本發(fā)明涉及一種植物抗病分子育種領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體是一種利用多重pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)進(jìn)行番茄ty-1、ty-3和mi基因的同時(shí)檢測(cè)，應(yīng)用該方法可對(duì)番茄抗病種質(zhì)資源進(jìn)行篩選。
背景技術(shù)：
：番茄(solanumlycopersicum)是世界范圍內(nèi)廣泛種植的蔬菜之一，被列為全世界總產(chǎn)量最高的30種農(nóng)作物之一，在世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)市場(chǎng)中占有重要的地位。但長(zhǎng)期以來，番茄的種植會(huì)受到多種病害的侵?jǐn)_。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年因病蟲害可使番茄減產(chǎn)10％～20％，嚴(yán)重時(shí)可能絕收。番茄黃化曲葉病(tomatoyellowleafcurlvirus，tylcv)是造成番茄產(chǎn)量和品質(zhì)下降的一項(xiàng)主要病害。該病害于二十世紀(jì)初在以色列首次發(fā)現(xiàn)，目前在全世界范圍均有發(fā)生。該病害是造成番茄減產(chǎn)和品質(zhì)降低的最主要因素之一，目前尚沒有防治tylcv的特效藥物，最好的辦法就是選育抗番茄黃化曲葉病的優(yōu)良品種，其中ty-1和ty-3基因是抗黃化曲葉病的主效基因，因此被廣泛應(yīng)用于抗病品種的選育。根結(jié)線蟲病(root-knotnematode)是一種世界性病害，分布極其廣泛，危害十分嚴(yán)重。根結(jié)線蟲病嚴(yán)重危害作物生產(chǎn)，寄主范圍達(dá)2000多種。國(guó)際上已有80多種根結(jié)線蟲的相關(guān)報(bào)道，我國(guó)報(bào)道的根結(jié)線蟲的有效種有39種。在番茄抗根結(jié)線蟲育種中，mi基因是目前被鑒定和利用最多的有效抗性基因，該抗性基因具有廣譜性，能有效抵抗除北方根結(jié)線蟲以外的其它3種主要根結(jié)線蟲。多重pcr技術(shù)是指在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段的pcr技術(shù)。這與單基因pcr相比具有高靈敏度、高效率、低成本的特點(diǎn)，一經(jīng)提出便得到眾多研究者的青睞，但多重pcr技術(shù)對(duì)引物濃度、taqdna聚合酶濃度、dntp濃度、反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)(包括退火溫度、退火及延伸時(shí)間等)等實(shí)驗(yàn)條件要求及其嚴(yán)格。目前多重pcr技術(shù)在番茄抗病育種中已有一些研究，但能同時(shí)鑒定抗番茄黃化曲葉病基因ty-1、ty-3和抗根結(jié)線蟲病基因mi的多重pcr技術(shù)體系目前未見報(bào)道。同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)體系中對(duì)抗番茄黃化曲葉病基因ty-1和抗根結(jié)線蟲病基因mi的檢測(cè)利用的多為caps分子標(biāo)記，大都需要擴(kuò)增后再進(jìn)行酶切，所需時(shí)間長(zhǎng)，耗費(fèi)成本高。本方法采用的是pcr擴(kuò)增反應(yīng)后無需繼續(xù)酶切的兩對(duì)snp分子標(biāo)記和兩對(duì)scar分子標(biāo)記，且四對(duì)分子標(biāo)記經(jīng)驗(yàn)證可以很好地對(duì)番茄材料的基因型進(jìn)行區(qū)分，不會(huì)出現(xiàn)假陽性的情況，因此使用本方法不僅可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，還可節(jié)省分子檢測(cè)的成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)手段單一、耗時(shí)費(fèi)力的不足，提供一種能同時(shí)、快速檢測(cè)番茄ty-1、ty-3和mi基因的多重pcr方法，使其服務(wù)于番茄抗病分子育種工作，并能夠利用該方法快速篩選出一批抗番茄黃化曲葉病和抗根結(jié)線蟲病的番茄種質(zhì)資源。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)番茄ty-1、ty-3和mi基因的多重pcr方法，所述方法包括如下步驟：s1、提取番茄樣品dna(脫氧核糖核酸)；s2、選用ty-1、ty-3和mi基因的特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行一步多重pcr反應(yīng)，最后凝膠電泳檢測(cè)，即可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)番茄ty-1、ty-3和mi基因型；其中，ty-1基因的特異性引物為序列如seqidno.1、2所示的ty-1-1引物對(duì)和序列如seqidno.3、4所示的ty-1-2引物對(duì)；ty-3基因的特異性引物為序列如seqidno.5、6所示的ty-3引物對(duì)；mi基因的特異性引物為序列如seqidno.7、8所示的mi引物對(duì)。ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，seqidno.1，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，seqidno.2，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，seqidno.3，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，seqidno.4，ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，seqidno.5，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，seqidno.6，mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，seqidno.7，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’，seqidno.8。