本發(fā)明涉及一種具有潛力的肺腺癌診斷的分子標(biāo)記物，屬于腫瘤生物診斷及治療技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肺癌是當(dāng)今世界致死率最高的惡性腫瘤之一，每年全世界范圍內(nèi)的新生病例超過100萬，其中以肺腺癌為最主要的組織類型。肺腺癌極易發(fā)生肝、骨和腦轉(zhuǎn)移，甚至有些患者在致病初期即可發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，因而導(dǎo)致肺腺癌的治愈率極低，且由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者術(shù)后五年生存率尚不足15％。由此可見，轉(zhuǎn)移是目前肺腺癌患者致死的主要原因。盡管近年來肺腺癌的診斷和治療已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但關(guān)于肺腺癌轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制尚未明確，且尚無有效的相關(guān)分子標(biāo)記物。

染色體凝集調(diào)節(jié)因子2(regulatorofchromosomecondensation2，rcc2)為染色體乘客復(fù)合體(cpc)的主要組成蛋白，參與有絲分裂和胞質(zhì)分裂進(jìn)程中紡錘體的裝配進(jìn)而調(diào)節(jié)有絲分裂進(jìn)程，近期報(bào)道其亦可參與調(diào)節(jié)粘附分子及細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)進(jìn)而在細(xì)胞間期活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。

本發(fā)明在前期研究基礎(chǔ)上認(rèn)為rcc2基因擴(kuò)增和表達(dá)水平的升高與肺腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生及不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于肺腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的檢測(cè)診斷中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)目前臨床肺腺癌及其轉(zhuǎn)移缺乏有效診斷標(biāo)記物的情況，提供了一種具有潛力的肺腺癌診斷的分子標(biāo)記物——染色體凝集調(diào)節(jié)因子2(regulatorofchromosomecondensation2，rcc2)，通過檢測(cè)rcc2基因擴(kuò)增水平及表達(dá)水平從而達(dá)到對(duì)肺腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷及預(yù)后評(píng)估的目的。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明通過tcga數(shù)據(jù)庫分析臨床肺腺癌樣本中rcc2基因擴(kuò)增以及mrna表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在臨床肺腺癌樣本中rcc2基因擴(kuò)增水平與rcc2基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，并且臨床肺腺癌樣本中rcc2的mrna表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。為了進(jìn)一步確定rcc2的表達(dá)水平與腺癌惡性程度、轉(zhuǎn)移發(fā)生及預(yù)后評(píng)估的關(guān)系，本發(fā)明通過westernblot法以及免疫組化方法檢測(cè)了6對(duì)臨床配對(duì)的肺腺癌(t)與癌旁(n)組織以及肺腺癌組織芯片中rcc2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在配對(duì)肺腺癌樣本中rcc2蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且與肺腺癌浸潤(rùn)深度,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(guān)。更進(jìn)一步的，本發(fā)明通過kaplan-meier法(log-rank檢驗(yàn))分析了rcc2表達(dá)水平與肺腺癌患者的生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示rcc2表達(dá)高的患者預(yù)后較差，且經(jīng)過cox回歸分析可知，rcc2可作為判斷肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。

因此，在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出了染色體凝集調(diào)節(jié)因子2(regulatorofchromosomecondensation2，rcc2)作為分子標(biāo)記物在制備用于肺腺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷以及預(yù)后評(píng)估的試劑或試劑盒中的用途。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了用于檢測(cè)rcc2基因擴(kuò)增水平和表達(dá)水平的試劑在制備用于肺腺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷以及預(yù)后評(píng)估的試劑或試劑盒中的用途。

優(yōu)選的，所述的用于檢測(cè)rcc2基因擴(kuò)增水平和表達(dá)水平的試劑包括從dna水平、rna水平以及蛋白水平檢測(cè)的試劑。

其中，優(yōu)選的，所述的從rna水平檢測(cè)的試劑包括用于rcc2pcr檢測(cè)所需的引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

當(dāng)然，依據(jù)人類rcc2基因序列所設(shè)計(jì)的所有引物均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

