專利名稱：用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種壇紫菜，尤其是涉及一種用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
壇紫菜(Porphyra haitanensis)是我國特有的暖溫帶性品種，是福建、浙江和廣 東沿海人工養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)紅藻，其產(chǎn)量約占全國紫菜總產(chǎn)量的80%。壇紫菜的自然生長期在每年的9月至次年的3月，生長的適宜溫度為15 26°C。近年來，全球氣候變暖，白露節(jié)氣過后的持續(xù)高溫和福建、浙江海域9月下旬至10月的持續(xù)高溫回暖天氣嚴(yán)重影響了壇紫菜殼孢子的采苗和幼苗的附著生長，水溫過高致使壇紫菜幼苗爛苗或成菜爛菜、減產(chǎn)，造成了不可彌補(bǔ)的損失，嚴(yán)重威脅著壇紫菜養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。因此，在生產(chǎn)上開展壇紫菜的遺傳育種研究，選育出具有明顯耐高溫性狀的優(yōu)良品系對于保證我國壇紫菜產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展已顯得十分迫切和重要。最近幾年，國內(nèi)的紫菜工作者已經(jīng)選育出多個壇紫菜耐高溫性品系，并在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，得到了廣大養(yǎng)殖戶的一致好評。但由于所選育的壇紫菜耐高溫型品系在形態(tài)上與其它壇紫菜品系沒有明顯區(qū)別，可用于鑒別的形態(tài)性狀非常有限，在生產(chǎn)上經(jīng)常造成種質(zhì)混淆，不利于壇紫菜良種的推廣和知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)給這一問題的解決帶來了契機(jī)，它直接在DNA水平上標(biāo)記檢測基因組的遺傳變異，不受發(fā)育時期和環(huán)境因素的影響，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于高等植物的種質(zhì)鑒定中。SCAR標(biāo)記是一種以常規(guī)PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、操作簡便、可以快速檢測大量個體、檢測費用低等優(yōu)點，被認(rèn)為是種質(zhì)鑒定的最佳分子標(biāo)記技術(shù)。但由于該標(biāo)記技術(shù)需要預(yù)先知道目的片段的兩端序列，并根據(jù)標(biāo)記兩端序列設(shè)計特異引物，因此現(xiàn)在一般采用對AFLP標(biāo)記和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記的英文記為random amplifed polymorphic DNA,簡稱RAPD)標(biāo)記進(jìn)行克隆、測序后轉(zhuǎn)換得到SCAR標(biāo)記的方法來開發(fā)。目前，SCAR標(biāo)記已經(jīng)在水稻、玉米等重要陸生經(jīng)濟(jì)作物中得到了廣泛的應(yīng)用。陳昌生等(陳昌生，紀(jì)德華，謝潮添，徐燕，梁艷，鄭永健，史修周，王鳳霞，趙玲敏·壇紫菜耐高溫品系選育及經(jīng)濟(jì)性狀的初步研究.海洋學(xué)報，2008，30 (5):100-106)報道了壇紫菜耐高溫品系選育及經(jīng)濟(jì)性狀的初步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確的用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的在于提供SCAR標(biāo)記用于耐高溫型品系的鑒定方法。所述用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記為標(biāo)記Z-26-600和標(biāo)記Z-26-360。
所述標(biāo)記Z-26-600的特征引物序列為正向引物5，-TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3，；反向引物5’ -TAGATTACCTTAAAGTTCGGAT-3 ’。擴(kuò)增的片段長度為530bp，PCR擴(kuò)增時退火溫度為53. 5°C。所述標(biāo)記Z-26-360的特征引物序列為
正向引物5’ -TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3，；反向引物5，-TGTTTTTTCTATTTTCAAAGCCTA-3，。擴(kuò)增的片段長度為242bp，PCR擴(kuò)增時退火溫度為54. 5°C。所述用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記的構(gòu)建方法包括以下步驟I)壇紫菜材料的收集收集葉狀體的新鮮壇紫菜，用無菌海水處理后，備用；2)總DNA提取將收集的葉狀體的新鮮壇紫菜在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取總DNA,其中，所述CTAB為Cetyltrimethylammonium Bromide的簡稱，CTAB的中文名稱為溴化十二烷基三甲基銨；3)RAPD掃描分析采用RAPD引物對步驟2)中獲得的各材料總DNA進(jìn)行標(biāo)記掃描分析，RAro 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR buffer 2. 