預(yù)測乳腺癌復(fù)發(fā)的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年9月11日提交的美國臨時申請No.61/876,757的權(quán)益，并且在 此通過參引方式將其全部引入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開內(nèi)容設(shè)及具有乳腺癌復(fù)發(fā)臨床相關(guān)性的基因表達(dá)圖譜或者模式的鑒定和 使用。特別是，本公開內(nèi)容提供了用于確定使用抗乳腺癌療法例如輔藥它莫昔芬或者芳香 化酶抑制劑進(jìn)行的初始治療后癌癥復(fù)發(fā)的可能性的分析。
【背景技術(shù)】
[0004] 雌性激素受體陽性乳腺癌是一種具有長期復(fù)發(fā)風(fēng)險的疾病。在5年的輔藥它莫昔 芬后，患者被診斷具有疾病復(fù)發(fā)和死亡的持續(xù)風(fēng)險至少15年。來自輔藥芳香化酶抑制劑包 括阿那曲挫、它莫昔芬的單獨(dú)的關(guān)鍵性預(yù)先試驗或者與組合(ATAC)試驗W及乳腺國際組織 (BIGH-98研究(Cuzick等，2010)的長期追蹤顯示，在初始治療后每年有約2%的連續(xù)復(fù)發(fā) 比例，且在輔藥內(nèi)分泌療法5年后超過所有復(fù)發(fā)的一半。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了對擴(kuò)展輔藥療法W 及能夠指導(dǎo)治療決策過程的生物標(biāo)記物的需要。
[0005] 在過去10年所研究的用于估測雌性激素陽性乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險的多基因表達(dá)簽 名主要依賴于增殖相關(guān)基因表達(dá)的定量測量。運(yùn)些多基因簽名包括21-基因復(fù)發(fā)打分 (Oncotype DX;Genomic Health,Redwood City,CA,USA)是遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的強(qiáng)的預(yù)測因子，但是 它們的預(yù)后能力在估測從診斷開始超過5年的風(fēng)險減弱（Sgroi等，2012)。相反，后期復(fù)發(fā)的 預(yù)測因子沒有得到很好的表征，并且不同的機(jī)制可能與前期和后期復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián)。需要生物 標(biāo)記物來鑒定采用僅5年的內(nèi)分泌療法就已經(jīng)得到充分治療的患者，并且反過來鑒定后期 復(fù)發(fā)風(fēng)險增加的可能需要擴(kuò)展的輔藥內(nèi)分泌或者其他療法的那些患者。
[0006] W前的工作發(fā)展并且確認(rèn)了乳腺癌指數(shù)(BCI)分析法，該分析法由兩個獨(dú)立發(fā)展 的基因表達(dá)生物標(biāo)記物集組成:分子等級指數(shù)(MGI)和H0XB13/IL17BRdMGI，一種涵蓋腫瘤 等級和增殖的五基因預(yù)測因子，在患有雌性激素陽性乳腺癌的患者中具有高度的預(yù)后能 力。H0XB13/IL17BR是獨(dú)立發(fā)展的腫瘤等級或增殖，對前期和后期遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)具有預(yù)后能力， 并且在患有前期雌性激素陽性乳腺癌的患者中具有對擴(kuò)展的輔藥芳香化酶抑制劑的益處 具有預(yù)測能力。所述BCI和21-基因復(fù)發(fā)打分分析法運(yùn)兩者都通過定量實時PCR測量基因表 達(dá)，不過它們在其所檢測的基因上存在差異。IHC4是測量如下四種信息最豐富的免疫組織 化學(xué)生物標(biāo)記物的蛋白表達(dá)的另一種預(yù)后模型：雌性激素受體、孕酬受體、HER2和Ki-67 (化sick等，2011)，它們當(dāng)中沒有一個是由BCI分析法中的基因所編碼。BCI還沒有在患有雌 性激素陰性或者=重陰性乳腺癌的患者中用來估測過。參見美國專利7，930，105和7，504， 214,美國專利公報 2011/0136680 和 2013/0281502 W 及 PCT 專利公報 W0/2012/079059。
[0007] 因此，用于針對患有雌性激素陽性乳腺癌的患者的后期復(fù)發(fā)W改善擴(kuò)展輔藥內(nèi)分 泌療法的生物標(biāo)記物顯然是需要的。本發(fā)明滿足了運(yùn)種需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本公開內(nèi)容部分地基于如下發(fā)現(xiàn)：（a)在BCI分析中可W有效地利用兩類別方案 (高度風(fēng)險、低度風(fēng)險）W避免現(xiàn)有技術(shù)中中度風(fēng)險分類的不確定性；（b)對于復(fù)發(fā)風(fēng)險，線 性BCI模型(BCI-L)比立方體模型(BCI-C)具有優(yōu)越的預(yù)后能力；W及(C)上述發(fā)現(xiàn)能夠更簡 單且更精確地應(yīng)用BCI來提供能夠用于選擇治療選項的預(yù)后信息例如癌癥復(fù)發(fā)W及預(yù)測信 息如對某些療法的反應(yīng)。
[0009] 本文提供了確定受乳腺癌困擾的受試者中的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險的方法。所述方法包 括：（a)確定來自所述受試者的ER+乳腺癌細(xì)胞的樣品中的多個基因的mRNA表達(dá)水平；W及 (b)根據(jù)在診斷乳腺癌疾病時所述多個基因的所述mRNA表達(dá)水平的分析，對所述受試者是 否具有低度的或者高度的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險進(jìn)行分類。在該方法中，所述多個基因的分析提供 了在接受約5年的輔藥療法后的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險，所述癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險在比較具有超過5年的結(jié) 果或者其代表性樣品的回溯性(retrospective化R+乳腺癌患者數(shù)據(jù)集時在低度風(fēng)險組中 為小于約5%。在很多實施方式中，所述受試者已經(jīng)接受約5年的輔藥療法并且在該療法后 是沒有疾病的。
