本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，具體涉及一種檢測人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法。

背景技術(shù)：

肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損害，導致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血機制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。在我國，肝衰竭的主要是由肝炎病毒（主要是乙型肝炎病毒，hepatitisbvirus，hbv）引起的。截至目前，已經(jīng)在人血清中發(fā)現(xiàn)了幾十種基因突變位點，隨著越來越多的抗病毒核苷酸藥物的大量使用，將會產(chǎn)生更多的新的基因突變位點。有些突變利于乙肝患者的恢復，有些突變則會起到抑制作用，例如人血清中存在的少量抵抗慢加急性肝衰竭控制基因，可有效減緩發(fā)病過程，提高治療效果。因此，深入探索與研究人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的突變的位點及序列，建立新的、特異性強的、靈敏度高的、可靠的檢驗方法，對于肝衰竭患者的高效診斷、病情的及時治療等都具有重要意義。

目前，臨床上對肝病患者基因突變的診斷方法主要有pcr產(chǎn)物直接測序法和反向線性雜交法，這兩種方法是目前公認的廣泛用于臨床的檢測方法。產(chǎn)物直接測序法的優(yōu)點是提供的信息量豐富，可以檢測已知與未知的突變，缺點是檢測靈敏度較低，病毒突變株比例達到20％～25％；反向線性雜交法的優(yōu)點是檢測靈敏度較高，可檢測到≥5％的突變株，但只能檢測已知突變，且目前技術(shù)上對同一突變位點（如rt184位點）中的多種突變形式的分辨力有限，此外，使用反向線性雜交法的試劑和配套儀器成本較高。其他檢測多位點突變的方法還有dna芯片法、限制性片段長度多態(tài)性分析法、克隆測序法、焦磷酸測序法、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜測定法（maldi-tof-ms）等。雖然這些檢測方法具有較高的檢測準確率和特異性，但是具有一些明顯的不足和缺陷，比如檢測時間長（往往需要幾個小時、十幾個小時，乃至更長時間），檢測成本高（樣本的檢測過程中耗材多且昂貴），檢測前處理復雜，對操作者的技術(shù)要求高等。因此，我們需要探索并建立一種更精確、靈敏、高效、成本低的分析方法，以期用于臨床上檢測人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

臨床上對人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因突變的診斷方法主要有pcr產(chǎn)物直接測序法和反向線性雜交法，這兩種方法是目前公認的廣泛用于臨床的檢測方法。但是這些方法往往伴隨著檢測時間長、靈敏度低、檢測成本高等缺點。

為了解決以上的問題，本發(fā)明借助超分支滾環(huán)擴增技術(shù)，構(gòu)建了一種靈敏度高、特異性強、檢測結(jié)果準確可靠、檢測成本低等特點的方法用于檢測人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

所設(shè)計的基因序列如下：

本發(fā)明中所用到的dna引物序列（primer）由生工生物工程有限公司（中國，上海）合成并純化，具體序列如下：

p1：cccgaatacacaaag，p2：ctagttaagtacgct，鎖式探針plp：aaacagagttggcccgaatacacaaagagcgtacttaactagttgaggatggtg。

檢測人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法，將目標dna和40nmol/l鎖式探針plp溶液在37℃條件下雜交反應1h，使鎖式探針5’端和3’端無限接近；再向上述溶液中加入6ue.colidna連接酶，0.05%bsa和0.024mmol/lnad⁺，在e-colidna連接酶作用下鎖式探針封閉成環(huán)；溶液中加入核酸外切酶i、iii，37℃反應2h，接著將體系升溫至95℃環(huán)境中10min滅活；上述溶液中接著加入40nmol/lp1、p2，以及9.6ubstdna聚合酶和0.2mmol/ldntp，在63℃下進行超分支滾環(huán)擴增反應1小時，之后95℃加熱10min終止擴增反應；利用sybrgreeni作為熒光指示劑，最終進行熒光檢測。

所述的方法如下：

（1）選擇合適的信號放大技術(shù)：根據(jù)控制肝衰竭基因的突變位點及序列均不同，以及堿基間的相互作用等特點，選擇超分支滾環(huán)擴增技術(shù)用于放大檢測信號，提高檢測靈敏度，構(gòu)建檢測人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。

（2）設(shè)計可準確檢測人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法：根據(jù)基因測序等方法，確定常見的突變位點，設(shè)計合適的探針dna，采用超分支滾環(huán)擴增放大技術(shù)，設(shè)計可高效診斷血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。

（3）可行性分析：為了確保所構(gòu)建方法的合理行，采用熒光分析儀等手段對方法進行表征，并研制方法檢測的可行性。

（4）繪制線性曲線：在所構(gòu)建的新型檢測方法切實可行的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化實驗條件，檢測不同濃度的目標dna，繪制線性曲線，計算檢出限及檢測范圍。

（5）臨床實際樣本的檢測結(jié)果：我們直接收集臨床實際樣本，用于驗證該方法的檢測靈敏度、準確度、可信度等指標。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1）設(shè)計了一種檢測靈敏度高、特異性好的新方法，用于準確檢測人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。

2）采用低成本、耗時短的超分支滾環(huán)擴增技術(shù)，構(gòu)建檢測人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。

3）本發(fā)明的檢測范圍為0.1~40nmol/l，檢測限可以達到0.05nmol/l，且能較好地識別完全互補、單堿基錯配、雙堿基錯配等序列，可以實現(xiàn)臨床上對人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的準確檢測。

