專利名稱：一種優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶啟動(dòng)子及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸-谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，MicrobialTransglutaminase, EC2. 3. 2. 13簡(jiǎn)稱MTG)其生物學(xué)功能是直接改變蛋白質(zhì)本身以及蛋白質(zhì)所附著的細(xì)胞、組織等的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的特性，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，MTG在食品、紡織、生物制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。盡管微生物MTG已實(shí)現(xiàn)了エ業(yè)化生產(chǎn)，但依靠菌種篩選和過(guò)程優(yōu)化的傳統(tǒng)發(fā)酵技 術(shù)獲得的產(chǎn)量仍然較為有限，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)對(duì)MTG日益增長(zhǎng)的需求。隨著蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)的迅速發(fā)展，通過(guò)分子生物學(xué)的方法構(gòu)建MTG高產(chǎn)重組菌成為國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注的ー個(gè)熱點(diǎn)。為進(jìn)一歩提高產(chǎn)量，日本味之素公司率先開(kāi)展了 MTG重組菌構(gòu)建的工作。隨后，德國(guó)Martin-Luther University、臺(tái)灣食品エ業(yè)發(fā)展研究所、臺(tái)灣國(guó)立中興大學(xué)、中科院微生物研究所、華南理工大學(xué)及諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司等相關(guān)研究機(jī)構(gòu)或企業(yè)相繼報(bào)導(dǎo)了重組MTG的制備策略。至此，鏈霉菌MTG已在大腸桿菌、酵母、鏈霉菌及谷氨酸棒桿菌等宿主中成功表達(dá)。由于MTG以酶源形式分泌到胞外，在胞外需經(jīng)活化蛋白酶活化成有活性MTG0大腸桿菌，酵母等表達(dá)宿主，不能夠合成活化蛋白酶，MTG表達(dá)后需外加活化蛋白酶。而鏈霉菌宿主自身就可以分泌改類活化蛋白酶，可以直接獲得有活性的MTG，因此鏈霉菌可以作為MTG表達(dá)的理想宿主。在表達(dá)系統(tǒng)中，啟動(dòng)子強(qiáng)度對(duì)蛋白的表達(dá)量影響很大。在鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)中，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，啟動(dòng)子比較少，而且通用性低，不適合MTG的表達(dá)。因此有必要開(kāi)發(fā)新的啟動(dòng)子。很多文獻(xiàn)表明，MTG自身啟動(dòng)子可以用于MTG的異源表達(dá)，因此MTG自身啟動(dòng)子可以作為一個(gè)高效表達(dá)啟動(dòng)子用于蛋白表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問(wèn)題，我們對(duì)MTG自身啟動(dòng)子進(jìn)行了研究，通過(guò)逐段缺失，確定了啟動(dòng)子的核心區(qū)域和調(diào)控序列。在前期研究中，本研究室篩選出一株新的產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062),通過(guò)基因克隆方法,得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的啟動(dòng)子和終止子(Genebank:EU477523)。利用PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)引物，上游引物TCU-F :TTCGAGCTCGGTACCCACCCCGCTGAATGGGACTCTTCGT (Kpn I)，下游引物 TCU-R:CGCGGATCCGGAATTCCATATGCGTCGCCGGTCATGACCTGGTG,獲得上游序列(tgU)，通過(guò)對(duì)基因 tgU 上下游的逐段缺失，確定了 MTG啟動(dòng)子核心序列及調(diào)控序列，并將優(yōu)化后的啟動(dòng)子序列用于MTG的表達(dá)，產(chǎn)量得到顯著提高，因此，MTG啟動(dòng)子可以被鏈霉菌工程菌識(shí)別并啟動(dòng)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明所用到的培養(yǎng)基
YEME培養(yǎng)基葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、麥芽提取物3g/L、酵母粉3g/L、蔗糖340g/L、MgCl2 6H20 5mmoL/L、甘氛酸 5g/L ；MS 培養(yǎng)基甘露醇 20g/L、黃豆粉 20g/L、瓊脂粉 20g/L，pH7. 2-7. 3 ；R5 培養(yǎng)基蔗糖 103g/L、K2SO4 0. 25g/L、MgCl2 6H20 10. 12g/L、葡萄糖 10g/L、Difco酪蛋白氨基酸0. Ig/L、0xoid酵母提取物5g/L、TES 5. 73g/L。稱取5. 5g Difco瓊脂放入500mL三角瓶中，倒入250mL上述溶液，115° C滅菌15min。使用時(shí)，將培養(yǎng)基融化，每瓶中加入=KH2PO4 (0. 5%) 2. 5mL、CaCl2 2H20(5mol/l) ImL,