優(yōu)選的，步驟s1中，所述提取番茄樣品dna包括選取各供試番茄材料單株幼葉，利用ctab(溴代十六烷基三甲基銨)法提取dna，提取的dna稀釋到50-250ng·μl-1，備用。優(yōu)選的，所述利用ctab法提取dna，具體包括：s1-1、清洗、研磨：選取番茄幼葉，清洗；冷凍，加入液氮，研磨；s1-2、ctab液提?。好?g番茄葉粉加入預(yù)熱的ctab提取液500μl，溫浴30～60分鐘，每5～10分鐘混勻一次；s1-3、去蛋白：加冰浴的酚、氯仿和異戊醇混合液500μl混勻，4℃條件下離心10～15分鐘，取上清液；s1-4、沉淀、去rna：加冰浴的異丙醇進(jìn)行沉淀；沉淀物中加rna酶進(jìn)行消化去rna；s1-5、二次去蛋白、去離子：加冰浴的氯仿異戊醇混合液混勻、離心，取上清液；加冰浴的7.5mol·l-1醋酸銨混勻，冰浴、離心，取上清液；s1-6、dna沉淀、洗滌：加冰浴的無水乙醇，冰浴、離心，獲得dna沉淀；用乙醇洗滌；s1-7、加te溶解和稀釋，dna濃度稀釋至50-250ng·μl-1，冷藏保存。更優(yōu)選的，步驟s1-2中，所述ctab提取液為：稱取ctab20g和氯化鈉81.9g溶解于100ml蒸餾水中，加入0.5mol·l-1的edta40ml和1mol·l-1的tris-hcl100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml，使用前按體積100比1加入巰基乙醇。更優(yōu)選的，步驟s1-3中，所述酚、氯仿和異戊醇混合液為：先吸取體積比為24份的氯仿和1份的異戊醇，制成氯仿異戊醇混合液，再與25份的酚混合待用。更優(yōu)選的，步驟s1-4中，所述rna酶為：先配制te緩沖液，吸取0.5mol·l-1的edta0.2ml和1mol·l-1的tris-hcl1ml，用蒸餾水定容至100ml，再按體積比為993比7加入10g·l-1的rna酶。優(yōu)選的，步驟s2中，所述多重pcr反應(yīng)包括：采用20μl反應(yīng)體系進(jìn)行ty-1、ty-3和mi基因的同時(shí)擴(kuò)增；所述反應(yīng)體系為：2μldna模板，0.4μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer(緩沖液)，2μl2.5mmdntp(脫氧核糖核苷三磷酸)，100μmol-l-1的ty-1-1引物對(duì)各0.4μl，100μmol·l-1的ty-1-2引物對(duì)各0.2μl，100μmol·l-1的ty-3引物對(duì)各0.4μl，100μmol·l-1的mi引物對(duì)各0.4μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。優(yōu)選的，步驟s2中，所述多重pcr反應(yīng)的pcr擴(kuò)增程序采用94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，56℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2.5分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。優(yōu)選的，步驟s2中，所述凝膠電泳檢測(cè)為：多重pcr反應(yīng)的pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示。本發(fā)明具有的有益效果為：本發(fā)明以番茄為材料，對(duì)同時(shí)檢測(cè)ty-1、ty-3和mi基因的多重pcr反應(yīng)體系的參數(shù)進(jìn)行了摸索，不僅包括反應(yīng)體系大小、引物濃度、引物間配比、taqdna聚合酶濃度、dntp濃度、反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)(包括退火溫度、退火及延伸時(shí)間等)，同時(shí)對(duì)電泳時(shí)瓊脂糖凝膠的濃度和時(shí)間進(jìn)行了反復(fù)試驗(yàn)，使其能適用對(duì)番茄三種基因的同時(shí)快速檢測(cè)，為番茄抗病分子育種研究及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)，簡(jiǎn)化育種流程，縮短育種年限。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：圖1為本發(fā)明實(shí)施例10份番茄純合自交系材料單組引物pcr的電泳圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例10份番茄純合自交系材料多重引物pcr的電泳圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例5份番茄品種單組引物pcr的電泳圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例5份番茄品種多重引物pcr的電泳圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例4份番茄f1雜交種材料單組引物pcr的電泳圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例4份番茄f1雜交種材料多重引物pcr的電泳圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1材料的選擇與培養(yǎng)：以來自上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院園藝種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室保存的10份已知基因型的番茄純合自交系為試驗(yàn)材料(表1)，挑選飽滿的種子，播到由草炭、蛭石及有機(jī)肥(體積比4∶4∶1)混合的基質(zhì)中，澆透水后打0.5厘米深的孔，將種子播到孔中，然后覆0.5厘米厚的草炭。用黑色膜封嚴(yán)后置于30℃左右的苗床上3-4天，待發(fā)芽出土后，轉(zhuǎn)到日溫25℃，夜溫18℃的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)2周，剪取幼嫩葉片用于dna提取。表1供試10份已知基因型的番茄純合自交系材料注：本實(shí)施例材料來源可參考文獻(xiàn)：蘇永濤，劉楊，莊天明，等.栽培番茄品種指紋圖譜的aflp分析[j].中國(guó)蔬菜，2010，1(18)：34-39.dna的提?。