本發(fā)明屬于微生物診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測霉菌性陰道炎的培養(yǎng)基、檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
目前對霉菌性陰道炎的檢測以傳統(tǒng)方法為主，常用鏡檢觀察，金標(biāo)準(zhǔn)方法是培養(yǎng)、分離鑒定，但步驟復(fù)雜、檢測周期長，分離率不高，整個(gè)過程大約4-7天，操作繁瑣，已不能滿足對快速、便利檢測的需要，而且當(dāng)樣本中雜菌較多時(shí)會(huì)影響真正目標(biāo)菌的識別。
霉菌性陰道炎的臨床檢測方法如培養(yǎng)檢測法，其檢出率低且時(shí)間長、操作復(fù)雜，因?yàn)閭鹘y(tǒng)培養(yǎng)基基本上都是使用沙保弱瓊脂培養(yǎng)基，其采用瓊脂作為凝固劑適合固體平板培養(yǎng)，但其營養(yǎng)成分低，培養(yǎng)時(shí)間24～48小時(shí)，臨床使用不便；臨床培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基不具有靶向功能，常有較多雜菌生長，對下一步菌落篩選操作造成較大障礙；菌落需人工挑選再純化鑒定，對人員要求較高，步驟較繁瑣；使用前需要滅菌消毒再倒成平皿板，步驟復(fù)雜，成品平皿保存溫度在2-8℃，有效期只有7天。同時(shí)在進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)時(shí)，傳統(tǒng)藥敏檢測方法必須在病原體分離鑒定后才能分別做每種藥物敏感性試驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜時(shí)間長，需要72小時(shí)，且鑒定過程要求人員素質(zhì)高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種營養(yǎng)成分高，培養(yǎng)時(shí)間短，具有靶向培養(yǎng)功能，且不需將病原體分離鑒定即可同時(shí)用于霉菌性陰道炎檢測及藥敏檢測的培養(yǎng)液、試劑盒及檢測方法。
本發(fā)明的一種用于檢測霉菌性陰道炎的培養(yǎng)液，其中每100ml培養(yǎng)液中，含有如下重量配比的組份：
0.1～3g胰蛋白胨；
1～5g葡萄糖；
0.1～3g酵母提取物；
0.01～1g溴百里酚藍(lán)；
0.00001～0.0001g頭孢曲松鈉；
0.00001～0.0001g硫酸鏈霉素。
上述所述培養(yǎng)液的制備方法，其是向含有胰蛋白胨、葡萄糖、酵母提取物和溴百里酚藍(lán)的混合物中加入滅菌純化水混溶，高壓滅菌，然后加入頭孢曲松鈉和硫酸鏈霉素，即得培養(yǎng)液。
本發(fā)明的一種用于檢測霉菌性陰道炎的的試劑盒，包括干粉培養(yǎng)基、培養(yǎng)基稀釋液和藥敏板，所述干粉培養(yǎng)基為上述所述培養(yǎng)液的凍干粉，所述藥敏板上設(shè)有培養(yǎng)置物臺、陰性對照孔c-、陽性對照孔c+、若干組藥物試驗(yàn)孔，每組所述藥物試驗(yàn)孔分為高濃度藥物孔和低濃度藥物孔。
所述培養(yǎng)基稀釋液為滅菌純化水。
本發(fā)明還提供了一種檢測霉菌性陰道炎的檢測方法，其是采用本發(fā)明上述所述的試劑盒。
本發(fā)明的一種檢測霉菌性陰道炎的檢測方法，具體包括下述步驟：
(1)藥敏板的藥物試驗(yàn)孔預(yù)先包被各種高低濃度的藥物溶液；
(2)用培養(yǎng)基稀釋液將干粉培養(yǎng)基稀釋成液體培養(yǎng)基，汲取少量液體培養(yǎng)基到藥敏板的陰性對照孔c-；
(3)用無菌棉拭子取疑似霉菌性陰道炎病人生殖道分泌物，生理鹽水稀釋后，汲取少量到剩余液體培養(yǎng)基中混勻成菌液；
(4)分別汲取少量菌液到藥敏板的陽性對照孔c+、各藥物試驗(yàn)孔中，將藥敏板蓋上蓋子恒溫培養(yǎng)，6-24h觀察結(jié)果；
(5)檢測結(jié)果判讀：
孔c+培養(yǎng)基與孔c-相比變黃色，為陽性(+)；
孔c+培養(yǎng)基與孔c-相比不變色，為陰性(—)；
孔c-陰性(—)，孔c+陽性(+)試驗(yàn)有效，判斷余下各孔結(jié)果；
孔c-陽性(+)，表示污染，試驗(yàn)無效；
孔c-陰性(—)，孔c+陰性(—)表明陰性結(jié)果，余下孔不判斷結(jié)果；
(6)藥敏結(jié)果判定：
孔a(—)孔b(—)敏感，