L-脯氨酸(20%) 3. 75mL、NaOH (ImoI/L) 2. 5mL ；斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖4g/L、麥芽粉(Difco) 3g/L、酵母粉4g/L、瓊脂粉20g/L, pH 7. 0 ；S. hygroscopicus 種子培養(yǎng)基(SM):酵母粉 5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、MgSO4 7H20 2g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO4 2g/L ；pH 7. 0 ；S. hygroscopicus 發(fā)酵培養(yǎng)基(FM):酵母粉 5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、大豆粉 15g/L、K2HPO4 4g/L、MgSO4 7H20 2g/L、CaCO3 5g/L ；pH 7. 4 ；LB 培養(yǎng)基胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7. 0 ；本發(fā)明中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力的測(cè)定比色法測(cè)定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY為作用底物，L-谷氨酸-、單羥胺酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。I個(gè)單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶活定義為37° C時(shí)每分鐘催化形成Iymol L-谷氨酸-Y單羥胺酸的酶量(U/mL)。試劑A :IOOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL 0. 2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入
0.2mol/L pH6. 0 的 Tris-HC 緩沖液 4mL，0. lmol/L 羥胺 2mL，0. Olmol/L 的還原型谷胱甘肽2mL,并調(diào)節(jié)pH至6. O。試劑B :3mol/L 的 HCL，12%TCA，5%FeCL3 按 I I I 混合。配制0-4 u mol/mL的L-谷氨酸-Y -單異羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取ImL試劑A與0. 4mL不同濃度的L-谷氨酸-Y-單異羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，37° C水浴10分鐘。加0. 4mL試劑B終止反應(yīng)，在525nm比色，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以0. 4mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下保溫和比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出酶活。以100° C加熱10分鐘的離心后的上清液為空白。酶活力(u/mL) = (6.8548X0D525-0.0164) X稀釋倍數(shù)應(yīng)用本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可使MTG產(chǎn)量達(dá)到4U/mL，提高了 I倍。


圖IS. hygroscopicus TGase啟動(dòng)子上游序列缺失分析圖2S. hygroscopicus TGase啟動(dòng)子下游序列缺失分析圖3啟動(dòng)子優(yōu)化前后發(fā)酵上清酶
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :MTG啟動(dòng)子上游缺失采用末端基因缺失的方法分析TGase天然啟動(dòng)子的有效序列將5’端部分缺失的MTG基因克隆至pIJ86并轉(zhuǎn)化S. Iividans TK24進(jìn)行TGase表達(dá)驗(yàn)證。如圖I所示，tgl共包含TGase開(kāi)放閱讀框上游基因893bp，以完整tgl表達(dá)的TGase活力為對(duì)照(100%)，當(dāng)tgl 5’端缺失300bp時(shí)，發(fā)酵所得TGase活力下降到57. 9% ；tgl 5’端缺失400bp時(shí)，其對(duì)應(yīng)重組菌發(fā)酵液的已檢測(cè)不到TGase活性。上述結(jié)果表明，TGase啟動(dòng)子的上游位于_593bp和-493bp之間
實(shí)施例2 =MTG啟動(dòng)子下游缺失確定了 TGase啟動(dòng)子上邊界之后，采用基因缺失的方法確定其下邊界。從ATG上游_98bp (核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游)處向上游每隔50bp缺失。以pIJ86/tgl為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增分別得到3’端部分缺失的TGase啟動(dòng)子片段、帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的TGase前體基因及TGase轉(zhuǎn)錄終止子；將上述PCR產(chǎn)物依次克隆至pIJ86，得到表達(dá)載體編碼3’端部分缺失的TGase啟動(dòng)子片段。如圖2所示，以完整tgl表達(dá)的TGase活力為對(duì)照(100%)，基因缺失至_148bp處時(shí)，TGase活力水平降低至82% ;基因進(jìn)ー步缺失至_198bp時(shí)，TGase活力水平達(dá)到達(dá)對(duì)照條件下的119%;后續(xù)的基因缺失導(dǎo)致TGase活力水平持續(xù)下降，缺失至-498bp時(shí),剩余的上游序列不再具有啟動(dòng)子活性。結(jié)合TGase啟動(dòng)子上下游啟動(dòng)子基因缺失的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，位于TGase開(kāi)放閱讀框上游_593bp與_148bp之間的序列為
