條件進行雙重pcr擴增，然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖可知，溶血素（vhh）基因引物檢測的靈敏度比跨膜轉錄激活蛋白（toxr）基因高一個數(shù)量級，既vhh基因引物對13.2pg的需鈉弧菌基因組dna能擴增到條帶，而toxr基因只能對132pg的需鈉弧菌基因組dna擴曾到條帶，但二者結合使用，既提高了檢測的靈敏度，同時也增強了檢測的可信度，避免假陽性的出現(xiàn)。