孔a(—)孔b(+)中敏，
孔a(+)孔b(+)耐藥。
作為優(yōu)選，本發(fā)明的一種用于檢測霉菌性陰道炎的培養(yǎng)液，其中每100ml培養(yǎng)液中，含有如下重量配比的組份：
1～2g胰蛋白胨；
1～5g葡萄糖；
1～2g酵母提取物；
0.1～0.5g溴百里酚藍(lán)；
0.00003～0.00006g頭孢曲松鈉；
0.00003～0.00006g硫酸鏈霉素。
本發(fā)明的檢測霉菌性陰道炎的檢測試劑盒具有質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡單等優(yōu)勢。本發(fā)明的用于檢測霉菌性陰道炎的培養(yǎng)液，其為液體培養(yǎng)基，而非固體平板培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基經(jīng)過冷凍干燥加工成干粉培養(yǎng)基，干粉培養(yǎng)基使用前用滅菌純化水溶解成液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)增菌速度更快，且干粉培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，可常溫保存和運(yùn)輸，有效期長達(dá)2年。一般的，液體培養(yǎng)基中均會(huì)加入無機(jī)鹽如磷酸鹽、硫酸鹽等，其一方面主要是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓為微生物生長所需如使微生物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能正常運(yùn)作，將培養(yǎng)基中的蛋白胨或其他營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)無機(jī)鹽離子還會(huì)參與微生物細(xì)胞內(nèi)其他功能的正常運(yùn)作，另一方面其可作為ph緩沖成分，調(diào)整液體培養(yǎng)基的ph值以給予菌群適應(yīng)的生存環(huán)境，但是此類無機(jī)鹽如果添加過量，容易導(dǎo)致滲透壓過大，對霉菌的培養(yǎng)極為不利，同時(shí)此類無機(jī)鹽的過多添加還會(huì)影響培養(yǎng)基的顏色變化，影響對最終結(jié)果的判斷，不便于陰道霉菌的鑒定培養(yǎng)。本發(fā)明的培養(yǎng)基中的組分胰蛋白胨是一種優(yōu)質(zhì)蛋白胨，其是以新鮮牛肉和牛骨經(jīng)胰酶消化，比普通蛋白胨含有更豐富的氮源、氨基酸，更適合微生物的生長；酵母提取物是酵母的營養(yǎng)物質(zhì)得到過分解，在對本發(fā)明所述霉菌如念珠菌的培養(yǎng)時(shí)比普通的沒有經(jīng)過分解的酵母粉吸收利用的速度和效率更高；由于臨床耐藥細(xì)菌不斷產(chǎn)生，單一抗生素可能對有些革蘭氏陽性菌或陰性菌無效，而本發(fā)明培養(yǎng)基中采用頭孢曲松鈉和硫酸鏈霉素的雙抗，可有效作用于其他革蘭氏陽性和陰性菌，抑制了其他雜菌的生長；本發(fā)明培養(yǎng)基中胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖的合理營養(yǎng)配比有利于本發(fā)明所述霉菌的生長，而由頭孢曲松鈉和硫酸鏈霉素組成的雙抗的添加使本發(fā)明的培養(yǎng)基更具靶向培養(yǎng)功能，從而使在對本發(fā)明所述霉菌性陰道炎的檢測時(shí)無需進(jìn)一步純化鑒定。同時(shí)，本發(fā)明培養(yǎng)液中的溴百里酚藍(lán)作為指示劑的ph指示范圍正好落在霉菌培養(yǎng)后的產(chǎn)品變色范圍之內(nèi)，顏色變化相比其他指示劑變色更明顯，更易于肉眼觀察鑒定。本發(fā)明中的藥敏檢測根據(jù)《臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》和《臨床抗菌藥物使用指南》精選臨床正在使用的藥物，參考國際mic標(biāo)準(zhǔn)只需選擇2種濃度通過顏色變化即可測出藥物敏感性。本試劑盒具備靶向培養(yǎng)和同時(shí)同步檢測藥物的敏感性，6～24小時(shí)內(nèi)一步完成，檢出率高，能夠滿足臨床精準(zhǔn)診斷霉菌性陰道炎及藥物敏感性試驗(yàn)，為臨床醫(yī)生及時(shí)精確診斷和合理使用藥物提供參考依據(jù)，避免臨床濫用抗生素。
附圖說明
