專利名稱：廈霉素a和氧廈霉素的生物合成基因簇及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及吲哚倍半萜類抗生素廈霉素A(xiamycin A)和氧廈霉素(oxiamycin)的生物合成基因簇及其應用。
背景技術(shù)：
吲哚倍半萜是一類含有吲哚的生物堿。已報道發(fā)現(xiàn)的吲哚倍半萜生物堿類化合物主要來源于植物，例如來自暗羅屬植物Polyalthia oliveri的polyalthenol ;來自舌甘楊(P. suaveolens)的 polyveoline 以及來自 Greenwayodendron suaveolens 的suaveolindole等,最近的一個例子是polysin和pentacyclindole。直到最近十年，真菌來源的11引哚倍半職才陸續(xù)被報道,包括sespendole和lacanindoles。Cane的基因組數(shù)據(jù)挖掘工作表明放線菌是萜類化合物的豐富來源。與此相對應，最近，一些來源于放線菌的吲 哚倍半職類化合物相繼被發(fā)現(xiàn)，包括從一株土壤鏈霉菌中分離到的oridamycin A和B,從兩個紅樹林植物內(nèi)生鏈霉菌中分離到的廈霉素A (xiamycin A，I)，其結(jié)構(gòu)式如圖I所示和B，以及 indosespene (3)和 sespenine。研究發(fā)現(xiàn)，來自 Streptomyces sp. strain KS84 的Oridamycins A和B具有抗真菌活性，來自紅樹林內(nèi)生菌Streptomyces sp. GT2002/1503的廈霉素A具有選擇性的抗HIV活性和中等抗菌活性。近十多年來發(fā)展起來的組合生物合成技術(shù)為改造復雜天然產(chǎn)物提供了新的思路和方法。在闡明了自然界的生物合成途徑、克隆和鑒定微生物天然產(chǎn)物生物合成基因簇的基礎(chǔ)上，采用組合生物合成技術(shù)對發(fā)現(xiàn)的生物合成基因、調(diào)控基因進行體內(nèi)敲除、突變、置換和重組等操作，不但能夠生產(chǎn)“非天然”的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物，而且還可以提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量，或定向積累所需要的天然產(chǎn)物，為天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)提供分子和活性多樣性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇。本發(fā)明的廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇，其特征在于，該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第2693 26792位的堿基序列所示，包含18個基因，具體為(I)負責職類骨架合成的基因，即xiaD、xiaE、xiaF、xiaN、xiaP共5個基因xiaD位于基因簇核苷酸序列第5512-6504個堿基處，長度為993個堿基對，編碼4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸還原酶，330個氨基酸；xiaE位于基因簇核苷酸序列第6517-8334個堿基處，長度為1818個堿基對，編碼I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶,605個氨基酸；xiaF位于基因簇核苷酸序列第8331-9482個堿基處，長度為1152個堿基對，編碼4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸合酶，383個氨基酸；XiaN位于基因簇核苷酸序列第16457-17482個堿基處，長度為1026個堿基對，編碼聚異戊二烯二磷酸合酶，341個氨基酸；xiaP位于基因簇核苷酸序列第19795-20802個堿基處，長度為1008個堿基對，編碼聚異戊二烯合成酶，335個氨基酸；(2)氧化還原酶基因，即 xiaA、xiaB、xiaI、xiaJ、xiaK、xiaL、xiaM、xiaO 共 8 個基因XiaA位于基因簇核苷酸序列第2693-3784個堿基處，長度為1092個堿基對，編碼含有Rieske 2Fe-2S (鐵硫蛋白)結(jié)構(gòu)域加氧酶，363個氨基酸；xiaB位于基因簇核苷酸序列第3843-4337個堿基處，長度為495個堿基對，編碼黃素還原酶，164個氨基酸；
xial位于基因簇核苷酸序列第11512-12705個堿基處，長度為1194個堿基對，編碼吲哚氧化酶/乙酰CoA脫氫酶，397個氨基酸；XiaJ位于基因簇核苷酸序列第12708-13097個堿基處，長度為390個堿基對，編碼檸檬烯-1，2-環(huán)氧化物水解酶，129個氨基酸；XiaK位于基因簇核苷酸序列第13100-14890個堿基處，長度為1791個堿基對，編碼芳香環(huán)羥化酶，596個氨基酸；XiaL位于基因簇核苷酸序列第14890-15123個堿基處，長度為234個堿基對，編碼鐵氧化還原蛋白，77個氨基酸；XiaM位于基因簇核苷酸序列第15149-16318個堿基處，長度為1170個堿基對，編碼細胞色素P450氧化酶,389個氨基酸；xiaO位于基因簇核苷酸序列第17610-19766個堿基處，長度為2157個堿基對，編碼單加氧酶，718個氨基酸；(3)編碼調(diào)控子和轉(zhuǎn)運子的基因，即xiaC、xiaG、xiaH、xiaQ、xiaR共5個基因xiaC位于基因簇核苷酸序列第4502-5278個堿基處，長度為777個堿基對，編碼IclR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，258個氨基酸；xiaG位于基因簇核苷酸序列第9930-10652個堿基處，長度為723個堿基對，編碼LuxR家族調(diào)控蛋白，240個氨基酸；xiaH位于基因簇核苷酸序列第10645_11445個堿基處，長度為801個堿基對，編碼假定的膜蛋白，266個氨基酸；xiaQ位于基因簇核苷酸序列第20897-23875個堿基處，長度為2979個堿基對，編碼LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，992個氨基酸；xiaR位于基因簇核苷酸序列第24018-26792個堿基處，長度為2775個堿基對，編碼LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，924個氨基酸。