本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及分子檢測小菜蛾對多殺霉素抗性的方法及引物對。

技術(shù)背景

小菜蛾(plutellaxylostella)屬于鱗翅目菜蛾科，英文名diamondbackmoth，是世界性十字花科蔬菜和油菜害蟲，全球每年造成的損失和防治費用高達四五十億美元。20世紀80年代中后期以來，小菜蛾在我國持續(xù)大面積暴發(fā)成災，尤其以華南和西南省份為害嚴重。據(jù)統(tǒng)計，近年來我國蔬菜種植面積接近3億畝/年，已是世界第一大蔬菜種植和生產(chǎn)國，因小菜蛾為害造成的蔬菜減產(chǎn)和治理費用極其高昂。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對小菜蛾的防治仍以化學農(nóng)藥為主，由于殺蟲藥劑的不合理使用及小菜蛾本身的生物學特性，導致其對幾乎所有常用殺蟲劑均產(chǎn)生了抗性。我國田間小菜蛾種群的抗藥性發(fā)展速度極快，并導致蔬菜農(nóng)藥殘留超標嚴重威脅農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，小菜蛾抗藥性治理形勢不容樂觀。

多殺霉素類化合物(spinosyns)是美國陶氏益農(nóng)公司在20世紀90年代初期開發(fā)的一類天然殺蟲產(chǎn)品，屬大環(huán)內(nèi)酯類化合物，由土壤放線菌刺糖多孢菌saccharopolysporaspinosamertz&yao在培養(yǎng)介質(zhì)中經(jīng)有氧發(fā)酵而得的次級代謝產(chǎn)物，包括20多種活性組分。第一代商業(yè)化spinosyns產(chǎn)品多殺霉素(spinosad)首先在美國登記用于作物害蟲防治，由spinosynsa(主要成分)和spinosynsd(次要成分)兩種化合物混合而成，有很高的生物活性，而且對非靶標生物的毒性很低，對人和其它哺乳動物非常安全。但是，除小菜蛾外，目前已報道包括煙芽夜蛾、家蠅、甜菜夜蛾、果蠅、美洲菊斑潛蠅、棉鈴蟲和西花薊馬等多個目的田間采集種群和室內(nèi)選育品系對該藥劑產(chǎn)生了較為嚴重的抗藥性。

從現(xiàn)有研究報道來看，只有小部分研究結(jié)論表明昆蟲對多殺霉素抗性可能與代謝相關(guān)，多數(shù)研究結(jié)果支持靶標抗性機理。perry等(2007)利用基因敲除技術(shù)沉默了果蠅的nachrdα6亞基，發(fā)現(xiàn)該基因的功能缺失致使果蠅對多殺霉素產(chǎn)生1181倍的抗性，推測在其它物種中nachrα6的基因突變可能會導致對多殺霉素的抗性。baxter等(2010)在對多殺霉素極高抗品系(抗性約18,600倍)的研究中取得進展，發(fā)現(xiàn)抗多殺霉素小菜蛾nachrpxα6亞基存在錯誤剪接，使該基因在翻譯過程中發(fā)生提前終止，導致第三跨膜區(qū)之后的蛋白缺失。家蠅抗多殺霉素的研究也顯示是基于靶標的抗性機理，但通過比較家蠅的nachrmdα6亞基抗性和敏感品系該基因選擇性剪接、mrna表達水平及rna編輯等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，表明nachrmdα6基因在家蠅對多殺霉素的抗性形成中未起作用(gao等，2007a)。并且mdα5和mdβ3也沒有發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的基因突變(gao等，2007b)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中小菜蛾對殺蟲劑多殺霉素抗性檢測方法靈敏度低、周期長、材料要求高等問題，根據(jù)我們對小菜蛾抗多殺霉素的分子機理的研究結(jié)果，提供一種分子檢測小菜蛾對多殺霉素抗性的方法及引物對。

本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基tm4缺失突變作為靶標在分子檢測小菜蛾對多殺霉素抗性中的應用；所述的煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基tm4缺失突變是指煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因第十二號外顯子區(qū)域發(fā)生9個堿基的缺失突變，導致其編碼蛋白的第四跨膜結(jié)構(gòu)域由fclfvftlftiiatvavll組成的19個氨基酸突變?yōu)橛蒮clfvftlfttvavll組成的16個氨基酸；小菜蛾多殺霉素敏感品系煙堿型乙酰膽堿受體α6第四跨膜區(qū)tm4為fclfvftlftiiatvavll組成的19個氨基酸構(gòu)成的疏水結(jié)構(gòu)域；多殺霉素抗性品系煙堿型乙酰膽堿受體α6第四跨膜區(qū)tm4為fclfvftlfttvavll組成的16個氨基酸。其中涉及的小菜蛾煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因cdna序列來自genbank(gu207835andgq247883)。