其中，優(yōu)選的，所述的從蛋白水平檢測(cè)的試劑包括抗rcc2的抗體。

本發(fā)明針對(duì)rcc2在臨床肺腺癌患者中存在拷貝數(shù)變異及表達(dá)差異，并與轉(zhuǎn)移發(fā)生和不良預(yù)后存在相關(guān)性的情況，通過對(duì)rcc2基因擴(kuò)增水平與mrna、蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，從而起到提示肺腺癌惡性程度、轉(zhuǎn)移發(fā)生及預(yù)后評(píng)估的作用。將rcc2序列及其相關(guān)抗體應(yīng)用于臨床肺腺癌轉(zhuǎn)移診斷及預(yù)后評(píng)估中，能夠?yàn)榉蜗侔┘捌滢D(zhuǎn)移發(fā)生提供新的早期診斷及預(yù)后評(píng)估方案，對(duì)于肺腺癌的臨床診療具有重要意義。

附圖說明

圖1為通過tcga數(shù)據(jù)庫分析臨床肺腺癌樣本中rcc2基因擴(kuò)增水平；

結(jié)果顯示在臨床肺腺癌樣本中rcc2基因擴(kuò)增水平與rcc2基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)；

圖2為通過tcga數(shù)據(jù)庫分析臨床肺腺癌樣本中rcc2的mrna表達(dá)水平；

結(jié)果顯示在臨床肺腺癌樣本中rcc2mrna表達(dá)水平顯著高于癌旁組織；

圖3為westernblot檢測(cè)6對(duì)臨床配對(duì)的肺腺癌(t)與癌旁(n)組織中rcc2蛋白表達(dá)水平；

結(jié)果顯示在配對(duì)肺腺癌樣本中rcc2的蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織；

圖4為免疫組化方法檢測(cè)臨床肺腺癌組織樣本病理切片中rcc2的表達(dá)；

經(jīng)秩和檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)rcc2蛋白在肺腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與肺腺癌浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(guān)；

圖5為kaplan-meier法(log-rank檢驗(yàn))分析肺腺癌患者的生存期。

結(jié)果顯示rcc2表達(dá)高的患者預(yù)后較差(左：組織芯片數(shù)據(jù)；中：tcga數(shù)據(jù)；右：geo數(shù)據(jù))，且經(jīng)過cox回歸分析可知，rcc2可作為判斷肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1通過tcga數(shù)據(jù)庫分析臨床肺腺癌樣本中rcc2基因擴(kuò)增水平

通過tcga數(shù)據(jù)庫分析臨床肺腺癌樣本中rcc2基因擴(kuò)增以及mrna表達(dá)水平。結(jié)果如圖1和圖2所示，從圖1和圖2結(jié)果可以看出，在臨床肺腺癌樣本中rcc2基因擴(kuò)增水平與rcc2基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，并且臨床肺腺癌樣本中rcc2的mrna表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。

實(shí)施例2臨床樣本的檢測(cè)

1、樣本

6對(duì)臨床配對(duì)的肺腺癌(t)與癌旁(n)組織樣本以及臨床肺腺癌組織樣本病理切片。

2、方法

2.1.檢測(cè)肺腺癌組織中rcc2基因擴(kuò)增水平。

2.1.1肺腺癌組織中dna的提取。

(1)取冰凍組織，在液氮冷凍下迅速研磨成粉末。

(2)將粉末放入到1.5ml離心管中，然后加入緩沖液750ul,充分混勻。

(3)將離心管置于65℃水浴中1-2小時(shí)，水浴過程中溫和混勻幾次。

(4)取出離心管,每管加入等體積的酚-氯仿(v/v＝1:1)溶液600-700ul，混勻后離心，10000g,10min。

(5)上清液移入另一離心管中，加入等體積的氯仿，混勻后，10000g,6min。

(6)將上清液移入另一離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置一段時(shí)間，然后用槍頭勾出dna,并用70％乙醇沖洗2次。

(7)勾出的dna，真空干燥后將其溶于500ul1×te中。

(8)加入3ulrna酶溶液，37℃保溫1小時(shí)。

(9)加入等體積的酚-氯仿溶液,輕輕混勻后,10000g，離心6min。

(10)取上清液，加入等體積的氯仿，輕輕混勻后，10000g離心6min。

(11)取上清液，入1/10體積3m醋酸鈉，混勻后，加入2倍體積冷的無水乙醇。

(12)輕輕混勻靜置一會(huì)兒后，用槍頭勾出dna,用70％乙醇沖洗2次后，真空干燥。

(13)加入20-50ul的1×te溶解dna。

(14)測(cè)定dna的濃度，樣品在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2基因測(cè)序，檢測(cè)rcc2基因擴(kuò)增水平。