圖1為藥敏板結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例是對于本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明以作為對本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容的闡釋，但本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容并不僅限于下述實(shí)施例所述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以且應(yīng)當(dāng)知曉任何基于本發(fā)明實(shí)質(zhì)精神的簡單變化或替換均應(yīng)屬于本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
一.干粉培養(yǎng)基制備：
本發(fā)明的一種用于檢測霉菌性陰道炎的培養(yǎng)液，其中每100ml培養(yǎng)液中，含有如下重量配比的組份：1.5g胰蛋白胨；4g葡萄糖；1.5g酵母提取物；0.15g溴百里酚藍(lán)；0.00005g頭孢曲松鈉；0.00005g硫酸鏈霉素。向含有上述所述的胰蛋白胨、葡萄糖、酵母提取物和溴百里酚藍(lán)的混合物中加入滅菌純化水混溶，121℃高壓滅菌，然后加入頭孢曲松鈉和硫酸鏈霉素，配制完成分裝成3ml/瓶，冷凍干燥后成為干粉培養(yǎng)基。
二.稀釋液制備：每瓶分裝3ml滅菌純化水。
三.藥敏板制作：藥敏板可采用市售產(chǎn)品，其共20孔，如圖1所示，藥敏板上設(shè)有培養(yǎng)置物臺、陰性對照孔c-、陽性對照孔c+、若干組藥物試驗(yàn)孔，每組所述藥物試驗(yàn)孔分為高濃度藥物孔a和低濃度藥物孔b。其中：a1為c-孔(陰性對照孔)，b1為c+孔(陽性對照孔)，a2～a10、b2～b10分別包被9種藥物的高濃度和低濃度，具體構(gòu)成見表1：
表1
a：代表高濃度(ug/ml)b：代表低濃度(ug/ml)c-：陰性對照孔c+：陽性對照孔，數(shù)字代表相應(yīng)的藥物濃度
四.檢測方法
本發(fā)明的霉菌性陰道炎的檢測方法，包括下述步驟：
(1)藥敏板的藥物試驗(yàn)孔預(yù)先包被各種配制的高低濃度藥物溶液；
(2)取一支3ml/瓶的干粉培養(yǎng)基，用一瓶3ml裝的稀釋液稀釋成液體培養(yǎng)基后，汲取100μl到藥敏板的陰性對照孔c-；
(3)用無菌棉拭子取疑似霉菌性陰道炎病人生殖道分泌物，用1ml生理鹽水稀釋混勻后，汲取100μl到剩余液體培養(yǎng)基中混勻成菌液；
(4)汲取100μl菌液到藥敏板的陽性對照孔c+、藥物試驗(yàn)孔中，將藥敏板蓋上蓋子置37℃恒溫箱恒溫培養(yǎng)，6-24h觀察結(jié)果；
五.檢測結(jié)果判讀
1、陽性和陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)
1)孔c+培養(yǎng)基與孔c-相比變黃色，為陽性(+)；
2)孔c+培養(yǎng)基與孔c-相比不變色(綠色)，為陰性(—)；
2、孔c-陰性(—)，孔c+陽性(+)試驗(yàn)有效，判斷余下各孔結(jié)果；
3、孔c-陽性(+)，表示污染，試驗(yàn)無效；
4、孔c-陰性(—)，孔c+陰性(—)表明陰性結(jié)果，余下孔不判斷結(jié)果；
5、藥敏結(jié)果判定：
孔a(—)孔b(—)敏感，
孔a(—)孔b(+)中敏，
孔a(+)孔b(+)耐藥。
六.臨床統(tǒng)計(jì)：
1、采自安徽省婦幼保健院臨床總例數(shù)203例疑是霉菌性陰道炎感染的病人，臨床組診斷采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法選用ttc沙保弱培養(yǎng)基并以藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，產(chǎn)品組診斷采用本發(fā)明試劑盒及檢測方法；
2、臨床組霉菌性陰道炎陽性11例(陽性率5.42％)，產(chǎn)品組24小時(shí)內(nèi)19例(陽性率9.36％)，其中包括臨床組檢出的11例，檢測率高出3.94％；本產(chǎn)品最低靈敏度在100cfu，不僅對于重癥感染的結(jié)果檢測準(zhǔn)確而且對于中輕度感染仍具有較好的檢測靈敏度；
3、產(chǎn)品組與臨床組的藥敏結(jié)果一致。