在廈霉素A生物合成基因簇的上下游基因，即orf (-2)、orf(-l)、orfl、orf2共4個基因orf (-2)位于基因簇核苷酸序列第1_1644個堿基處，長度為1644個堿基對，編碼FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸)依賴型氧化還原酶，547個氨基酸；orf (-1)位于基因簇核苷酸序列第1641-2696個堿基處，長度為1056個堿基對，編碼乙醇脫氫酶，351個氨基酸；orfl位于基因簇核苷酸序列第27049-27486個堿基處，長度為438個堿基對，編碼鋅金屬蛋白酶，編碼145個氨基酸；orf2位于基因簇核苷酸序列第27845-29371個堿基處，長度為1527個堿基對，編碼假定的鈉耦合通透酶，編碼508個氨基酸。SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的堿基序列的互補序列可根據(jù)DNA堿基互補原則隨時得到。SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)或用合適的限 制性內(nèi)切酶酶切相應的DNA或DNA體外合成技術(shù)或使用其他合適的技術(shù)得到。本發(fā)明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO. I的第2693位到26792位中DNA序列的重組DNA載體的途徑。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生廈霉素A生物合成基因被中斷或其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO. I的第2693位到26792位中的核苷酸序列。本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法或包含本發(fā)明序列SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的DNA作為探針以Southern雜交等方法從其他生物體中得到與廈霉素A生物合成基因簇相似的基因。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于從鏈霉菌SCSIO 02999基因組文庫中定位更多的文庫質(zhì)粒。這些文庫質(zhì)粒至少包含本發(fā)明中的部分序列，也包含有鏈霉菌SCSIO 02999基因組中鄰近區(qū)域未克隆的DNA。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被體內(nèi)體外修飾或進行突變，包括插入、置換或缺失，聚合酶鏈式反應，錯誤介導聚合酶鏈式反應，位點特異性突變，不同序列的重新連接，序列的不同部分或與其他來源的同源序列進行定向進化，或通過紫外線或化學試劑誘變等。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適的表達體系在外源宿主中表達以得到相應的酶或其他更高的生物活性物質(zhì)或產(chǎn)量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈霉菌、小單孢菌、假單孢菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動物等。本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以用來分離所需要的蛋白并可用于抗體的制備。包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學活性，或者提高了產(chǎn)量或優(yōu)化了蛋白動力學特征或其他致力于得到的性質(zhì)。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達并了解它們在宿主代謝中的功能。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列編碼的蛋白可以催化合成indosespene類化合物，進一步催化合成抗生素廈霉素A。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過遺傳重組來構(gòu)建重組載體以獲得新型生物合成途徑，也可以通過插入、置換、缺失或失活進而獲得其他新型生物合成途徑或者產(chǎn)生新的化合物。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因DNA片段可以通過中斷廈霉素A生物合成的一個或幾個步驟而得到新的廈霉素結(jié)構(gòu)類似物或前體。包含DNA片段或基因可以用來提高廈霉素A或其衍生物的產(chǎn)量，本發(fā)明提供了在基因工程微生物中提高產(chǎn)量的途徑。本發(fā)明所提供的催化合成indosespene類化合物的合成基因可用于合成廈霉素A衍生物。本發(fā)明所提供的廈霉素骨架的后修飾基因或其他酶提供了通過遺傳修飾得到類似物的途徑，所包含的催化吲哚倍半萜類化合物生成或后修飾的其他應用。本發(fā)明所提供的n引哚氧化酶XiaI是一個新型的環(huán)化酶,可用于催化indosespene類化合物形成吲哚倍半萜的成環(huán)反應。本發(fā)明還提供了廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇在制備廈霉素A及其類似物中的應用。本發(fā)明還提供了廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇在制備氧廈霉素及其類似物中的應用。本發(fā)明還提供了廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇在制備化合物indosespene及其類似物中的應用。