2.2.檢測(cè)肺腺癌組織中rcc2的mrna水平。

2.2.1肺腺癌組織中總rna提取。

(1)取2mleppendorf管，加入100mg冰凍組織，100μl0.5mm硅酸鋯珠子，1mltrizol。

(2)置于組織破碎儀中，最大速度破碎5min。

(3)加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩30s，冰上靜置3～5min。

(4)離心，4℃，12000g，15min。

(5)將上層水相移至新的eppendorf管中，加入與上清等體積異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10min。

(6)離心，4℃，12000g，15min。

(7)棄上清，75％乙醇洗滌rna沉淀。離心，4℃，7500g，10min。

(8)室溫干燥rna沉淀，5～10min后溶于適量depc水(30μl)。

2.2.2rt-qpcr檢測(cè)rcc2的表達(dá)。

2.2.2.1逆轉(zhuǎn)錄

依測(cè)定濃度調(diào)整各組樣品總rna量，采用roche公司的transcriptorfirststandcdnasystemkit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書提供的方法逆轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈。

(1)cdna反應(yīng)體系

(2)反應(yīng)條件

50℃60min；85℃5min；16℃+∞。所得cdna第一鏈測(cè)濃度稀釋到50ng/μl，直接使用或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2.2實(shí)時(shí)定量pcr

用擴(kuò)增目的基因的引物以轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的cdna為模版進(jìn)行擴(kuò)增，rcc2引物序列如下：

上游引物：5′-ttcctttgggtgccctgaa-3′(seqidno.1)

下游引物：5′-ggcagaatctgtccatctttcg-3′(seqidno.2)

(1)反應(yīng)體系

(2)反應(yīng)條件：

95℃6min；95℃20s，tm20s，72℃20s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。

2.3檢測(cè)肺腺癌組織中rcc2蛋白表達(dá)情況。

2.3.1免疫組化方法檢測(cè)肺腺癌癌組織中rcc2的表達(dá)情況。

(1)組織切片制備：每個(gè)病例按3-5μm切片，以預(yù)涂apes粘附性載玻片撈片，70℃烘烤2h。

(2)脫蠟、水化：38℃烘烤過夜，石臘切片常規(guī)二甲苯脫蠟，逐級(jí)梯度(100％-80％)酒精水化。

(3)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：0.3％h202溶液室溫孵育30min。

(4)抗原修復(fù)：檸檬酸修復(fù)液高壓修復(fù)10min。

(5)室溫靜置冷卻，待溫度與室溫相同(約45min)，pbs洗3次，每次5min。

(6)加一抗：1％牛血清抗體稀釋液稀釋一抗，均勻滴加在石蠟切片的組織上，4℃冰箱過夜。

(7)室溫靜置20min，pbs洗3次，每次5min。

(8)加二步法檢測(cè)試劑，室溫孵育1h。

(9)pbs洗3次，每次5min。

(10)dab顯色，30s左右(視染色情況)；蘇木素復(fù)染20s。

(11)酒精梯度濃度脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

(12)結(jié)果染色陽性判斷：

陽性著色程度(抗原含量)：陰性染色記為0，弱陽性記為1，陽性記為2，強(qiáng)陽性記為3。

2.3.2westernblot方法檢測(cè)肺腺癌組織中rcc2的表達(dá)情況。

2.3.2.1冰凍組織蛋白提取。

(1)取2mleppendorf管，加入300mg冰凍組織，300μl0.5mm硅酸鋯珠子，600μl裂解液。

(2)置于組織破碎儀中，最大速度破碎10min。

(3)離心，4℃，13000r/min，30min。

(4)收集上清至新1.5mleppendorf管中，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并以50μl每管分裝，保存于-80℃冰箱中備用。