翰捎胏tab方法提取dna，具體操作步驟如下：1、葉片清洗：選取幼葉3-5片，2g(克)左右，純凈水洗干凈；2、葉片研磨：冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml(毫升)離心管；3、預(yù)先配備ctab提取液：稱取ctab20g和氯化鈉81.9g溶解于100ml蒸餾水中，加入0.5mol·l-1(摩爾每升)的edta(乙二胺四乙酸)40ml和1mol·l-1的tris-hcl100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆?。使用前按體積100比1加入巰基乙醇；4、ctab液提取：加入60℃預(yù)熱的ctab提取液500μl，60℃水浴30-60分鐘，每10分鐘混勻一次；5、去蛋白：加-20℃冰浴的酚∶氯仿∶異戊醇(體積比25∶24∶1)500μl混勻，4℃條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；6、沉淀：加-20℃冰浴的異丙醇500μl，混勻沉淀30分鐘以上，4℃條件下8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清液，晾干；7、預(yù)先配制rna(核糖核酸)酶液：吸取0.5mol·l-1的edta0.2ml和1mol-l-1的tris-hcl1ml，用蒸餾水定容至100ml，制備te緩沖液，再按體積比為993比7加入10g·l-1(克每升)的rna酶；8、去rna：加rna酶液300μl，37℃消化30分鐘；9、二次去蛋白：加-20℃冰浴的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)300μl混勻，4℃條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；10、去離子：加-20℃冰浴的7.5mol·l-1醋酸銨100μl混勻，0℃冰浴20分鐘，4℃條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；11、dna沉淀：加-20℃冰浴的無水乙醇900μl，0℃冰浴20分鐘，4℃條件下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得dna沉淀；12、dna洗滌：對(duì)dna沉淀用70％乙醇洗兩遍，晾干；13、溶解：加te溶解和稀釋，dna濃度稀釋至50-250ng·μl-1，放4℃冰箱保存。為了確保本實(shí)施例所用材料可用，并與本發(fā)明多重pcr反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，本實(shí)施例首先進(jìn)行單基因pcr反應(yīng)及凝膠電泳檢測(cè)：對(duì)ty-1基因利用兩對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，采用20μl反應(yīng)體系，分別加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，57℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增ty-1所用引物為兩對(duì)，其序列分別為：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，seqidno.1，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，seqidno.2，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，seqidno.3，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，seqidno.4。對(duì)ty-3基因采用20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃復(fù)性45秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增ty-3所用引物為一對(duì)，其序列為：ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，seqidno.5，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，seqidno.6。對(duì)mi基因采用20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序采用94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，53℃復(fù)性45秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增mi所用引物為一對(duì)，其序列為：mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，seqidno.7，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’，seqidno.8。多重pcr反應(yīng)及凝膠電泳檢測(cè)：對(duì)ty-1、ty-3和mi基因采用20μl體系同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，分別加入2μldna模板，0.4μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，ty-1-1上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，ty-1-2上下游引物(100μmol·l-1)各0.2μl，ty-3上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，mi上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序采用94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，56℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2.5分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖2所示。