0μ L,2. 5mM dNTP I. OyL, 10 μ M RAPD引物 I. 0μ L，25mM MgCl2L 0 μ L, 5U/μ L Taq DNA聚合酶0· 3 μ L，5ng/μ L模板DNA 2. O μ L,最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 μ L ; 4)RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測取7 μ LRAPD擴(kuò)增產(chǎn)物，加3 μ L溴酚藍(lán)后于I. 2%的瓊脂糖凝膠中電泳I. 5h后，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果，結(jié)果在引物S249的RAH)擴(kuò)增結(jié)果中找到一條大小為600bp的特異性條帶(只有耐高溫型品系中有，其它品系沒有的條帶)，命名為Z-26-600 ;在引物S250的RATO擴(kuò)增結(jié)果中同樣找到一條大小為360bp的特異性條帶，命名為Z-26-360 ；
5)特異性條帶的切膠回收、測序?qū)⒉襟E4)中獲得的兩條特異性條帶Z-26-600和Z-26-360切膠回收后進(jìn)行測序，分別獲得他們的核苷酸序列如下Z-26-600 I CCACATCGGT TAATGTTTCC TTCGGTTTAA TGGTATCATT ACTTACCGAG TCTACTTCTT61 TTTCAGGAAT AGTAAACACC TCGTTAGGTG AGATCTCAAT CACATCAACT TCAGTTTCAG121 TAGGTGTAAT GGTCTTATTA ACAGGAGGTA ATTCTTGTGA AAAACAAAAA ATGTTAATAA181 ACAATGTCAA AATTGTTATT AAAAGAATAT GTCTCTTTGT GCTATACAAC CGCTTAAATT241 CTATTTTTGT AATACTTTGG TCTAGTTTTT GACGGTTCAA ACATACATAA TATTTTTTGG301 GGAGATTTAA TTTTTGCAAA AATTTAAATG ATAAAATTGC GTTAAATAAT ATTACAATAT361 GAAAGCTAAA GTTTTAGTTT TATTAGGATT TCTTTTCATC ACATTTTTAT TGATGTCTTT421 TCAAAAAGAA GAGCGCAGCA ATAAGTTTGT GGTGGTTTTA GATGCTGGTC ATGGTGGAAA481 AGATCCTGGA AATCTTGGTA ATAATTTTAA AGAAAAAGAC ATTGCACTTA AAATAGTATT541 AGCAGTAGGT AAGGAGTTAG AGAAAAATCC GAACTTTAAG GTAATCTATA CTAGAAAAAC601 CGATGTGGZ-26-600 I ACCTCGGCAC TAAAAATATT TAATATCTCT CGTGCTACCT ACGAGAATTA TAGAGCAATC61 GTTATCCATA AGTGCGAACA ATCGTATTTT AAATGGTGTA CCAAACGATT TCCCAATCAG
121 CTCCTCTCTT CTGAGGTTGA AATCATTAAA CAGTACTTAA GTAATGAATG TTATCGTTTT181 TGGTCTAAGT CTTCAATATT TCTTATGGCT GTTAGAGATG GTAAACTAGC TTGCTCCTTA241 TCTACCTTTT ATAATTATGC TCGATTACTA GGCTTTGAAA ATAGAAAAAA CAAGCGAAAA301 TCTGATAATT ACAATGCATT AAAAACATCT AAACCCAATC AAATATGGTG TGCCGAGGT ；6) SCAR標(biāo)記引物設(shè)計根據(jù)步驟5)中獲得的兩個標(biāo)記的核苷酸序列，用Primer5. 0軟件設(shè)計SCAR標(biāo)記的引物序列為標(biāo)記Z-26-600的特征引物序列為正向引物5’-TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3 ；
反向引物5’-TAGATTACCTTAAAGITCGGAT-3’ ；標(biāo)記Z-26-360的特征引物序列為正向引物5’-TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3’ ；反向引物5’-TGTTTTTTCTATTTTCAAAGCCTA-3 ；7)SCAR標(biāo)記的驗證分別應(yīng)用所設(shè)計的兩對SCAR標(biāo)記引物對對步驟2)中獲得的各材料總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在步驟3)中，所述RAH)擴(kuò)增的反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，37°C復(fù)性50s，72°C延伸lmin,以上3步，即95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，37°C復(fù)性50s，72°C延伸lmin重復(fù)40個循環(huán)；72°C延伸IOmin0在步驟4)中，所述引物S249的序列為5’ -CCACATCGGT-3’ ；所述引物S250 的序列為5’ -ACCTCGGCAC-3’。在步驟7)中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系可為10XPCR buffer 2. 