分子檢測小菜蛾對多殺霉素抗性的方法，通過檢測煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因第十二號外顯子區(qū)域是否發(fā)生9個堿基的缺失突變從而判定待測小菜蛾對多殺霉素的抗性，發(fā)生了所述的9個堿基的缺失突變的小菜蛾具有對多殺霉素抗性，未發(fā)生所述的9個堿基的缺失突變的小菜蛾不具備對多殺霉素抗性；煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因第十二號外顯子區(qū)域發(fā)生9個堿基的缺失突變導致其編碼蛋白的第四跨膜結(jié)構(gòu)域由fclfvftlftiiatvavll組成的19個氨基酸突變?yōu)橛蒮clfvftlfttvavll組成的16個氨基酸。

本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選包括用seqidno.1所示的特異性正向引物f和seqidno.2所示的特異性反向引物r(5’端由fam進行熒光標記)對煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因進行pcr擴增，通過對pcr產(chǎn)物進行毛細管電泳，根據(jù)毛細管電泳圖譜直接鑒定小菜蛾個體α6亞基tm4跨膜區(qū)的編碼基因是否存在由9bp的堿基缺失導致的iia氨基酸的缺失突變及其具體類型，一次性區(qū)分該個體為對多殺霉素的敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子。

所述的根據(jù)pcr產(chǎn)物的毛細管電泳圖譜快速鑒定煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基是否發(fā)生tm4缺失突變及其具體類型，一次性區(qū)分出兩個位點敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子的方法為：利用上述專用引物對擴增小菜蛾煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基，若pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后顯示為1個112bp的單峰，則檢測的小菜蛾個體為多殺霉素敏感型純合子(圖2a)；若pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后顯示為1個112bp和1個103bp的雙峰，則檢測的小菜蛾個體為多殺霉素抗性雜合子(圖2b)；若pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后顯示為1個103bp的單峰，則檢測的小菜蛾個體為多殺霉素抗性型純合子(圖2c)。

所述的分子檢測方法，優(yōu)選包含以下步驟：

(1)提取單頭小菜蛾幼蟲或成蟲的基因組dna；

(2)利用seqidno.1所示的特異性正向引物f和seqidno.2所示的特異性反向引物r，對上一步提取的小菜蛾基因組dna進行pcr擴增；

(3)將上一步獲得的pcr產(chǎn)物進行毛細管電泳，通過毛細管電泳圖譜檢測煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基tm4跨膜區(qū)堿基缺失情況，一次性區(qū)分檢測小菜蛾個體是否為煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基第四跨膜結(jié)構(gòu)域缺失3個氨基酸的多殺霉素抗性個體。

其中pcr反應體系25ul：12.5ul2xgcbufferi，1.25ulataqdna聚合酶,1ul單頭小菜蛾樣本的基因組dna，1ul10mmdntps，10mm的引物各1ul，加雙蒸水至反應總體積為25ul；pcr反應程序：94℃預變性3min，然后循環(huán)數(shù)為35：94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s。

用于分子檢測小菜蛾對多殺霉素抗性的引物對，由seqidno.1所示的特異性正向引物f和seqidno.2所示的特異性反向引物r組成。

一種用于快速鑒定小菜蛾對多殺霉素抗性的試劑盒，包含本發(fā)明所述的引物對。

本發(fā)明所述的引物對在制備分子檢測小菜蛾對多殺霉素抗性中的應用。

本發(fā)明所述的引物對在分子檢測小菜蛾對多殺霉素抗性中的應用。

本發(fā)明所述的試劑盒在分子檢測小菜蛾對多殺霉素抗性中的應用。

有益效果

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基tm4跨膜結(jié)構(gòu)域缺失iia氨基酸與多殺霉素抗性相關(guān)，且經(jīng)過外源表達實驗進行功能驗證分析，明確了表達缺失突變的細胞對[³h]-α-bungarotoxin的親和性降低。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)建立了小菜蛾對多殺霉素抗性靶標的分子檢測方法。