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本發(fā)明還提供了一種編碼吲哚氧化酶/乙酰CoA脫氫酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第11512 12705位堿基序列所示。本發(fā)明還提供了所述的編碼吲哚氧化酶/乙酰CoA脫氫酶的基因編碼的吲哚氧化酶/乙酰CoA脫氫酶?？傊?，本發(fā)明所提供的包含廈霉素A和氧廈霉素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息，可以幫助人們理解廈霉素家族天然產(chǎn)物的生物合成機制，為進一步遺傳改造提供了材料和知識。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。本發(fā)明的海洋來源的鏈霉菌(Streptomyces sp. ) SCSIO 02999,該菌于2012年4月26保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(0^0)，地址中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCCN0 M 2012145。


圖I是廈霉素A (化合物I)和氧廈霉素(化合物2)的化學結(jié)構(gòu)式。圖2是推測的廈霉素A和氧廈霉素的生物合成途徑。圖3是陽性克隆的相互重疊區(qū)示意圖，包括了陽性克隆pCSG2402，pCSG2403，PCSG2404, pCSG2405, pCSG2407, pCSG2408，粗實線表示廈霉素A生物合成基因簇，箭頭所示為引物XiaD-lF/XiaD-lR和XiaN_lF/XiaN_lR擴增片段的位置。圖4是廈霉素A和氧廈霉素生物合成基因簇的組織結(jié)構(gòu)示意圖。圖5是基因遺傳改造鏈霉菌SCSIO 02999中廈霉素A和氧廈霉素生物合成基因簇得到的突變株在AM6發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物的高壓液相分析圖(A)野生型菌株鏈霉菌SCSI002999經(jīng)發(fā)酵獲得了廈霉素A (I)和氧廈霉素(2) ; (B)敲除了 orf(-l)-乙醇脫氫酶基因，獲得的突變株XM31發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素；(C)敲除了xiaB-黃素還原酶基因，獲得的突變株XM33發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素；(D)敲除了 XiaC-IclR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因，獲得的突變株XM34發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素；(E)敲除了 xiaD-4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸還原酶，獲得的突變株XM35發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素；(F)敲除了 xiaE-1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因，獲得的突變株XM36發(fā)酵仍然能產(chǎn)生了化合物廈霉素A和氧廈霉素，但產(chǎn)量有所降低；(G)敲除了 xiaF-4-羥基-3-甲基-2- 丁烯-I-基磷酸合酶基因，獲得的突變株XM37發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素，但產(chǎn)量有所降低；(H)敲除了 xiaG-LuxR家族調(diào)控蛋白基因，獲得的突變株XM38失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(1)敲除了 xiaH-假定的膜蛋白基因，獲得的突變株XM39失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(J)敲除了 xiaj-檸檬烯-1，2-環(huán)氧化物水解酶基因，獲得的突變株XM40發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素；(K)敲除了 xial-吲哚氧化酶/乙酰輔酶A脫氫酶基因，獲得的突變株XM41失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(L)敲除了XiaK-芳香環(huán)羥化酶基因，獲得的突變株XM42發(fā)酵不能產(chǎn)生化合物氧廈霉素，廈霉素A的產(chǎn)量大幅降低，而且產(chǎn)生了新化合物3 (indosespene) ; (M)敲 除了 xiaL-鐵氧化還原蛋白基因，獲得的突變株XM43失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(N)敲除了 XiaM-細胞色素P450氧化酶基因，獲得的突變株XM44失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(0)敲除了xiaN-聚異戊二烯二磷酸合酶基因，獲得的突變株XM45發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素；(P)敲除了 xiaO-單加氧酶基因，獲得的突變株XM46失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(Q)敲除了 