S.hygroscopicus TGase啟動(dòng)子區(qū)域；位于_148與-198之間的片段可能是該啟動(dòng)子的調(diào)控區(qū)域?qū)嵤├? :用優(yōu)化后的MTG啟動(dòng)子表達(dá)MTG由實(shí)施例I和2得到的TGase優(yōu)化后的啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO. I所示，利用優(yōu)化后的啟動(dòng)子表達(dá)TGase。將構(gòu)建好的工程菌轉(zhuǎn)化鏈霉菌原生質(zhì)體，具體步驟如下(I)在250mL三角瓶中加入50mL的YEME，接種100 u L的孢子懸液，于30°C搖床中培養(yǎng)36 40h。(2)將培養(yǎng)物倒入離心管中，3500r/min離心lOmin。(3)棄上清,將菌絲體懸浮于15mL的10. 3%的鹿糖溶液中，3500r/min離心IOmin,
棄上清。同此法洗兩次。(4)取ImL菌絲體，加入4mL的溶菌酶溶液(溶菌酶母液為50mg/mL P Buffer,終濃度為2mg/mL,用P Buffer稀釋),于30°C水浴30 60min(間_ 5min輕輕搖動(dòng))至上清呈乳狀。(5)加入5mL的P Buffer并用5mL的吸管吹吸幾次,繼續(xù)溫浴lOmin。(6)用裝有脫脂棉的試管過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入無(wú)菌干凈的離心管中，3500r/min離心7min,原生質(zhì)體沉淀呈黃色。(7)棄上清，輕柔打散原生質(zhì)體，用P Buffer洗兩次(洗去溶菌酶)。每次仍使用3500r/min 離心 7min。(8)棄上清，用槍頭將原生質(zhì)體打散，分裝，于_70°C保存。(9)將最多5 ii L的DNA (質(zhì)?；蛎高B產(chǎn)物)加于已經(jīng)裝有50 ii L原生質(zhì)體的離心管(I. 5mL)的管壁上(不與原生質(zhì)體接觸)。 (10)吸取200 ii L的25%PEG4000，將DNA沖入原生質(zhì)體中，小心抽吸幾次，混勻。(11)將混合物涂布于R5平板上(不含任何抗生素)。(12)30°C培養(yǎng)14 20h后，用含有適當(dāng)抗生素的ImL無(wú)菌水溶液覆蓋。
(13)再培養(yǎng)f 2d后，即可看到小的轉(zhuǎn)化子菌落長(zhǎng)出。將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體培養(yǎng)，種子培養(yǎng)接一鏟生長(zhǎng)良好的斜面培養(yǎng)物(也可以直接接種孢子懸液)至裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中培養(yǎng)，搖瓶轉(zhuǎn)速為200r/min，溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間24h。搖瓶培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子按8%的接種量接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)溫度30°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，500mL三角瓶裝液量為50mL，培養(yǎng)時(shí)間42_72h。各 培養(yǎng)基使用前添加阿泊拉霉素至終濃度為50y g/mL。如圖3所示，MTG產(chǎn)量達(dá)到4U/mL，提高了 I倍。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶啟動(dòng)子，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.包含權(quán)利要求I所述啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體。
3.包含權(quán)利要求I所述啟動(dòng)子的細(xì)胞系或基因工程菌。
4.權(quán)利要求I所述的啟動(dòng)子應(yīng)用于生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種優(yōu)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶啟動(dòng)子，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。應(yīng)用本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可使MTG產(chǎn)量達(dá)到4U/mL，提高了1倍。通過(guò)本發(fā)明提供的啟動(dòng)子及發(fā)酵方法，實(shí)現(xiàn)了MTG在S.lividan TK24中高效率分泌性表達(dá)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102643820SQ201210145188
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者劉松, 堵國(guó)成, 張東旭, 陳堅(jiān), 陳康康, 馬建龍 申請(qǐng)人:江南大學(xué)