2.3.2.2westernblot

(1)制備10％的sds-page分離膠

按照快速配膠試劑盒說明書制備分離膠。取分離膠緩沖液和分離膠溶液各4ml混勻，加入80μl的改良型過硫酸銨溶液，混勻。將混合液注入制膠玻璃板中，加入適量無水乙醇覆蓋于分離膠之上。分離膠凝固后倒去上層無水乙醇，取濃縮膠緩沖液和濃縮膠溶液各1.5ml混勻，加入30μl的改良型過硫酸銨溶液混勻。凝固后即用或置于潮濕4℃中備用。

(2)煮樣

取不同樣本總蛋白各50ng，加入四分之一體積的5×上樣緩沖液，加熱煮沸5min，立即放在冰上，完全冷卻后瞬時(shí)離心，上樣。

(3)sds-page電泳

80v恒壓電泳通過積層膠，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，改用120v恒壓電泳2h，分離蛋白。

(4)轉(zhuǎn)膜

將凝膠于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30min。剪切1張與凝膠大小一致的pvdf膜，首先以甲醇浸泡30s，再以去離子水浸泡3至5min以去除甲醇，最后浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min。同時(shí)，將轉(zhuǎn)移所用濾紙、泡沫墊及轉(zhuǎn)子于轉(zhuǎn)移緩沖液中完全浸透。按一定順序組裝電泳轉(zhuǎn)移裝置：陽極→泡沫墊→3張whatman3mm濾紙→pvdf膜→凝膠→3張whatman3mm濾紙→泡沫墊→陰極，排除氣泡后封閉轉(zhuǎn)移裝置，300ma，室溫轉(zhuǎn)移60-120min。

(5)封閉

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將做好標(biāo)記的pvdf膜置于雜交盒中，加入適量封閉液(快速封閉液1：100稀釋)，室溫?fù)u床封閉2～4h。

(6)雜交

tbs-t洗膜3次，每次10min，加入1:200稀釋的一抗，4℃雜交過夜。tbs-t洗膜3次，每次10min，然后加入1:5000稀釋二抗，室溫雜交1h。tbs-t洗膜3次，每次10min后掃描成像。

3、結(jié)果

3.1檢測(cè)肺腺癌組織中rcc2基因擴(kuò)增水平

通過對(duì)6對(duì)臨床配對(duì)的肺腺癌(t)與癌旁(n)組織的dna進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌(t)組織中的rcc2基因擴(kuò)增水平顯著高于癌旁(n)組織。

3.2檢測(cè)肺腺癌組織中rcc2的mrna水平

通過對(duì)6對(duì)臨床配對(duì)的肺腺癌(t)與癌旁(n)組織的mrna表達(dá)水平進(jìn)行rt-qpcr檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌(t)組織中的rcc2基因的mrna表達(dá)水平顯著高于癌旁(n)組織。

3.3westernblot方法檢測(cè)肺腺癌組織中rcc2的蛋白表達(dá)情況

圖3為westernblot檢測(cè)6對(duì)臨床配對(duì)的肺腺癌(t)與癌旁(n)組織中rcc2蛋白表達(dá)水平的結(jié)果。從該結(jié)果可以看出，在配對(duì)肺腺癌樣本中rcc2蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。

3.4免疫組化方法檢測(cè)肺腺癌癌組織中rcc2的蛋白表達(dá)情況

圖4為免疫組化方法檢測(cè)臨床肺腺癌樣本病理切片中rcc2的表達(dá)結(jié)果，經(jīng)秩和檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)rcc2蛋白在肺腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與肺腺癌浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期顯著相關(guān)。

3.5rcc2的表達(dá)情況與腺癌患者的生存期的關(guān)系

圖5為kaplan-meier法(log-rank檢驗(yàn))分析肺腺癌患者的生存期結(jié)果，結(jié)果顯示rcc2表達(dá)高的患者預(yù)后較差(左：組織芯片數(shù)據(jù)；中：tcga數(shù)據(jù)；右：geo數(shù)據(jù))，且經(jīng)過cox回歸分析可知，rcc2可作為判斷肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>哈爾濱醫(yī)科大學(xué)

<120>一種與肺腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物及其應(yīng)用

<130>klpi170138

<160>2

<170>patentin3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttcctttgggtgccctgaa19

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggcagaatctgtccatctttcg22