本發(fā)明涉及一種用于高通量測序檢測的激素受體陽性乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因突變文庫的構建方法。

背景技術：

乳腺癌未來將成為癌癥幸存者最多的群體，其依據(jù)早期分子分型存在著兩個復發(fā)高峰期，分別為術后1-3年和5-10年，期間需進行反復的影像學等檢查，尤其是激素受體陽性患者，內(nèi)分泌治療已被建議延續(xù)至10年，但尚無療效預測因子能精準鑒別獲益人群，且具有諸多并發(fā)癥，因此研發(fā)乳腺癌無創(chuàng)療效預測與監(jiān)測系統(tǒng)是十分必要的，將降低患者放射學受量和減少患者接受不必要的治療副作用。ca15-3、cea等傳統(tǒng)腫瘤標志物在監(jiān)測乳腺癌復發(fā)方面敏感性與特異性均較差，循環(huán)腫瘤細胞(ctc)檢測新近也被認為價值有限。循環(huán)腫瘤dna(ctdna)則極具應用前景，有證據(jù)表明其在乳腺癌患者中的檢測敏感性與準確評估腫瘤負荷變化等方面均顯著強于前兩者。腫瘤高通量測序等技術發(fā)展，在提高ctdna檢測靈敏度(5-10ng，約10ml血液/例)的同時，也在不斷降低其檢測成本。

另一方面，激素受體陽性乳腺癌約占總發(fā)病率的75％，內(nèi)分泌治療是該類型晚期乳腺癌優(yōu)先推薦的治療手段。然而，這種治療決策僅根據(jù)初始治療所確定的分子分型以及當前臨床表現(xiàn)是否為“惰性”的主觀判斷，而乳腺癌原發(fā)病變與轉移灶的分子生物學特征已被證實具有顯著差異；同時，一旦應用內(nèi)分泌治療，其起效時間平均需2個月左右，期間又常受到“閃爍”現(xiàn)象干擾，導致常規(guī)檢測手段失真；另外，該類型晚期乳腺癌常多發(fā)皮膚與骨轉移，上述病灶很難應用現(xiàn)有影像學手段予以客觀評價。這些因素常給該型患者的治療決策造成巨大困擾，限制內(nèi)分泌治療的最大受益。臨床前研究證實，血清esr1等ctdna突變定量檢測能預測內(nèi)分泌治療療效與準確評估腫瘤負荷的動態(tài)變化。

乳腺癌復發(fā)與轉移后突出表現(xiàn)的瘤間與瘤內(nèi)異質性，以及其隨治療進程呈現(xiàn)的時空異質性演變，是當前臨床診治面臨的最大挑戰(zhàn)。在晚期乳腺癌患者中應用腫瘤組織dna與循環(huán)腫瘤dna聯(lián)合進行基因突變分析，經(jīng)證實有較高的一致性(可達76％)，表明ctdna具有替代晚期乳腺癌患者組織活檢的可行性，這也有助于破解晚期乳腺癌患者難以反復活檢的臨床難題。同時，乳腺癌基因組學研究的進展，初步確定了與內(nèi)分泌治療、化療、靶向治療敏感性或抗拒性有關的突變基因，因此可通過ctdna檢測解析其動態(tài)變化及其意義。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中存在的上述不足，本發(fā)明提供了一種用于高通量測序檢測的激素受體陽性乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因突變文庫的構建方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用了如下技術方案：

覆蓋人類基因kras、jak3、akt1、crebbp、pten、rb1、tp53、ctnnb1、tsc2、tsc1、erbb2、pik3ca、sf3b1、jak2、cdh1、smad4、gata3、map2k4、map3k1和esr1上的總共1357種體細胞突變，具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因kras、jak3、akt1、crebbp、pten、rb1、tp53、ctnnb1、tsc2、tsc1、erbb2、pik3ca、sf3b1、jak2、cdh1、smad4、gata3、map2k4、map3k1和esr1設計基本擴增引物組，該基本擴增引物組的正向引物和反向引物的5’端設有額外的2～5個t，且該2～5個t的靠近3’端的第一個t具有pna修飾，同時該基本擴增引物組的tm值相差不超過1℃；

(2)將模板、上述基本擴增引物組置于一含有ringcap-taq酶的pcr反應體系中進行擴增，純化后得擴增產(chǎn)物；將擴增產(chǎn)物、多對第一不對稱連接探針、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進行pcr，純化后獲得文庫產(chǎn)物；

(3)將文庫產(chǎn)物組成所述用于高通量測序的腫瘤基因變異文庫；

上述ringcap-taq酶由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述第一擴增引物組包括zq-kras-1-f、zq-kras-1-r、zq-kras-2-f、zq-kras-2-r、zq-kras-3-f、zq-kras-3-r、zq-jak3-1-f、zq-jak3-1-r、zq-jak3-2-f、zq-jak3-2-r、zq-jak3-3-f、zq-jak3-3-r、zq-akt1-1-f、zq-akt1-1-r、zq-crebbp-1-f、zq-crebbp-1-r、zq-pten-1-f、zq-pten-1-r、zq-pten-2-f、zq-pten-2-r、zq-pten-3-f、zq-pten-3-r、zq-pten-4-f、zq-pten-4-r、zq-pten-5-f、zq-pten-5-r、zq-pten-6-f、zq-pten-6-r、zq-pten-7-f、zq-pten-7-r、zq-rb1-1-f、zq-rb1-1-r、zq-tp53-1-f、zq-tp53-1-r、zq-tp53-2-f、zq-tp53-2-r、zq-tp53-3-f、zq-tp53-3-r、zq-tp53-4-f、zq-tp53-4-r、zq-tp53-5-f、zq-tp53-5-r、zq-tp53-6-f、zq-tp53-6-r、zq-tp53-7-f、zq-tp53-7-r、zq-tp53-8-f、zq-tp53-8-r、zq-ctnnb1-1-f、zq-ctnnb1-1-r、zq-tsc2-1-f、zq-tsc2-1-r、zq-tsc1-1-f、zq-tsc1-1-r、zq-tsc1-2-f、zq-tsc1-2-r、zq-erbb2-1-f、zq-erbb2-1-r、zq-erbb2-2-f、zq-erbb2-2-r、zq-erbb2-3-f、zq-erbb2-3-r、zq-erbb2-4-f、zq-erbb2-4-r、zq-erbb2-5-f、zq-erbb2-5-r、zq-erbb2-6-f、zq-erbb2-6-r、zq-erbb2-7-f、zq-erbb2-7-r、zq-pik3ca-1-f、zq-pik3ca-1-r、zq-pik3ca-2-f、zq-pik3ca-2-r、zq-pik3ca-3-f、zq-pik3ca-3-r、zq-sf3b1-1-f、zq-sf3b1-1-r、zq-sf3b1-2-f、zq-sf3b1-2-r、zq-jak2-1-f、zq-jak2-1-r、zq-cdh1-1-f、zq-cdh1-1-r、zq-cdh1-2-f、zq-cdh1-2-r、zq-cdh1-3-f、zq-cdh1-3-r、zq-cdh1-4-f、zq-smad4-1-f、zq-smad4-1-r、zq-gata3-1-f、zq-gata3-1-r、zq-map2k4-1-f、zq-map2k4-1-r、zq-map2k4-2-f、zq-map2k4-2-r、zq-map3k1-1-f、zq-map3k1-1-r、zq-map3k1-2-f、zq-map3k1-2-r、zq-map3k1-3-f、zq-map3k1-3-r、zq-map3k1-4-f、zq-map3k1-4-r、zq-esr1-1-f、zq-esr1-1-r、zq-esr1-2-f和zq-esr1-2-r。

作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案：kras基因引物名稱：zq-kras-1-f，序列信息

ttttcatgtactggtccctcattg；zq-kras-1-r，序列信息

ttttgtaataatccagactgtgtttctcc；zq-kras-2-f，序列信息

ttttgttatgattttgcagaaaacagat；zq-kras-2-r，序列信息

ttttgccttctagaacagtagacacaaaa；zq-kras-3-f，序列信息

tttttacctctattgttggatcatattcgt；zq-kras-3-r，序列信息

tttttattataaggcctgctgaaaatgactg；

jak3基因引物名稱：zq-jak3-1-f，序列信息ttttcccagactggatgtcagtct；zq-jak3-1-r，序列信息ttttccacggtctgggaagtgtt；zq-jak3-2-f，序列信息

ttttgagatgccggtacgacactt；zq-jak3-2-r，序列信息

ttttgcaggtctgtgagcacaaaattt；zq-jak3-3-f，序列信息

ttttcaaagaggtgctccaggactg；zq-jak3-3-r，序列信息

ttttctttcatcccagggttctctcc；

akt1基因引物名稱：zq-akt1-1-f，序列信息ttttccgctccttgtagccaatga；zq-akt1-1-r，序列信息ttttgggtctgacgggtagagtgt；

crebbp基因引物名稱：zq-crebbp-1-f，序列信息

ttttaatgtgcagtccaggaaacagaa；zq-crebbp-1-r，序列信息

ttttacagtctcatcataccactattattt；

pten基因引物名稱：zq-pten-1-f，序列信息

ttttgtttttgacagtttgacagttaaag；zq-pten-1-r，序列信息

ttttttcccgtcgtgtgggtcct；zq-pten-2-f，序列信息

tttttcaaatgttagctcatttttgttaatgg；zq-pten-2-r，序列信息

tttttgcaagcatacaaataagaaaacatactt；zq-pten-3-f，序列信息

ttttacagctagaacttatcaaacccttttgt；zq-pten-3-r，序列信息

ttttcccgatgtaataaatatgcacatatcatt；zq-pten-4-f，序列信息

tttttagagcgtgcagataatgacaagg；zq-pten-4-r，序列信息

ttttcccacaaaatgtttaatttaactgacc；zq-pten-5-f，序列信息

tttttctgtccaccagggagta；zq-pten-5-r，序列信息

ttttacattggaatagtttcaaacatcatctt；zq-pten-6-f，序列信息

ttttgacgggaagacaagttcatgtact；zq-pten-6-r，序列信息

ttttttctcccaatgaaagtaaagtacaaacctt；zq-pten-7-f，序列信息

ttttttaggacaaaatgtttcacttttggg；zq-pten-7-r，序列信息

ttttacgctctatactgcaaatgctatcg；

rb1基因引物名稱：zq-rb1-1-f，序列信息

tttttctgtgtgctgagagatgtaatgac；zq-rb1-1-r，序列信息

tttttgatccaaaaataatcttgcatctagatc；

tp53基因引物名稱：zq-tp53-1-f，序列信息tttttcatagggcaccaccacactat；zq-tp53-1-r，序列信息ttttggcctctgattcctcactgattg；zq-tp53-2-f，序列信息

ttttccataggtctgaaaatgtttcctgact；zq-tp53-2-r，序列信息

ttttgttggaagtgtctcatgctggat；zq-tp53-3-f，序列信息

ttttgtagctgccctggtaggttt；zq-tp53-3-r，序列信息

ttttgaagctcccagaatgccaga；zq-tp53-4-f，序列信息

tttttgcttgcttacctcgcttagtg；zq-tp53-4-r，序列信息

tttttactgggacggaacagctttg；zq-tp53-5-f，序列信息

ttttcagctgctcaccatcgctat；zq-tp53-5-r，序列信息

ttttagctgtgggttgattccaca；zq-tp53-6-f，序列信息

ttttctgccatctctctcctcctttttc；zq-tp53-6-r，序列信息

ttttccgcagaaatggatacaggtcaa；zq-tp53-7-f，序列信息

ttttgcctgggcatccttgagttc；zq-tp53-7-r，序列信息

ttttcttgaaccatcttttaactcaggtac；zq-tp53-8-f，序列信息

ttttcctgacctggagtcttccagt；zq-tp53-8-r，序列信息

tttttcttgggcctgtgttatctccta；

ctnnb1基因引物名稱：zq-ctnnb1-1-f，序列信息

ttttatggccatggaaccagacagaa；zq-ctnnb1-1-r，序列信息

tttttccacatcctcttcctcaggatt；

tsc2基因引物名稱：zq-tsc2-1-f，序列信息

ttttggtggtttgtgacttgcagttaag；zq-tsc2-1-r，序列信息

ttttgcgacttcacaaatctgccctat；

tsc1基因引物名稱：zq-tsc1-1-f，序列信息ttttaccacctctgcttccactact；zq-tsc1-1-r，序列信息tttcttacaggcttgactgttgtaatg；zq-tsc1-2-f，序列信息tttttggcataattaggcttctcaaagtg；zq-tsc1-2-r，序列信息ttttcggatgactacgtgcacatttc；

erbb2基因引物名稱：zq-erbb2-1-f，序列信息ttttctcccataccctctcagcgta；zq-erbb2-1-r，序列信息ttttagccatagggcataagctgtg；zq-erbb2-2-f，序列信息ttttcagaaggtctacatgggtgctt；zq-erbb2-2-r，序列信息

ttttgccagcccgaagtctgtaatttt；zq-erbb2-3-f，序列信息

ttttgggcatctggatccctgatg；zq-erbb2-3-r，序列信息

ttttttcctgtcctcctagcaggag；zq-erbb2-4-f，序列信息

ttttacggtaatgctgctcatggt；zq-erbb2-4-r，序列信息

tttttgctgtcacctcttggttgtg；zq-erbb2-5-f，序列信息

ttttcccatcatgactttctttcttgtcc；zq-erbb2-5-r，序列信息

ttttcaggtcaccatcaaatacatcgga；zq-erbb2-6-f，序列信息

ttttacaacacacagttggaggactt；zq-erbb2-6-r，序列信息

ttttcccatcacacaccataactcca；zq-erbb2-7-f，序列信息

ttttgggcatctggatccctgatg；zq-erbb2-7-r，序列信息

ttttttcctgtcctcctagcaggag；

pik3ca基因引物名稱：zq-pik3ca-1-f，序列信息

tttttacagagtaacagactagctagagaca；zq-pik3ca-1-r，序列信息

tttttagcacttacctgtgactccataga；zq-pik3ca-2-f，序列信息

ttttcaatcttttgatgacattgcatacattc；zq-pik3ca-2-r，序列信息

ttttggaagatccaatccatttttgttgtc；zq-pik3ca-3-f，序列信息

ttttgatgcacaataaaacagttagccaga；zq-pik3ca-3-r，序列信息

ttttgtttgagaatgtcagttaagttaatgagc；

sf3b1基因引物名稱：zq-sf3b1-1-f，序列信息

ttttttcaactaaacttctaagatgtggcaag；zq-sf3b1-1-r，序列信息

ttttcttctttattgcccttcttaaaagctgt；zq-sf3b1-2-f，序列信息

ttttacccttccataaaggctttaacaca；zq-sf3b1-2-r，序列信息

tttttgtttggttttgtaggtcttgtgga；

jak2基因引物名稱：zq-jak2-1-f，序列信息

ttttttccttagtctttctttgaagcagca；zq-jak2-1-r，序列信息

ttttagatgctctgagaaaggcattagaaa；

cdh1基因引物名稱：zq-cdh1-1-f，序列信息

ttttatttctgccctgcagtgaattttg；zq-cdh1-1-r，序列信息

ttttgatctgtgggttatgaaaccgtaga；zq-cdh1-2-f，序列信息

ttttctagtgttcctggtcctgacttg；zq-cdh1-2-r，序列信息

ttttgtgatcacagctgttgctgttg；zq-cdh1-3-f，序列信息

ttttgtgatcacagtcactgacaccaa；zq-cdh1-3-r，序列信息

ttttccatgagcagtggtgacacttag；zq-cdh1-4-f，序列信息

ttttagaacgaggctaacgtcgtaatc；zq-cdh1-4-r，序列信息

ttttgttgttcactggatttgtggtga；

smad4基因引物名稱：zq-smad4-1-f，序列信息

ttttatggatgttcaggtaggagagaca；zq-smad4-1-r，序列信息

ttttcttctgtcctgtggacattgga；

gata3基因引物名稱：zq-gata3-1-f，序列信息

ttttcccaagaacagctcgtttaacc；zq-gata3-1-r，序列信息

ttttgtccaaaggacaggctggat；

map2k4基因引物名稱：zq-map2k4-1-f，序列信息

tttttcttctggacagaagtggaaatatt；zq-map2k4-1-r，序列信息

ttttcaagcaagaaggcctggactta；zq-map2k4-2-f，序列信息

ttttgtctttatgttccagcctgaaagaata；zq-map2k4-2-r，序列信息

tttttcttattgttacgctactgtggcaa；

map3k1基因引物名稱：zq-map3k1-1-f，序列信息

ttttcattggtattggtggtgttgattatgt；zq-map3k1-1-r，序列信息

ttttgaggataaaattcagcaggaaattccaac；zq-map3k1-2-f，序列信息ttttgttttagccaagatccaggattgatg；zq-map3k1-2-r，序列信息