0 U L, 2. 5mMdNTP I. 0uL,10uM SCAR 正反向引物各 0. 5 y L，5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 3 y L，5ng/y L總DNA 2. Ou L,最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 y L ;所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序可為95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)復(fù)性 50s,72°C延伸 lmin,以上 3 步，即 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s, 53. 5°C(Z-26_600)或 54. 5°C(Z-26-360)復(fù)性50s，72°C延伸lmin重復(fù)30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;所述SCAR標(biāo)記可用于耐高溫型品系的鑒定；所述SCAR標(biāo)記用于耐高溫型品系的鑒定方法如下I)壇紫菜材料的收集取新鮮健康的葉狀體材料，用無菌海水處理后，備用；2)總DNA提取將收集的葉狀體材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取總DNA ；3) PCR擴(kuò)增分別以表I中的標(biāo)記Z-26-600和標(biāo)記Z-26-360所對用的引物序列分別對步驟2)中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10XPCR buffer
2.0 u L, 2. 5mMdNTP l.OuL, IOuM SCAR 正反向引物各 0. 5 y L，5U/ y LTaqDNA 聚合酶
0.3uL, 5ng/ u L總DNA2. 0 u L,最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 u L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)復(fù)性 50s，72。。延伸 lmin,以上 3 步，即 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)復(fù)性 50s，72。。延伸 lmin 重復(fù) 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測取7 ii LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加3 ii L溴酚藍(lán)后于I. 2%的瓊脂糖凝膠中電泳I. 5h后拍照記錄；5)結(jié)果判斷若在步驟4)中能分別檢測到一條長度為530bp和242bp的特異性片段，則該葉狀體材料屬于耐高溫型品系，否則就不屬于。本發(fā)明應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對紫菜材料進(jìn)行遺傳分析，獲得紫菜耐高溫型品系的特異性擴(kuò)增片段；所述特異性片段經(jīng)大量擴(kuò)增后回收、克隆、測序得到紫菜耐高溫型品系特異性擴(kuò)增片段S249-600和S250-360的堿基序列；再根據(jù)這兩個序列兩端的堿基序列合成特異引物對，經(jīng)PCR反應(yīng)程序，將所述特異性擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)換成了 SCAR標(biāo)記。本發(fā)明的SCAR標(biāo)記可以作為壇紫菜耐高溫型品系的種質(zhì)鑒定和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)的分子標(biāo)記。其紫菜種質(zhì)檢測結(jié)果穩(wěn)定，操作快捷，重復(fù)性、穩(wěn)定性高，檢測費用低，省時省力。同樣適合于把其它 類型的標(biāo)記(如AFLP，RFLP, SRAP)轉(zhuǎn)換為SCAR標(biāo)記。本發(fā)明具有如下優(yōu)點I)本發(fā)明采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)來鑒定壇紫菜的耐高溫型品系，結(jié)果更為準(zhǔn)確、
可靠；2)本發(fā)明提供的特異SCAR標(biāo)記具有檢測結(jié)果穩(wěn)定，操作快捷，重復(fù)性、穩(wěn)定性高，檢測費用低等特點；3)利用本發(fā)明所提供的高溫型壇紫菜的鑒定方法可以容易開發(fā)成試劑盒，直接用于壇紫菜高溫型材料的鑒定；4)本發(fā)明提供的SCAR標(biāo)記構(gòu)建方法同樣適合于把其它類型的標(biāo)記(如AFLP，RFLP, SRAP)轉(zhuǎn)換為SCAR標(biāo)記。在本發(fā)明中也可方便地應(yīng)用于壇紫菜耐高溫品系的鑒定。


圖I為Z-26-600標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果。M為DL2000marker ;1 4為壇紫菜耐高溫型品系；5 12為壇紫菜非耐高溫型品系。圖2為Z-26-360標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果。M為DL2000marker ;1 4為壇紫菜耐高溫型品系；5 12為壇紫菜非耐高溫型品系。