附圖說明

圖1本發(fā)明所設(shè)計的實驗原理。

圖2本發(fā)明的可行性分析。

圖3本發(fā)明檢測目標dna時繪制的線性曲線。

具體實施方式

實施例1

1）所設(shè)計的基因序列如下：

本發(fā)明中所用到的dna引物序列（primer）由生工生物工程有限公司（中國，上海）合成并純化，具體序列如下：

e.colidna連接酶(包含e-colidna連接酶,10×連接酶緩沖溶液,10×牛血清白蛋白(0.05%))購自大連寶生物有限公司，核酸外切酶i、iii(exoi、exoiii)及其相應緩沖液購自thermo公司，三磷酸脫氧核糖核苷混合液(dntps)購自生工生物工程有限公司（中國，上海），bstdna聚合酶及其相應緩沖液購自鈕英倫生物技術(shù)（北京）有限公司。sybrgreeni購自下廈門百維信生物公司。thequalitycontrolcornsampleswerepurchasedfromclovertechnologygroup.inc(beijing,china).所用試劑均為ar級別，實驗所用蒸餾水均由milli-q超純水系統(tǒng)凈化。dna緩沖液：50mmol·l^-1tris-hcl（ph7.4）。

2）實驗儀器及實驗參數(shù)設(shè)置：

本發(fā)明中所設(shè)計的檢測方法主要用到的儀器有：

milli-q超純水系統(tǒng)（millipore，bedford，usa），實驗用水均為其凈化的超純水；

phs-3c型精密酸度計（上海大普儀器有限公司）；

finnpipette可調(diào)式移液器（上海熱電儀器有限公司）；

caryeclipse熒光光度計（varian,usa）；

通過熒光分析儀給出信號檢測值，具體的檢測參數(shù)設(shè)置為：

激發(fā)波長：488nm，發(fā)射波長500~600nm。狹縫寬度：10.0nm.我們?nèi)?18nm處得熒光強度作為定量分析的依據(jù)。

3）基于超分支滾環(huán)擴增技術(shù)設(shè)計的方法的原理：

在目標物突變型乙肝耐藥性基因存在下，鎖式探針plp和目標基因發(fā)生特異性結(jié)合。同時使得鎖式探針plp的5’端和3’端無限接近，在e-colidna連接酶的作用下封閉成環(huán)，在外切酶以及bst酶的催化作用下發(fā)生滾環(huán)擴增延伸，形成一條具有大量重復序列且與鎖式探針互補的線狀單鏈。p2和該線狀單鏈結(jié)合在bst酶的催化下從其3’開始延伸，延伸產(chǎn)生的長鏈dna則作為p1結(jié)合的模板，在dna聚合酶的作用下延伸并置換下游引物的延伸產(chǎn)物，被置換的延伸產(chǎn)物又可以作為互補模板,由鎖式探針的滾環(huán)擴增起始引物進行延伸。最終，在溶液形成大量的長度分布不連續(xù)的雙鏈dna。這里，以sybrgreeni作為熒光指示劑，利用sybrgreeni可以嵌入雙鏈dna結(jié)構(gòu)中并發(fā)光的特點，通過熒光強度的變化來測定目標dna的含量。

4）本發(fā)明的實驗步驟：

首先，將一定濃度的目標dna和40nmol/l鎖式探針plp溶液在37℃條件下雜交反應1h，使鎖式探針5’端和3’端無限接近。再向上述溶液中加入6ue.colidna連接酶，0.05%bsa和0.024mmol/lnad⁺（煙酰胺腺苷二核苷酸），在e-colidna連接酶作用下鎖式探針封閉成環(huán)。溶液中加入核酸外切酶i、iii(exoi、exoiii)，37℃反應2h，接著將體系升溫至95℃環(huán)境中10min滅活。hrca反應：上述溶液中接著加入40nmol/lp1、p2，以及9.6ubstdna聚合酶和0.2mmol/ldntp，在63℃下進行超分支滾環(huán)擴增反應1小時，之后95℃加熱10min終止擴增反應。利用sybrgreeni作為熒光指示劑，最終進行熒光檢測。

5）方法的可行性分析：

為了驗證本發(fā)明設(shè)計的原理準確性，我們做了以下對比實驗。比較了無目標物的空白背景和在目標物突變型dna、野生型dna存在下經(jīng)過hrca擴增后熒光強度的變化。當體系無目標物存在下，hrca擴增無法啟動，體系的熒光較弱，當目標物野生型dna存在時，hrca擴增無法啟動，產(chǎn)生較弱的熒光，當目標物突變型dna存在時，經(jīng)hrca擴增后，產(chǎn)生較強的熒光。這是由于目標突變型dna可以與鎖式探針發(fā)生特異性結(jié)合并封閉成環(huán)，在酶的催化下發(fā)生超分支滾環(huán)擴增。以上結(jié)果表明，該發(fā)明可以對目標dna突變型基因給出準確的檢測。

6）線性曲線的繪制：

經(jīng)驗證，本發(fā)明設(shè)計的方法完全可行，經(jīng)優(yōu)化實驗條件后，我們對不同濃度的目標dna野生型基因進行定量檢測。體系的熒光強度隨著目標dna濃度的增加而逐漸增大。同時實驗結(jié)果表明，在0.1~40nmol/l范圍內(nèi)，熒光強度與野生型dna的濃度的對數(shù)成良好的線性關(guān)系，其檢測限可以達到0.05nmol/l，其線性方程為：

y=0.61x-508.11r=0.99985

（其中y為熒光強度；x為野生型dna濃度的對數(shù)；r為相關(guān)系數(shù)。）

7）實際樣品的檢測

通過收集臨床實際樣本，對比臨川檢測數(shù)據(jù)，通過本發(fā)明所述方法可以快速、準確鑒定人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因，檢測結(jié)果如可行性分析結(jié)果（圖2）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建醫(yī)科大學

<120>一種檢測人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法

<130>9

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<170>patentinversion3.3

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