ttttccagcttttagtatttctctgccaact；zq-map3k1-3-f，序列信息

ttttatgaggtctatgcacatgtgtttct；zq-map3k1-3-r，序列信息

ttttcacatctcgtaaaccaggagaca；zq-map3k1-4-f，序列信息

ttttattagtattgtactgggcttttatctgt；zq-map3k1-4-r，序列信息

tttttgcagctccaaaatctgcaattc；

esr1基因引物名稱：zq-esr1-1-f，序列信息

ttttgctatgttttcataggaaccagggaaa；zq-esr1-1-r，序列信息

ttttgcaaaataatagatttgaggcacacaaa；zq-esr1-2-f，序列信息

ttttaaaggcatggagcatctgtaca；zq-esr1-2-r，序列信息

ttttttggtccgtctcctccacgg。

作為本發(fā)明的又一種優(yōu)選方案，在步驟(2)中，多重富集pcr的反應體系為：

1×pcr緩沖液

作為本發(fā)明的進一步改進方案，該構建方法的試劑盒，包括

一dna富集反應組件，由第一擴增引物組組成；

一ringcap-taq酶，由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成；

一管陽性質控品；

和一管陰性質控品。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明的構建方法針對多個靶序列進行單管，快速完成文庫的構建，整個文庫構建過程僅需要2～3小時，手動時間僅僅需要45分鐘即可，結合高通量測序平臺可以十分有效的解決目前對于臨床上乳腺癌中在少量的外周血樣本基礎上需要對體細胞多基因、多靶點檢測這一難點，且成本低廉。

2、本發(fā)明的構建方法所制備的文庫序列可被目前高通量測序系統(tǒng)識別并進行檢測，從而實現(xiàn)文庫構建進行核酸序列的檢測的應用，該核酸檢測可應用于目前多種高通量測序平臺、基因芯片平臺、雜交檢測平臺，見圖1。

3、本發(fā)明的構建方法對于來自甲醛固定石蠟包埋的樣品和來自血漿的樣品所獲得的短片段dna依然適用，基于其的檢測方法依然具有與新鮮組織樣品dna同樣的擴增和檢測能力，見圖2、圖3。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實施例構建的核酸文庫進行高通量測序總數(shù)據(jù)圖；

圖2為本發(fā)明的實施例檢測激素受體陽性乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因突變的檢測均一性結果圖；

圖3為本發(fā)明的實施例檢測激素受體陽性乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因突變的檢測突變結果。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細地描述。

激素受體陽性乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因突變文庫的構建方法，覆蓋人類基因kras、jak3、akt1、crebbp、pten、rb1、tp53、ctnnb1、tsc2、tsc1、erbb2、pik3ca、sf3b1、jak2、cdh1、smad4、gata3、map2k4、map3k1和esr1上的總共1357種體細胞突變。