具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。所述用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記的構(gòu)建方法如下I)壇紫菜材料的收集收集壇紫菜耐高溫型和非耐高溫型品系的新鮮健康葉狀體材料，用無菌海水處理后，備用；2)總DNA提取將收集的葉狀體材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取總DNA ；3)RAPD掃描分析采用RAPD引物對步驟2)中獲得的各材料總DNA進(jìn)行標(biāo)記掃描分析，RAro 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 XPCR buffer 2. Ou L,2. 5mM dNTP l.OuL, IOuM RAPD引物 I. Oii L，25mM MgCl2L 0 u L, 5U/u L Taq DNA聚合酶0. 3 y L，5ng/y L模板DNA 2. 0 u L,最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 ii L ；RAPD擴(kuò)增的反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，37。。復(fù)性50s，72。。延伸lmin,以上3步重復(fù)40個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4) RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測取7 ii L RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物，加3 ii L溴酚藍(lán)后于I. 2%的瓊脂糖凝膠中電泳I. 5h后，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果，結(jié)果在引物S249的RAPD擴(kuò)增結(jié)果中找到一條大小為600bp的特異性條帶(只有耐高溫型品系中有，其它品系沒有的條帶)，命名為Z-26-600 ;在引物S250的RAPD擴(kuò)增結(jié)果中同樣找到一條大小為360bp的特異性條帶，命名為Z-26-360 ；所述引物S249的序列為5， -CCACATCGGT-3，；所述引物S250的序列為5， -ACCTCGGCAC-3，；5)特異性條帶的切膠回收、測序?qū)⒉襟E4)中獲得的兩條特異性條帶Z-26-600和 Z-26-360切膠回收后進(jìn)行測序，分別獲得他們的核苷酸序列如下Z-26-600 I CCACATCGGT TAATGTTTCC TTCGGTTTAA TGGTATCATT ACTTACCGAG TCTACTTCTT61 TTTCAGGAAT AGTAAACACC TCGTTAGGTG AGATCTCAAT CACATCAACT TCAGTTTCAG121 TAGGTGTAAT GGTCTTATTA ACAGGAGGTA ATTCTTGTGA AAAACAAAAA ATGTTAATAA181 ACAATGTCAA AATTGTTATT AAAAGAATAT GTCTCTTTGT GCTATACAAC CGCTTAAATT241 CTATTTTTGT AATACTTTGG TCTAGTTTTT GACGGTTCAA ACATACATAA TATTTTTTGG301 GGAGATTTAA TTTTTGCAAA AATTTAAATG ATAAAATTGC GTTAAATAAT ATTACAATAT361 GAAAGCTAAA GTTTTAGTTT TATTAGGATT TCTTTTCATC ACATTTTTAT TGATGTCTTT421 TCAAAAAGAA GAGCGCAGCA ATAAGTTTGT GGTGGTTTTA GATGCTGGTC ATGGTGGAAA481 AGATCCTGGA AATCTTGGTA ATAATTTTAA AGAAAAAGAC ATTGCACTTA AAATAGTATT541 AGCAGTAGGT AAGGAGTTAG AGAAAAATCC GAACTTTAAG GTAATCTATA CTAGAAAAAC601 CGATGTGGZ-26-600 I ACCTCGGCAC TAAAAATATT TAATATCTCT CGTGCTACCT ACGAGAATTA TAGAGCAATC61 GTTATCCATA AGTGCGAACA ATCGTATTTT AAATGGTGTA CCAAACGATT TCCCAATCAG121 CTCCTCTCTT CTGAGGTTGA AATCATTAAA CAGTACTTAA GTAATGAATG TTATCGTTTT181 TGGTCTAAGT CTTCAATATT TCTTATGGCT GTTAGAGATG GTAAACTAGC TTGCTCCTTA241 TCTACCTTTT ATAATTATGC TCGATTACTA GGCTTTGAAA ATAGAAAAAA CAAGCGAAAA301 TCTGATAATT ACAATGCATT AAAAACATCT AAACCCAATC AAATATGGTG TGCCGAGGT ；6) SCAR標(biāo)記引物設(shè)計根據(jù)步驟5)中獲得的兩個標(biāo)記的核苷酸序列，用Primer5. 0軟件設(shè)計SCAR標(biāo)記的引物序列為標(biāo)記Z-26-600的特征引物序列為正向引物5’ -TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3，；反向引物5’ -TAGATTACCTTAAAGTTCGGAT-3，；標(biāo)記Z-26-360的特征引物序列為正向引物5，-TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3，；反向引物5’ -TGTTTTTTCTATTTTCAAAGCCTA-3 ’ ；7) SCAR標(biāo)記的驗證分別應(yīng)用所設(shè)計的兩對SCAR標(biāo)記引物對對步驟2)中獲得的各材料總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 X PCR buffer 2. 