對(duì)ty-1、ty-3和mi基因同時(shí)擴(kuò)增所用引物為四對(duì)，其序列為：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，seqidno.1，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，seqidno.2，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，seqidno.3，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，seqidno.4，ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，seqidno.5，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，seqidno.6，mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，seqidno.7，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’，seqidno.8。結(jié)果：對(duì)供試的10份番茄材料通過四對(duì)引物的單基因pcr擴(kuò)增后，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知番茄材料j42、j17、浦03-2-3和浦08-1-1擴(kuò)增后均產(chǎn)生了984bp、650bp和430bp的條帶，說明四份材料的基因型為ty-1純合抗病，ty-3純合抗病，mi感?。环巡牧蟖tm004、atm099和金有擴(kuò)增后均產(chǎn)生了1434bp、320bp和380bp的條帶，說明三份材料的基因型為ty-1感病，ty-3感病，mi純合抗??；番茄材料77-7、玉1和玉8擴(kuò)增后均產(chǎn)生了1434bp、320bp和430bp的條帶，說明三份材料的基因型為ty-1感病，ty-3感病，mi感病。這與實(shí)驗(yàn)室之前鑒定過的基因型完全吻合。對(duì)供試的10份番茄材料通過四對(duì)引物的多重pcr擴(kuò)增后，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，10份材料經(jīng)多重pcr反應(yīng)擴(kuò)增出條帶的結(jié)果與單基因pcr擴(kuò)增后的結(jié)果完全一致。這驗(yàn)證了本發(fā)明提出的多重pcr方法之可行性，而且利用這一方法可以通過一次pcr反應(yīng)將供試番茄材料的基因型完全區(qū)分開，結(jié)果清晰可靠，可以為番茄抗病分子育種提供有利的幫助。實(shí)施例2材料的選擇：以來自上海富農(nóng)種業(yè)有限公司的5份經(jīng)過田間抗病鑒定的番茄品種為試驗(yàn)材料(表2)，于2016年10月18日取樣，選取番茄幼嫩葉片用于dna提取。表2供試5份經(jīng)過田間鑒定的番茄品種注：tylcv番茄黃化曲葉病，n根結(jié)線蟲病，r抗病，s感病。dna的提?。翰捎胏tab方法提取dna，具體操作步驟如下：1、葉片清洗：選取幼葉3-5片，2g左右，純凈水洗干凈；2、葉片研磨：冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml離心管；3、ctab液提取：加入60℃預(yù)熱的ctab提取液500μl，60℃水浴30-60分鐘，每10分鐘混勻一次；4、去蛋白：加-20℃冰浴的酚∶氯仿∶異戊醇(體積比25∶24∶1)500μl混勻，4℃條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；5、沉淀：加-20℃冰浴的異丙醇500μl，混勻沉淀30分鐘以上，4℃條件下8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清液，晾干；6、去rna：加rna酶液300μl，37℃消化30分鐘；7、二次去蛋白：加-20℃冰浴的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)300μl混勻，4℃條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；8、去離子：加-20℃冰浴的7.5mol·l-1醋酸銨100μl混勻，0℃冰浴20分鐘，4℃條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；9、dna沉淀：加-20℃冰浴的無水乙醇900μl，0℃冰浴20分鐘，4℃條件下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得dna沉淀；10、dna洗滌：對(duì)dna沉淀用70％乙醇洗兩遍，晾干；11、溶解：加te溶解和稀釋，dna濃度稀釋至50-250ng·μl-1，放4℃冰箱保存。為了確保本實(shí)施例所用材料可用，并與本發(fā)明多重pcr反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，本實(shí)施例首先進(jìn)行單基因pcr反應(yīng)及凝膠電泳檢測(cè)：對(duì)ty-1基因利用兩對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，采用20μl反應(yīng)體系，分別加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，57℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖3所示。擴(kuò)增ty-1所用引物為兩對(duì)，其序列分別為：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’。對(duì)ty-3基因采用20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃復(fù)性45秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖3所示。擴(kuò)增ty-3所用引物為一對(duì)，其序列為：ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’。對(duì)mi基因采用20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序采用94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，53℃復(fù)性45秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖3所示。擴(kuò)增mi所用引物為一對(duì)，其序列為：mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’。