本發(fā)明與常規(guī)的生物測定技術(shù)相比，其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在：(1)快速：常規(guī)生測技術(shù)(包括抗性水平測定、診斷劑量分析等)需要采集試蟲并繁殖到一定規(guī)模才可以進行檢測，至少需要2周時間，本發(fā)明可直接檢測田間小菜蛾個體，從取得樣本到獲得檢測結(jié)果在12個小時以內(nèi)(若送公司進行毛細管電泳也僅需24小時)。(2)準確：生物測定技術(shù)要求試蟲標準化，一般要求待測試蟲為小菜蛾3齡中期幼蟲，取樣誤差和蟲體之間的差異對結(jié)果影響很大，造成結(jié)果的不穩(wěn)定性。本技術(shù)由于采取了核苷酸擴增策略，通過直接判讀毛細管電泳圖譜在可快速操作的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了準確性的最強化。(3)材料要求少：生物測定技術(shù)中測定一個標準曲線至少需要200-300頭標準試蟲，這些試蟲的飼養(yǎng)需要花費一定的人力、物力。而本發(fā)明對一個種群的檢測只需要50頭左右，即可判定種群中突變個體的基因型，計算出與抗性有關(guān)的等位基因突變頻率。(4)靈敏度高：傳統(tǒng)生物測定檢測技術(shù)是一種相對粗略檢測抗性水平的方法，不能檢測早期多殺霉素抗性或低頻率抗性個體，本發(fā)明基于小菜蛾對多殺霉素抗性相關(guān)的缺失突變，設(shè)計特異性引物擴增目的片段，根據(jù)毛細管電泳圖譜可以直接判斷待測個體的基因型。通過一定數(shù)量的個體的測定，可以確定某個種群中敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子的頻率，為高水平多殺霉素的抗藥性預警和小菜蛾化學治理提供了重要依據(jù)。

附圖說明

圖1小菜蛾煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因氨基酸序列比對圖

圖示小菜蛾煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基cdna序列，其中sz-ps序列來自小菜蛾敏感品系，該基因第四跨膜區(qū)tm4為fclfvftlftiiatvavll組成的19個氨基酸；spin-del序列來自小菜蛾多殺霉素抗性品系，該基因第四跨膜區(qū)tm4為fclfvftlfttvavll組成的16個氨基酸，即缺失iia氨基酸。

圖2小菜蛾煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因突變區(qū)域pcr產(chǎn)物毛細管電泳圖譜

圖示為利用seqidno.1所示的特異性正向引物f和seqidno.2所示的特異性反向引物r(5’端由fam進行熒光標記)對小菜蛾基因組dna模板進行pcr擴增，產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后獲得的圖譜。若pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后顯示為1個112bp的單峰，則檢測的小菜蛾個體為多殺霉素敏感型純合子(圖2a)；若pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后顯示為1個112bp和1個103bp的雙峰，則檢測的小菜蛾個體為多殺霉素抗性雜合子(圖2b)；若pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后顯示為1個103bp的單峰，則檢測的小菜蛾個體為多殺霉素抗性型純合子(圖2c)

具體實施方式

實施例1

本實施例選取了室內(nèi)敏感品系sz-ps、經(jīng)多殺菌素多代選育獲得的抗性品系spin-del和田間采集的合肥(hf)、濟南(jn)、南京(nj)、昆山(ks)種群進行了生物測定，并運用本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)檢測了各種群攜帶的等位基因頻率。其中hf、jn、nj和ks種群分別于2015年5-6月份間采集自安徽省合肥市小白菜寄主、山東市濟南市甘藍寄主、江蘇省南京市甘藍寄主和江蘇省昆山市小白菜寄主。上述各種群對多殺霉素的生物測定數(shù)據(jù)見表1：

表1

注：sz-ps品系為室內(nèi)飼養(yǎng)多年的敏感材料，其對多殺霉素的致死中濃度(lc50值)在本實驗中作為對照基線，以此測定其他5個種群的抗性水平。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的分子檢測技術(shù)，其具體實施步驟包括：

1.單頭小菜蛾幼蟲基因組dna的提取：分別隨機挑取上述種群的25-30頭四齡幼蟲，使用axyprep^tmmultisourcegenomicdnaminiprepkit基因組試劑盒提取全基因組dna。

2.以各種群小菜蛾的基因dna模板進行煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因突變區(qū)域的pcr擴增。

(1)設(shè)計小菜蛾鈉離子通道基因的特異性引物，上游引物f序列為:5’-ttgatgacagtgattgtgtgtgtt-3’(seqidno.1)、下游引物r序列為:5’-tcactgcacgatgatgtgcgg-3’(seqidno.2)，引物合成由上海invitrogen公司完成。

(2)在0.2ml的pcr管中完成總反應體積為25μl的目的片段擴增：

(3)pcr反應程序為：首先94℃預變性3min，進行循環(huán)數(shù)為35：94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