0 u L, 2. 5mM dNTP1.01^，1011!^〇六1 正反向引物各0.5111，5。/111 Taq DNA 聚合酶 0. 3 y L，5ng/y L 總 DNA2.0UL,最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 ii L ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)復(fù)性 50s，72。。延伸 lmin,以上 3 步，即 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)復(fù)性50s，72°C延伸lmin重復(fù)30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)電泳檢測后，如圖I和圖2所示，由圖I和2可 以看出，兩個SCAR標(biāo)記分別在耐高溫型品系中檢測到一條長度為530bp和242bp的特異性片段，而在非耐高溫型品系中沒有檢測到片段。由此說明SCAR標(biāo)記構(gòu)建成功，可用于耐高溫型品系的鑒定。以下給出鑒定的具體步驟I)壇紫菜材料的收集取新鮮健康的葉狀體材料，用無菌海水處理后，備用。2)總DNA提取將收集的葉狀體材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取總DNA。3 ) PCR擴(kuò)增分別以標(biāo)記Z-26-600和標(biāo)記Z-26-360所對用的引物序列分別對步驟2)中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10XPCR buffer
2.0 u L, 2. 5mM dNTP I. 0 u L, 10 u M SCAR 正反向引物各 0. 5 y L，5U/ y LTaqDNA 聚合酶
0.3uL, 5ng/ u L總DNA2. 0 u L,最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 u L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)復(fù)性 50s，72。。延伸 lmin,以上 3 步，即 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)復(fù)性 50s，72。。延伸 lmin 重復(fù) 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin04)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測取7 ii LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加3 y L溴酚藍(lán)后于I. 2%的瓊脂糖凝膠中電泳I. 5h后拍照記錄。5)結(jié)果判斷若在步驟4)中能分別檢測到一條長度為530bp和242bp的特異性片段，則該葉狀體材料屬于耐高溫型品系，否則就不屬于。
權(quán)利要求
1.用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記，其特征在于為標(biāo)記Z-26-600和標(biāo)記Z-26-360。
2.如權(quán)利要求I所述的用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記，其特征在于所述標(biāo)記Z-26-600的特征引物序列為 正向引物5’ -TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3 ； 反向引物5’ -TAGATTACCTTAAAGITCGGAT-3’ ； 擴(kuò)增的片段長度為530bp，PCR擴(kuò)增時退火溫度為53. 5°C。
3.如權(quán)利要求I所述的用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記，其特征在于所述標(biāo)記Z-26-360的特征引物序列為 正向引物5’ -TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3’ ； 反向引物5’ -TGTnTTTCTAnTTCAAAGCCTA-3’。
擴(kuò)增的片段長度為242bp，PCR擴(kuò)增時退火溫度為54. 50C。