多重pcr反應(yīng)及凝膠電泳檢測(cè)：對(duì)ty-1、ty-3和mi基因采用20μl體系同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，分別加入2μldna模板，0.4μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，ty-1-1上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，ty-1-2上下游引物(100μmol·l-1)各0.2μl，ty-3上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，mi上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序采用94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，56℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2.5分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖4所示。對(duì)ty-1、ty-3和mi基因同時(shí)擴(kuò)增所用引物為四對(duì)，其序列為：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’。結(jié)果：5份用于單基因pcr反應(yīng)的番茄品種，其擴(kuò)增結(jié)果(圖3)顯示，欣美番茄擴(kuò)增產(chǎn)生1434bp、984bp、320bp和430bp四條帶，說明欣美番茄為ty-1雜合抗病，ty-3感病，mi感??；浦粉珍美擴(kuò)增產(chǎn)生1434bp、984bp、650bp、320bp和430bp五條帶，說明浦粉珍美為ty-1雜合抗病，ty-3雜合抗病，mi感?。活愃频?，浦粉1301為ty-1雜合抗病，ty-3雜合抗病，mi雜合抗?。黄址?號(hào)為ty-1雜合抗病，ty-3雜合抗病，mi感??；浦粉一號(hào)為ty-1感病，ty-3感病，mi純合抗病。對(duì)5份材料進(jìn)行多重pcr反應(yīng)的結(jié)果(圖4)顯示，5份番茄品種的多重pcr擴(kuò)增結(jié)果同單基因擴(kuò)增結(jié)果完全一致，且與田間抗病鑒定結(jié)果一致，證明多重pcr方法能夠一次性對(duì)番茄ty-1、ty-3和mi基因進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方便快速，檢測(cè)結(jié)果可以用于番茄抗病分子輔助育種，同時(shí)可以通過該方法篩選出可以加以利用的番茄抗病種質(zhì)資源。實(shí)施例3材料的選擇與培養(yǎng)：以來自上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院園藝種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室保存的4份已知基因型的番茄f1雜交種材料為試驗(yàn)材料(表3)，挑選飽滿的種子，播到由草炭、蛭石及有機(jī)肥(體積比4∶4∶1)混合的基質(zhì)中，澆透水后打0.5厘米深的孔，將種子播到孔中，然后覆0.5厘米厚的草炭。用黑色膜封嚴(yán)后置于30℃左右的苗床上3-4天，待發(fā)芽出土后，轉(zhuǎn)到日溫25℃，夜溫18℃的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)2周，剪取幼嫩葉片用于dna提取。表3供試4份已知基因型的番茄f1雜交種材料序號(hào)材料名稱ty-1基因型ty-3基因型mi基因型1c1ty-1/ty-1ty-3/ty-3mi/mi2c2ty-1/ty-1ty-3/ty-3mi/mi3c8ty-1/ty-1ty-3/ty-3mi/mi4c10ty-1/ty-1ty-3/ty-3mi/mi注：本實(shí)施例材料來源可參考文獻(xiàn)：蔣青青，劉楊，陳火英.激素組合與水解蛋白對(duì)番茄花藥愈傷增殖的影響[j].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2012，30(2)：8-11.dna的提?。翰捎胏tab方法提取dna，具體操作步驟如下：1、葉片清洗：選取幼葉3-5片，2g左右，純凈水洗干凈；2、葉片研磨：冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml離心管；3、ctab液提取：加入60℃預(yù)熱的ctab提取液500μl，60℃水浴30-60分鐘，每10分鐘混勻一次；4、去蛋白：加-20℃冰浴的酚∶氯仿∶異戊醇(體積比25∶24∶1)500μl混勻，4℃條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；5、沉淀：加-20℃冰浴的異丙醇500μl，混勻沉淀30分鐘以上，4℃條件下8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清液，晾干；6、去rna：加rna酶液300μl，37℃消化30分鐘；7、二次去蛋白：加-20℃冰浴的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)300μl混勻，4℃條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；8、去離子：加-20℃冰浴的7.5mol·l-1醋酸銨100μl混勻，0℃冰浴20分鐘，4℃條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；9、dna沉淀：加-20℃冰浴的無水乙醇900μl，0℃冰浴20分鐘，4℃條件下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得dna沉淀；10、dna洗滌：對(duì)dna沉淀用70％乙醇洗兩遍，晾干；11、溶解：加te溶解和稀釋，dna濃度稀釋至50-250ng·μl-1，放4℃冰箱保存。為了確保本實(shí)施例所用材料可用，并與本發(fā)明多重pcr反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，本實(shí)施例首先進(jìn)行單基因pcr反應(yīng)及凝膠電泳檢測(cè)：對(duì)ty-1基因利用兩對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，采用20μl反應(yīng)體系，分別加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，57℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖5所示。