3.對6個種群各個樣本獲得的pcr產(chǎn)物進行毛細管電泳，根據(jù)電泳圖譜結(jié)果快速鑒定煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基是否發(fā)生tm4缺失突變及其具體類型。

4.計算小菜蛾各種群攜帶抗性等位基因的突變頻率。

小菜蛾煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基介導的多殺霉素抗性等位基因頻率的計算方法如下：

抗性等位基因頻率＝(抗性純合子個體數(shù)×2+抗性雜合子個體數(shù))/(總檢測個體數(shù)×2)

根據(jù)上述計算方法，測得本例涉及的6個種群檢測個體的基因型和抗性等位基因突變頻率如下：

表2

注：ss表示敏感純合子、rs表示抗性雜合子、rr表示抗性純合子

通過本實施案例，本發(fā)明優(yōu)選的分子檢測技術(shù)可以快速測定不同種群堿型乙酰膽堿受體α6亞基是否發(fā)生tm4缺失突變及其具體類型，并可簡便地計算該種群對多殺霉素靶標性抗性突變的等位基因頻率。說明書中所述的煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基tm4缺失突變是指該基因第四跨膜結(jié)構(gòu)域由fclfvftlftiiatvavll組成的19個氨基酸突變?yōu)橛蒮clfvftlfttvavll組成的16個氨基酸。

實施例2

本例使用的科研材料為小菜蛾敏感品系sz-ps與多殺霉素抗性品系spin-del雜交f1代進行自交獲得的f2代個體。本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案在本實例中用于計算小菜蛾個體攜帶抗性突變的情況，并根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律和抗性原理確定本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的iia突變與多殺霉素抗性的遺傳連鎖關(guān)系。

1.隨機選取小菜蛾敏感品系sz-ps與多殺霉素抗性品系spin-del各60頭進行室內(nèi)交配，成蟲以10％的蜂蜜水輔助營養(yǎng)，產(chǎn)卵于蘿卜苗溫室養(yǎng)殖。待幼蟲羽化后群體交配產(chǎn)卵獲得f2代研究材料。

2.隨機選取f2代個體經(jīng)區(qū)分劑量(10ppm)處理，隨機挑取13頭存活和47頭死亡個體提取基因組。所有個體基因組dna的提取采用axyprep^tmmultisourcegenomicdnaminiprepkit基因組試劑盒。

3.利用第一步中提取的基因dna模板進行煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基基因目的片段的pcr擴增：

(1)設(shè)計小菜蛾鈉離子通道基因的特異性引物，上游引物f序列為:5’-ttgatgacagtgattgtgtgtgtt-3’(seqidno.1)、下游引物r序列為:5’-tcactgcacgatgatgtgcgg-3’(seqidno.2)，引物合成由上海invitrogen公司完成。

(2)在0.2ml的pcr管中完成總反應體積為25μl的目的片段擴增：

(3)pcr反應程序為：首先94℃預變性3min，進行循環(huán)數(shù)為35：94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

4.對各樣本獲得的pcr產(chǎn)物進行毛細管電泳，根據(jù)電泳圖譜結(jié)果快速鑒定煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基是否發(fā)生tm4缺失突變及其具體類型。

根據(jù)所述的檢測方法，檢測各個體的基因型信息如下：

①：經(jīng)區(qū)分劑量處理存活個體共檢測13頭，其基因型全部為rr型，即13頭個體的pcr產(chǎn)物毛細管電泳圖譜均為1個103bp的單峰。

②：經(jīng)區(qū)分劑量處理死亡個體共檢測47頭，經(jīng)pcr擴增后的毛細管電泳圖譜顯示，其中32頭個體為rs型基因型，即為1個103bp的峰和112bp的峰；另外15頭個體為112bp的單峰。

表3

根據(jù)孟德爾遺傳分離規(guī)律和相關(guān)的抗性基本原理，結(jié)合實施例1的檢測數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)敏感品系個體全部為敏感型α6亞基ss，抗性品系全部為突變型α6亞基rr，f2代經(jīng)區(qū)分劑量處理存活后個體均為突變型α6亞基rr，處理死亡組的47頭個體中32頭為雜合性突變體rs，15頭個體為敏感型α6亞基ss(即rs：ss＝2:1，符合孟德爾遺傳分離規(guī)律)。本例根據(jù)電泳圖譜結(jié)果快速鑒定煙堿型乙酰膽堿受體α6亞基是否發(fā)生tm4缺失突變及其具體類型，并根據(jù)實驗結(jié)果從遺傳上證實本研究發(fā)現(xiàn)的小菜蛾nachrα6亞基iia缺失突變與多殺霉素抗性連鎖。