4.用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟 1)壇紫菜材料的收集收集葉狀體的新鮮壇紫菜，用無菌海水處理后，備用； 2)總DNA提取將收集的葉狀體的新鮮壇紫菜在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取總 DNA ； 3)RAPD掃描分析采用RAPD引物對步驟2)中獲得的各材料總DNA進(jìn)行標(biāo)記掃描分析，RAPD 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 XPCR buffer 2. Ou L,2. 5mM dNTP l.OuL, IOuM RAH)引物 I. 0 ii L, 25mM MgCl2L 0 u L, 5U/ u L Taq DNA 聚合酶 0. 3 y L，5ng/ u L 模板 DNA 2. 0 u L,最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 ii L ; 4)RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測取7ii LRAPD擴(kuò)增產(chǎn)物，加3 y L溴酚藍(lán)后于I. 2%的瓊脂糖凝膠中電泳I. 5h后，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果，結(jié)果在引物S249的RAH)擴(kuò)增結(jié)果中找到一條大小為600bp的特異性條帶，命名為Z-26-600 ;在引物S250的RAPD擴(kuò)增結(jié)果中同樣找到一條大小為360bp的特異性條帶，命名為Z-26-360 ； 5)特異性條帶的切膠回收、測序?qū)⒉襟E4)中獲得的兩條特異性條帶Z-26-600和Z-26-360切膠回收后進(jìn)行測序，分別獲得他們的核苷酸序列如下Z-26-600 I CCACATCGGT TAATGTTTCC TTCGGTTTAA TGGTATCATT ACTTACCGAG TCTACTTCTT.61 TTTCAGGAAT AGTAAACACCT CGTTAGGTG AGATCTCAAT CACATCAACT TCAGTTTCAG.121 TAGGTGTAAT GGTCTTATTA ACAGGAGGTA ATTCTTGTGA AAAACAAAAA ATGTTAATAA.181 ACAATGTCAA AATTGTTATT AAAAGAATAT GTCTCTTTGT GCTATACAAC CGCTTAAATT.241 CTATTTTTGT AATACTTTGG TCTAGTTTTT GACGGTTCAA ACATACATAA TATTTTTTGG . 301 GGAGATTTAA TTTTTGCAAA AATTTAAATG ATAAAATTGC GTTAAATAAT ATTACAATAT . 361 GAAAGCTAAA GTTTTAGTTT TATTAGGATT TCTTTTCATC ACATTTTTAT TGATGTCTTT . 421 TCAAAAAGAA GAGCGCAGCA ATAAGTTTGT GGTGGTTTTA GATGCTGGTC ATGGTGGAAA . 481 AGATCCTGGA AATCTTGGTA ATAATTTTAA AGAAAAAGAC ATTGCACTTA AAATAGTATT . 541 AGCAGTAGGT AAGGAGTTAG AGAAAAATCC GAACTTTAAG GTAATCTATA CTAGAAAAAC . 601 CGATGTGGZ-26-600 I ACCTCGGCAC TAAAAATATT TAATATCTCT CGTGCTACCT ACGAGAATTA TAGAGCAATC·61 GTTATCCATA AGTGCGAACA ATCGTATTTT AAATGGTGTA CCAAACGATT TCCCAATCAG·121 CTCCTCTCTT CTGAGGTTGA AATCATTAAA CAGTACTTAA GTAATGAATG TTATCGTTTT·181 TGGTCTAAGT CTTCAATATT TCTTATGGCT GTTAGAGATG GTAAACTAGC TTGCTCCTTA·241 TCTACCTTTT ATAATTATGC TCGATTACTA GGCTTTGAAA ATAGAAAAAA CAAGCGAAAA·301 TCTGATAATT ACAATGCATT AAAAACATCT AAACCCAATC AAATATGGTG TGCCGAGGT ； 6)SCAR標(biāo)記引物設(shè)計根據(jù)步驟5)中獲得的兩個標(biāo)記的核苷酸序列，用Primer 5. 0軟件設(shè)計SCAR標(biāo)記的引物序列為 標(biāo)記Z-26-600的特征引物序列為 正向引物5’ -TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3 ； 反向引物5’ -TAGATTACCTTAAAGITCGGAT-3’ ； 標(biāo)記Z-26-360的特征引物序列為 正向引物5’ -TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3’ ； 反向引物5’ -TGTTTTTTCTATTTTCAAAGCCTA-3 ； 7)SCAR標(biāo)記的驗證分別應(yīng)用所設(shè)計的兩對SCAR標(biāo)記引物對對步驟2)中獲得的各材料總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求4所述的用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟3)中，所述RAPD擴(kuò)增的反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，37°C復(fù)性·50s，72。。延伸lmin,以上3步，即95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，37。。復(fù)性50s，72。。延伸Imin重復(fù)40個循環(huán)；72°C延伸lOmin。
6.如權(quán)利要求4所述的用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟4)中，所述引物S249的序列為5’ -CCACATCGGT-3’ ； 所述引物S250的序列為5’ -ACCTCGGCAC-3’。