xiaP-聚異戊二烯合成酶基因，獲得的突變株XM47失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(R)敲除了 XiaQ-LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因，獲得的突變株XM48失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(S)敲除了 xiaR-LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因，獲得的突變株XM49失去了產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素的能力；(T)敲除了 orfl-鋅金屬蛋白酶基因，獲得的突變株XM50發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素；(U)敲除了 orf2-通透酶基因，獲得的突變株XM51發(fā)酵仍然能產(chǎn)生化合物廈霉素A和氧廈霉素。圖6是分離到的合成途經(jīng)中間產(chǎn)物3的化學結(jié)構(gòu)式。圖7 (A)是優(yōu)化培養(yǎng)條件后鏈霉菌SCSIO 02999及其基因遺傳改造突變株XM44發(fā)酵產(chǎn)物的高壓液相分析圖(i)鏈霉菌SCSIO 02999野生型菌株在AM6發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵7天的產(chǎn)物檢測；(ii)鏈霉菌SCSIO 02999野生型菌株在AM6-4發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵7天的產(chǎn)物檢測，廈霉素A和氧廈霉素的產(chǎn)量有所提高；(iii)突變株XM42在AM6發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵7天的產(chǎn)物檢測；(iv)突變株XM42在AM6-4發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵7天的產(chǎn)物檢測，能檢測到產(chǎn)生了新化合物4和5 ; (V)突變株XM44在AM6發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵7天的產(chǎn)物檢測；(vi)突變株XM44在AM6-4發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵7天的產(chǎn)物檢測，能檢測到產(chǎn)生了新化合物6和7 ； (B)是從XM42和XM44在AM6-4發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵的產(chǎn)物中分離到的化合物4_7的化學結(jié)構(gòu)式。圖8是部分突變株添加二甲基亞砜(DMS0)、廈霉素A或化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物的高壓液相分析圖(A)是突變株XM41添加廈霉素A或化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物的高壓液相分析圖(i)廈霉素A標準品；(ii)氧廈霉素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM41添加DMSO培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物；(V)突變株XM41添加化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，沒有產(chǎn)生廈霉素A和氧廈霉素，也沒有產(chǎn)生其他新的化合物；(vi)突變株XM41添加廈霉素A培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生了氧廈霉素；(B)是突變株XM43添加廈霉素A或化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵廣物的聞壓液相分析圖(i)廈霉素A標準品；(ii)氧廈霉素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM43添加DMSO培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物；(v)突變株XM43添加化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生了廈霉素A和氧廈霉素；(vi)突變株XM43添加廈霉素A培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生了氧廈霉素；(C)是突變株XM44添加廈霉素A或化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物的高壓液相分析圖(i)廈霉素A標準品；(ii)氧廈霉素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM44添加DMSO培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物；(v)突變株XM44添加化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生了廈霉素A和氧廈霉素；(vi)突變株XM44添加廈霉素A培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生了氧廈霉素；(D)是突變株XM46添加廈霉素A或化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物的聞壓液相分析圖(i)廈霉素A標準品；(ii)氧廈霉素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM46添加DMSO培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物；(v)突變株XM43添加化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生了廈霉素A，但沒有產(chǎn)生氧廈霉素；(Vi)突變株XM46添加廈霉素A培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，沒有產(chǎn)生氧廈霉素；(E)是突變株XM47添加廈霉素A或化合物3培養(yǎng)后 