擴(kuò)增ty-1所用引物為兩對(duì)，其序列分別為：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’。對(duì)ty-3基因采用20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃復(fù)性45秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖5所示。擴(kuò)增ty-3所用引物為一對(duì)，其序列為：ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’。對(duì)mi基因采用20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，加入2μldna模板，0.2μl5u-μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序采用94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，53℃復(fù)性45秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖5所示。擴(kuò)增mi所用引物為一對(duì)，其序列為：mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’。多重pcr反應(yīng)及凝膠電泳檢測(cè)：對(duì)ty-1、ty-3和mi基因采用20μl體系同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，分別加入2μldna模板，0.4μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，ty-1-1上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，ty-1-2上下游引物(100μmol·l-1)各0.2μl，ty-3上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，mi上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，加ddh2o補(bǔ)足至20μl。pcr擴(kuò)增程序采用94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，56℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2.5分鐘，共35個(gè)循環(huán)；隨后72℃延伸10分鐘，pcr產(chǎn)物于4℃保存。pcr產(chǎn)物用加有eb的2％瓊脂糖在100-120v電壓條件下電泳40分鐘，最終結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示，結(jié)果如圖6所示。對(duì)ty-1、ty-3和mi基因同時(shí)擴(kuò)增所用引物為四對(duì)，其序列為：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’。結(jié)果：對(duì)供試的4份番茄材料通過四對(duì)引物的單基因pcr反應(yīng)后，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，番茄材料c1、c8和c10均擴(kuò)增產(chǎn)生1434bp、984bp、650bp、320bp和430bp五條帶，說明這5份番茄材料均為ty-1雜合抗病，ty-3雜合抗病，mi感病。番茄材料c2擴(kuò)增產(chǎn)生1434bp、984bp、650bp、320bp、430bp和380bp六條帶，說明該材料為三種抗病基因的雜合抗病類型。對(duì)供試的4份番茄材料通過四對(duì)引物的多重pcr反應(yīng)后，結(jié)果如圖6所示。試驗(yàn)結(jié)果同單基因pcr反應(yīng)結(jié)果完全一致，同時(shí)pcr分子鑒定結(jié)果同實(shí)驗(yàn)室之前已經(jīng)鑒定出的基因型完全吻合，說明該方法能夠幫助快速檢測(cè)番茄ty-1、ty-3和mi基因的基因型，所得材料可以被利用在抗病種質(zhì)資源的進(jìn)一步選育中。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。sequencelisting<110>上海交通大學(xué)<120>同時(shí)檢測(cè)番茄ty-1、ty-3和mi基因的多重pcr法<130>dag28964<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-1-1（f）<400>1aaacgctcttcttcccctcg20<210>2<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-1-1（r）<400>2agttagattcaggctcctcgca22<210>3<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-1-2（f）<400>3tgtatgcgtcgtgttagaaggtc23<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-1-2（r）<400>4aatggtgacagaatcaagatccac24<210>5<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-3（f）<400>5ggtagtggaaatgatgctgctc22<210>6<211>27<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-3（r）<400>6gctctgcctattgtcccatatataacc27<210>7<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>mi（f）<400>7tggaaaaatgttgaatttcttttg24<210>8<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>mi（r）<400>8gcatactatatggcttgtttaccc24當(dāng)前第1頁12