7.如權(quán)利要求4所述的用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟7)中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10XPCR buffer 2. O u L, 2. 5mM dNTP·1.01^，1011!^〇六1 正反向引物各0.5111，5。/111 Taq DNA 聚合酶 0. 3 y L，5ng/y L 總 DNA·2.O u L,最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 u L。
8.如權(quán)利要求4所述的用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟7)中，對于Z-26-600，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性·30s, 53. 5°C復(fù)性 50s，72°C延伸 lmin ;以上 3 步，即 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，53. 5°C復(fù)性50s，72。。延伸lmin重復(fù)30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ； 對于Z-26-360，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，54. 5°C復(fù)性50s，72。。延伸lmin ;以上3步，即95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s, 54. 5°C復(fù)性50s，·72°C延伸lmin重復(fù)30個循環(huán)；72°C延伸IOmin0
9.SCAR標(biāo)記用于耐聞溫型品系的鑒定。
10.如權(quán)利要求9所述鑒定，其特征在于其鑒定方法包括以下步驟 1)壇紫菜材料的收集取新鮮健康的葉狀體材料，用無菌海水處理后，備用； 2)總DNA提取將收集的葉狀體材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取總DNA； 3)PCR擴(kuò)增分別以表I中的標(biāo)記Z-26-600和標(biāo)記Z-26-360所對用的引物序列分別對步驟2)中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 X PCR buffer 2. 0 u L, 2. 5mM dNTP l.OuL, IOuM SCAR 正反向引物各0.51^，5~1^ Taq DNA聚合酶0. 3 y L，5ng/y L總DNA 2. Oy L，最后加無菌ddH20至反應(yīng)體系總體積為20 ii L ; PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為 對于 Z-26-600，95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，53. 5°C復(fù)性 50s，72°C延伸 lmin,以上3步，即95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s, 53. 5°C復(fù)性50s，72。。延伸lmin重復(fù)30個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；對于 Z-26-360，95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，54. 5°C復(fù)性 50s，72°C延伸 lmin,以上3步，即95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s, 54. 5°C復(fù)性50s，72。。延伸lmin重復(fù)30個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ； 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測取7ii LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加3 ii L溴酚藍(lán)后于I. 2%的瓊脂糖凝膠中電泳I. 5h后拍照記錄； 5)結(jié)果判斷若在步驟4)中能分別檢測到一條長度為530bp和242bp的特異性片段，則該葉狀體材料屬于耐高溫型品系，否則就不屬于。
全文摘要
用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記及其構(gòu)建方法，涉及一種壇紫菜。用于鑒定壇紫菜耐高溫型品系的分子標(biāo)記為Z-26-600和Z-26-360。構(gòu)建方法壇紫菜材料的收集；總DNA提取；RAPD掃描分析；RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測；特異性條帶的切膠回收、測序；SCAR標(biāo)記引物設(shè)計；SCAR標(biāo)記的驗證。所述SCAR標(biāo)記用于耐高溫型品系的鑒定方法壇紫菜材料的收集；總DNA提取；PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測；結(jié)果判斷。
文檔編號C12Q1/68GK102660646SQ20121014554
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者徐燕, 王婷, 紀(jì)德華, 謝潮添, 陳昌生 申請人:集美大學(xué)