的發(fā)酵產(chǎn)物的高壓液相分析圖(i)廈霉素A標準品；(ii)氧廈霉素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM47添加DMSO培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物；(v)突變株XM47添加化合物3培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生了廈霉素A和氧廈霉素；(vi)突變株XM47添加廈霉素A培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生了氧廈霉素。圖9是吲哚氧化酶XiaI的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，(A)XiaI生物轉(zhuǎn)化化合物3的高壓液相分析圖(i)廈霉素A標準品；(ii)化合物3標準品；(iii)攜帶pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那霉素，0. ImM IPTG和60 y M化合物3的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時的HPLC檢測結(jié)果；(iv)攜帶pCSG2604質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 y M卡那霉素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物3的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時的HPLC檢測結(jié)果，化合物3已經(jīng)部分轉(zhuǎn)化為化合物8和廈霉素A ; (V)攜帶pCSG2604質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 u M卡那霉素，0. ImM IPTG和60 y M化合物3的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的HPLC檢測結(jié)果，化合物3已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為廈霉素A，同時化合物8也消失了 ；“ ”表示大腸桿菌宿主發(fā)酵生成的物質(zhì)；(B)反應中間產(chǎn)物8的化學結(jié)構(gòu)式；(C) XiaI催化反應的示意圖；(D) XiaI生物轉(zhuǎn)化化合物6和7的高壓液相分析圖(i)攜帶pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那霉素，0. ImM IPTG和60 y M化合物6的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的HPLC檢測結(jié)果；(ii)攜帶pCSG2604質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 y M卡那霉素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物6的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的HPLC檢測結(jié)果，化合物6已經(jīng)部分轉(zhuǎn)化為化合物9攜帶pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)在含有50 y M卡那霉素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物7的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的HPLC檢測結(jié)果；(iv)攜帶pCSG2604質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那霉素，0. ImM IPTG和60 y M化合物7的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的HPLC檢測結(jié)果，化合物7已經(jīng)部分轉(zhuǎn)化為化合物10。圖10是吲哚氧化酶XiaI的體外生化鑒定，(A)純化蛋白XiaI的蛋白電泳分析；(B)XiaI反應的高壓液相分析圖(i)廈霉素A標準品；(ii)化合物3標準品；(iii)XiaI的標準反應體系包括400 u M化合物3，ImM黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，2mM NADH, 5 u MXiaI，50mM Tris-HCl (pH 8. 