具體包括如下步驟：

(1)針對目的基因kras、jak3、akt1、crebbp、pten、rb1、tp53、ctnnb1、tsc2、tsc1、erbb2、pik3ca、sf3b1、jak2、cdh1、smad4、gata3、map2k4、map3k1和esr1設計基本擴增引物組，該基本擴增引物組的正向引物和反向引物的5’端設有額外的2～5個t，且該2～5個t的靠近3’端的第一個t具有pna修飾，同時該基本擴增引物組的tm值相差不超過1℃；所述擴增引物組包括zq-kras-1-f、zq-kras-1-r、zq-kras-2-f、zq-kras-2-r、zq-kras-3-f、zq-kras-3-r、zq-jak3-1-f、zq-jak3-1-r、zq-jak3-2-f、zq-jak3-2-r、zq-jak3-3-f、zq-jak3-3-r、zq-akt1-1-f、zq-akt1-1-r、zq-crebbp-1-f、zq-crebbp-1-r、zq-pten-1-f、zq-pten-1-r、zq-pten-2-f、zq-pten-2-r、zq-pten-3-f、zq-pten-3-r、zq-pten-4-f、zq-pten-4-r、zq-pten-5-f、zq-pten-5-r、zq-pten-6-f、zq-pten-6-r、zq-pten-7-f、zq-pten-7-r、zq-rb1-1-f、zq-rb1-1-r、zq-tp53-1-f、zq-tp53-1-r、zq-tp53-2-f、zq-tp53-2-r、zq-tp53-3-f、zq-tp53-3-r、zq-tp53-4-f、zq-tp53-4-r、zq-tp53-5-f、zq-tp53-5-r、zq-tp53-6-f、zq-tp53-6-r、zq-tp53-7-f、zq-tp53-7-r、zq-tp53-8-f、zq-tp53-8-r、zq-ctnnb1-1-f、zq-ctnnb1-1-r、zq-tsc2-1-f、zq-tsc2-1-r、zq-tsc1-1-f、zq-tsc1-1-r、zq-tsc1-2-f、zq-tsc1-2-r、zq-erbb2-1-f、zq-erbb2-1-r、zq-erbb2-2-f、zq-erbb2-2-r、zq-erbb2-3-f、zq-erbb2-3-r、zq-erbb2-4-f、zq-erbb2-4-r、zq-erbb2-5-f、zq-erbb2-5-r、zq-erbb2-6-f、zq-erbb2-6-r、zq-erbb2-7-f、zq-erbb2-7-r、zq-pik3ca-1-f、zq-pik3ca-1-r、zq-pik3ca-2-f、zq-pik3ca-2-r、zq-pik3ca-3-f、zq-pik3ca-3-r、zq-sf3b1-1-f、zq-sf3b1-1-r、zq-sf3b1-2-f、zq-sf3b1-2-r、zq-jak2-1-f、zq-jak2-1-r、zq-cdh1-1-f、zq-cdh1-1-r、zq-cdh1-2-f、zq-cdh1-2-r、zq-cdh1-3-f、zq-cdh1-3-r、zq-cdh1-4-f、zq-smad4-1-f、zq-smad4-1-r、zq-gata3-1-f、zq-gata3-1-r、zq-map2k4-1-f、zq-map2k4-1-r、zq-map2k4-2-f、zq-map2k4-2-r、zq-map3k1-1-f、zq-map3k1-1-r、zq-map3k1-2-f、zq-map3k1-2-r、zq-map3k1-3-f、zq-map3k1-3-r、zq-map3k1-4-f、zq-map3k1-4-r、zq-esr1-1-f、zq-esr1-1-r、zq-esr1-2-f和zq-esr1-2-r，其序列依次如seqid01～seqid110所示；

(2)將模板、上述基本擴增引物組置于一含有ringcap-taq酶的pcr反應體系中進行擴增，純化后得擴增產(chǎn)物；將擴增產(chǎn)物、多對第一不對稱連接探針、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進行pcr，純化后獲得文庫產(chǎn)物；

(3)將文庫產(chǎn)物組成所述用于高通量測序的乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因突變文庫；

(4)通過iontorrentpgm高通量測序儀進行文庫上機檢測，獲得目標序列信息，通過vc軟件進行數(shù)據(jù)信息比對分析，得到樣本突變狀態(tài)。

上述模板所來自的樣品適用范圍包括血漿標本。

血漿樣品，使用qiagen公司血漿dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取血漿不少于1000μl。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l,ph8.0)，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質量，并確定濃度，用tris-hcl溶液(10mmol/l,ph8.0)調(diào)整dna濃度到2ng/μl作為pcr擴增的模板。

基于上述構建方法的試劑盒包括：

一dna富集反應組件，由擴增引物組組成，每人份的dna富集反應組件的配方如下表所示：

一ringcap-taq酶，由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成，比例為0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，優(yōu)選比例1:1:1；

一陰性質控品，具體為無核酸水；

和一陽性質控品，具體由20個陽性突變質粒序列野生型基因組dna混合而成，濃度為2ng/μl。

將上述試劑盒用前述的構建方法進行實驗，以kras基因熱點突變外顯子2上的g12d突變?yōu)槔齺矸治霰景l(fā)明的檢測激素受體陽性乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因突變的方法。實驗用細胞系4株，分別為kras基因g12d突變質粒；50份健康的全血樣品、50份臨床乳腺癌樣品(全血)：

所述pcr反應體系的模板量(待測樣品、陽性質控品和陰性質控品)為5ul，其余組分如下表所示：

pcr擴增程序設置如下表：

上述pcr反應體系所得的擴增產(chǎn)物的純化具體如下：

取出agencourtampurexp試劑置于室溫，同時要打散磁珠，同時配制新鮮的70％的乙醇(230μl無水乙醇+100μl無核酸酶水)，必須是新鮮配制的。

第一輪純化步驟

(1)向每個樣品反應管25μl產(chǎn)物中分別加入12.5μl(0.5x樣本體積)的agencourtampurexp試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸dna；

(2)室溫孵育5分鐘；

(3)放置在磁力架上面，孵育5分鐘，一直到溶液澄清；

(4)小心地吸取上清液置于新的離心管，不要擾動磁珠；注意：上清液中含有擴增產(chǎn)物不要丟棄。

第二輪純化步驟

(1)向上述吸取的上清液25μl中加入30μl(1.2x樣本體積)的agencourtampurexp試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸dna；

(2)室溫孵育5分鐘；

(3)放置在磁力架上面，孵育3分鐘，一直到溶液澄清，小心地吸走并棄掉上清，不要擾動磁珠；注意：磁珠上含有擴增文庫不要丟棄。

(4)加入150μl新鮮配制的70％乙醇，沒過磁珠樣品即可，離心管正反方向移動5次，然后磁力架上孵育2分鐘，去除上清液；

(5)重復上述步驟4，進行第二次洗滌；

(6)確保乙醇液滴已全部從孔中吸走，將板放置于磁力架上，室溫空氣干燥5分鐘，注意不要過度干燥。

(7)將樣品管從磁力架上拿開，在每孔中加入25μlte(ph8.0)緩沖液充分浸潤磁珠。充分振蕩混勻，快速離心將液體收集到管底。(也可以選擇用槍吸取一半以上的液體上下吹打至少5次來混勻)；注意：上清液含有擴增文庫不要丟棄。

將樣品管置于磁力架上2分鐘。上清液中含有擴增產(chǎn)物。取出20μl上清。

上述純化所得的擴增產(chǎn)物制備文庫產(chǎn)物的pcr反應的模板量為5ul，其余組分如下表所示：

pcr擴增程序設置如下表：

pcr產(chǎn)物分別按純化擴增產(chǎn)物方法進行純化，制得文庫產(chǎn)物。

上述文庫產(chǎn)物的檢測具體如下：

采用iontorrentpgm半導體測序儀(thermofisher公司)一次可以檢測16份樣品(包括陰陽性對照)。

前述50份全血樣品以及陽性質粒經(jīng)本發(fā)明的體系檢測，只有陽性質粒有檢測到突變序列，其他樣品無突變序列，進一步證明了該方法的特異性，具體結果如圖1至圖3所示。

靈敏度分析：將突變型質粒從100ng/μl連續(xù)10倍梯度稀釋，分別為100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl。每次反應加入5μldna。結果表明本發(fā)明的文庫構建方法的靈敏度高，50拷貝dna基因組即可檢出。

選擇性能力分析：固定每次pcr反應總dna用量，100ng/反應和10ng/反應。先將突變質粒的dna和野生型細胞系dna濃度都調(diào)整為20ng/μl和2ng/μl。這樣每個反應加5μl模板即為100ng/反應和10ng/反應。按下述方法配置模擬dna模板。

a:50％即為100ng/μl突變細胞dna。

b:30％取a液60μl后混入40μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

c:20％取a液40μl后混入60μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

d:15％取b液50μl后混入50μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

e:10％取c液50μl后混入50μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

f:5％取e液50μl后混入50μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

g:1％取f液20μl后混入80μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

h:0.5％取g液50μl后混入50μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

i:0.1％取h液20μl后混入80μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

j:0.01％取h液2μl后混入80μl100ng/μl細胞dna，震蕩混均。

結果表明本發(fā)明的乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因突變方法的在平均測序深度達到20000層時選擇性檢測能力為在10ng總dna中可以檢出5拷貝的突變dna，檢測能力為0.1％。

重復性試驗：每個反應分別加入突變細胞系dna10ng、1ng和100pg，重復10次進行高通量測序檢測，10次結果一致，符合率100％。

收集激素受體陽性乳腺癌血漿標本共50例。其中男性28例，女性22例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。對于乳腺癌基因，本發(fā)明檢測結果與dna測序結果相對照，dna測序結果陽性的，本發(fā)明均能檢出，另有3例本發(fā)明檢測結果陽性的，并且突變率為1～5％的，dna測序未能檢出，因此本發(fā)明檢測方法與dna測序法比較具有更高的靈敏度。

以上可知本發(fā)明腫瘤多基因文庫構建反應就可以同時檢測乳腺癌復發(fā)監(jiān)測基因1357個突變位點，文庫構建時間僅需3小時，因此本發(fā)明省時省力，準確性高，可滿足突變的快速診斷。而且，高通量測序法靈敏度和選擇性檢測能力高于傳統(tǒng)測序方法，10ng樣品dna中含0.1％的突變dna即可檢出。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。