0)，28°C反應4小時，化合物3部分反應生成化合物8和廈霉素A ;(iv)標準反應體系中的NADH換成NADPH，化合物3部分能反應生成廈霉素A，但是催化效率明顯低于標準體系；(V)標準反應體系中的XiaI換成經(jīng)過10分鐘沸水浴處理的XiaI,化合物3不能反應生成廈霉素A，說明加熱會導致XiaI失活；(vi)標準反應體系缺少FAD，化合物3部分不能反應生成廈霉素A ； (vii)標準反應體系缺少NADH，化合物3部分不能反應生成廈霉素A ; (viii)反應體系包括400 ii M化合物3，ImM黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，5uM XiaI,50mM Tris-HCl (pH 8.0) ; (ix)標準反應體系中的FAD換成FMN，化合物3部分反應生成化合物8和廈霉素A ; (X)標準反應體系中的FAD換成FMN，XiaI換成經(jīng)過10分鐘沸水浴處理的Xial，化合物3不能反應生成廈霉素A 表示酶反應中的雜質(zhì)。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。I.鏈霉菌SCSIO 02999基因組序列掃描及廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇序列分析和功能分析 通過對鏈霉菌(Streptomyces sp. ) SCSIO 02999進行全基因組掃描和注釋,在其中找到了 29kb的廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇，包含了 22個開放閱讀框(openreading frames, ORFs)(表I )。根據(jù)生物信息學分析，其中xiaD、E、F、N和P五個基因可能參與xiamycineA的職類骨架的合成,xiaA、B、I、J、K、L、M和0八個基因編碼氧化還原酶,xiaC、G、H、Q和R則是五個編碼調(diào)控子和轉(zhuǎn)運子的基因。廈霉素A的生物合成途徑初步確定如下(圖2) XiaD, XiaE和XiaF與非甲羥戊酸途徑中的羥甲基丁烯焦磷酸還原酶(IspH)、1_脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)和4-羥基-3-甲基丁 -2-烯基磷酸合酶(IspG)具有很高的一致性，而編碼非甲羥戊酸途徑中的另外幾個酶則可以在xia基因簇外的基因組序列中找到，據(jù)此推測XiaD、E和F以及一些在xia基因簇外的酶通過非甲羥戊酸途徑提供IPP和 DMAPP, XiaN 催化 IPP 和 DMAPP 縮合形成法尼基焦憐酸(farnesyl-diphosphate, FPP),而XiaP則負責將FPP裝載到吲哚環(huán)上，形成3-法尼基吲哚。隨后，3-法尼基吲哚可能通過一個分子內(nèi)的環(huán)化和隨后水解觸發(fā)的環(huán)化機制形成preindosespene。其中xiaA、B、L編碼的XiaA、B、L蛋白可能組成Rieske [2Fe_2S]型非血紅素鐵氧化酶家族，與具有環(huán)氧酶功能的細胞色素P450氧化酶XiaM共同參與分子內(nèi)環(huán)化過程，而檸檬烯-1，2-環(huán)氧化物水解酶XiaJ催化水解并觸發(fā)環(huán)化形成preindosespene。細胞色素P450氧化酶XiaM還能選擇性催化氧化preindosespene的24位碳上的甲基變成羧基,生成中間產(chǎn)物indosespene (3)?？谝嵫趸竂iaI催化indosespene反應生成xiamycine A。氧廈霉素則可能是由XiaI和另外兩個酶XiaK和XiaO共同催化indosespene產(chǎn)生。表I :廈霉素A和氧廈霉素生物合成基因簇的基因及其功能分析基因~~同源蛋白6推測功能
orf(-2)5470x3 (ACP19698, 74/88)FAD (黃素腺嘌呤二核If酸)依賴型氧化還原酶
orf(-l)351SACTE_6109 (AEN13888,72/81)乙醇脫氫酶
XiaA363S CLAY_0024 (EFG05100, 58/72)含有 Rieske2Fe-2S (鐵硫蛋白)結(jié)構(gòu)域加娬_
xiaB164Strvi_6224 (AEM85702,76/84)黃素還原酶
xiaC258Trd_0252 (ACM04610,35/49)IclR 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋 A
xiaD330Kfla—4244 (ADB33280，72/79)4-羥基-3-甲基-2-T烯S-傷磷酸還原酶
XiaE605Caci_6415 (ACU75269, 63/73)I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸介_
xiaF383IspG(ZP_08876217, 90/95)4-P^S-3-丨f 基-2-j—烯基-焦磷酸合酶
xiaG240Micau_3829 (ADL47353,55/70)LuxR 家族調(diào)控蛋白
xiaH266OrflS (BAD07391,39/59)假定的膜蛋白
xial397Qrf5 (AAY54299,39/55)吲哚氧化_/乙酰 CoA 脫氫酶
XiaJ129Swit_5231 (ABQ71340, 37/53)檸檬烯-I，2-環(huán)氧化物水解酶
XiaK596RHAl_ro00538 (ABG92374,52/65)芳香環(huán)羥化酶
XiaL77SACE 2838 (CAM02117, 59/68)鐵氧化還原蚩 A
XiaM389Mjls_0508 (ABN96320,47/61)細胞色素 P450 氧化藝
xiaN341HopB (BAC69362,52/63)聚異戊二烯二磷酸
xiaO718SSFG_00177 (EFE64923,52/64)單加氣酶
xiaP335SSNG—07282 (EFL20030, 44/59)聚異戊二烯合成
xiaQ992PlmR5 (AEW92815,41/50)LuxR 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白
xiaR924PlmR4 (AAQ84140,33/44)LuxR 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋內(nèi)
orfl145bcere00I9_23140 (EEL34460,35/47)鋅金屬蛋白酶
orp508SGM_0166 (EGG49826, 86/91)_假定的鈉耦合通透酶_a氨基酸數(shù)目；b括號中包含了同源蛋白的GeneBank登錄號，及與之對應的一致性/ 相似性(identity/similarity)。2.廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇的克隆、分析及邊界的確定根據(jù)基因組序列注釋和生物信息學分析，以參與廈霉素A骨架合成的羥甲基丁烯基焦磷酸還原酶基因xiaD和異戊二烯二磷酸合酶基因xiaN的序列設(shè)計PCR篩選引物，從鏈霉菌SCSIO 02999的基因組文庫2400個克隆中篩選，獲得了 8個陽性克隆，其中的4個用兩對引物能夠同時篩選獲得。這些陽性克隆經(jīng)酶切分析表明其中兩個cosmid包含了整個廈霉素A和氧廈霉素生物合成基因簇，其他4個cosmid包含部分基因簇(圖3)。生物信息學分析表明，orf (-2)基因編碼FAD依賴的氧化還原酶，orf(-l)基因編碼乙醇脫氫酶，據(jù)報道這兩個酶均參與macrolactam的合成，與廈霉素A的生物合成無關(guān)。通過建立鏈霉菌SCSIO 02999的遺傳操作體系，構(gòu)建了 orf (-1)基因滅活的突變株XM31，該突變株經(jīng)發(fā)酵仍舊能夠生產(chǎn)廈霉素A和氧廈霉素，產(chǎn)量與野生型相當，從而確證了 orf(-l)不參與廈霉素的生物合成。由于未能獲得與orf (-1)相鄰的含有Rieske 2Fe_2S (鐵硫蛋白)結(jié)構(gòu)域的加氧酶基因XiaA的滅活突變株XM32，難以確定該基因是否參與廈霉素的生物合成，因此廈霉素生物合成基因簇的左邊界還不是十分確定。滅活編碼短鏈脫氫酶的基因orfl和編碼鈉耦合通透酶的基因orf2，獲得突變株XM50和XM51，兩突變株仍能生產(chǎn)廈霉素A，產(chǎn)量與野生型相當，排除了 orfl基因參與廈霉素A生物合成的可能性。同時，滅活在orfl基因上游的編碼Lux家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的xiaQ和xiaR基因，獲得的突變株XM48和XM49不能生產(chǎn)廈霉素A和氧廈霉素，說明xiaQ和xiaR可能是廈霉素A和氧廈霉素生物合成的負調(diào)控因子，與廈霉素A和氧廈霉素合成相關(guān)。這些結(jié)果表明orfl是廈霉素A和氧廈霉素生物合成基因簇的右邊界(圖4)。因此，廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇的邊界的上游初步確定為xiaA,下游為xiaR (圖4),該廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第2693 26792位的堿基序列所示。。3.廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇中各基因的功能分析在克隆、分析了完整的廈霉素和氧廈霉素的生物合成基因簇，研究了各基因編碼蛋白可能的功能的基礎(chǔ)上，本發(fā)明對廈霉素A和氧廈霉素的生物合成機制進行了探討，采用PCR-targeting技術(shù)針對20個生物合成基因，進行了滅活突變(檢測引物參見表2，滅活弓丨物參見表3 )，獲得了 XM31，XM33-XM51等20個突變株。表2 :構(gòu)建突變株所需的檢測引物名稱和序列
權(quán)利要求
1.一種廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第2693 26792位的堿基序列所示。
2.權(quán)利要求I所述的廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇在制備廈霉素A及其類似物中的應用。
3.權(quán)利要求I所述的廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇在制備氧廈霉素及其類似物中的應用。
4.權(quán)利要求I所述的廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇在制備化合物indosespene及其類似物中的應用。
5.一種編碼吲哚氧化酶/乙酰CoA脫氫酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第11512 12705位堿基序列所示。
6.權(quán)利要求5所述的編碼吲哚氧化酶/乙酰CoA脫氫酶的基因編碼的吲哚氧化酶/乙酰CoA脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種廈霉素A和氧廈霉素的生物合成基因簇及其應用。該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第2693~26792位的堿基序列所示，包含18個基因，具體為負責萜類骨架合成的基因，即xiaD、xiaE、xiaF、xiaN、xiaP共5個基因；氧化還原酶基因，即xiaA、xiaB、xiaI、xiaJ、xiaK、xiaL、xiaM、xiaO共8個基因；編碼調(diào)控子和轉(zhuǎn)運子的基因，即xiaC、xiaG、xiaH、xiaQ、xiaR共5個基因。本發(fā)明所提供的包含廈霉素A和和氧廈霉素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息可以幫助人們理解廈霉素家族天然產(chǎn)物的生物合成機制，為進一步遺傳改造提供了材料和知識。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。
文檔編號C12N15/53GK102732534SQ20121014666
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者張偲, 張光濤, 張慶波, 張海波, 張長生, 朱義廣, 李慧賢, 李蘇梅, 田新朋, 鞠建華 申請人:中國科學院南海海洋研究所