[0010] 因此，在一些實施方式中，本發(fā)明設(shè)及確定受乳腺癌困擾的受試者中的癌癥復(fù)發(fā) 風(fēng)險的方法。所述方法包括：
[00川確定來自所述受試者的邸+乳腺癌細(xì)胞的樣品中的HoxB13、IL17BR、BublB、CENPA、 肥K2、RACGAP1、和RRM2的mRNA表達(dá)水平；
[0012] 對所述表達(dá)水平進(jìn)行求和，從而形成乳腺癌指數(shù)(BCI)值，其中，較高的BCI值與較 高的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，而較低的BCI值與較低的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)聯(lián);W及
[0013] 根據(jù)BCI值，將樣品分類為指示在所述患者中具有低度的或者高度的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng) 險而沒有中度風(fēng)險類別。
[0014] 在其他一些實施方式中，本發(fā)明設(shè)及確定對受乳腺癌困擾的受試者的治療的反應(yīng) 的方法。所述方法包括：
[001引確定來自所述受試者的邸+乳腺癌細(xì)胞的樣品中的H0xB13、IL17BR、BublB、CENPA、 肥K2、RACGAP1、和RRM2的mRNA表達(dá)水平；
[0016] 對所述表達(dá)水平進(jìn)行求和，從而形成乳腺癌指數(shù)(BCI)值，其中，較低的BCI值與使 用芳香化酶抑制劑、祀向療法或者內(nèi)分泌療法進(jìn)行五年W下的初始治療后對使用芳香化 酶、祀向療法或者內(nèi)分泌療法進(jìn)行的額外治療的反應(yīng)相關(guān)聯(lián);W及
[0017] 根據(jù)BCI值，將樣品分類為指示具有所述反應(yīng)或者缺乏所述反應(yīng)。
[0018] 另外，本發(fā)明還設(shè)及治療受乳腺癌困擾的受試者的方法。所述方法包括：
[0019] 確定來自所述受試者的邸+乳腺癌細(xì)胞的樣品中的HoxB13、IL17BR、BublB、CENPA、 肥K2、RACGAP1、和RRM2的mRNA表達(dá)水平；
[0020] 對所述表達(dá)水平進(jìn)行求和，從而形成乳腺癌指數(shù)(BCI)值，其中，較低的BCI值與 (a)使用芳香化酶抑制劑、祀向療法或者內(nèi)分泌療法進(jìn)行五年W下的初始治療后對使用芳 香化酶、祀向療法或者內(nèi)分泌療法進(jìn)行的額外治療的反應(yīng)和(b)較低的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān) 聯(lián)；W及
[0021] 根據(jù)針對該受試者的BCI值確定結(jié)果，治療該受試者。
【附圖說明】
[0022] 圖1是針對本文所述的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(consod)的ATAC CONSORT圖。
[0023] 圖2是顯示基于針對所有ER+N0患者中的總共10年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的BCI-C和BCI-L的預(yù) 定風(fēng)險組的效能的圖。圖A-BCI-C;圖B-BCI-L。
[0024] 圖3是顯示作為邸+NO患者中的連續(xù)BCI-線性指數(shù)的因變量的總共10年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā) 風(fēng)險的圖。
[00巧]圖4A和4B是顯示基于針對所有ER+N0肥R2陰性患者中的總共10年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的BCI-C和BCI-L模型的預(yù)定風(fēng)險組的效能的圖。圖A)BCI-C;圖4B)BCI-L。
[0026] 圖5A和5B是顯示針對邸+NO患者中的前期和后期遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的BCI預(yù)定風(fēng)險組的效 能的圖。5A)前期0至5年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā);5B)后期5至10年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)。群體PI是指預(yù)定低度的和中 度的風(fēng)險組而P2是指前期復(fù)發(fā)風(fēng)險組。P3是指預(yù)定的低度風(fēng)險組，而P4是指針對后期復(fù)發(fā) 的中度和高度風(fēng)險組。
[0027] 圖6A和6B是顯示作為邸+NO患者中的連續(xù)BCI指數(shù)的因變量的前期和后期遠(yuǎn)處復(fù) 發(fā)風(fēng)險的圖。6A)前期0至5年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險;6B)后期5至10年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險。豎直線條描繪 了低度、中度（中間）和高度預(yù)定BCI風(fēng)險組之間的邊界。
[002引圖7是顯示針對邸+NO肥R2陰性患者的前期和后期遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的BCI預(yù)定風(fēng)險組的效 能的圖。圖A-前期(0至5年)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā);B)后期(5至10年)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險。
[0029] 圖8是顯示作為邸+NO肥R2陰性患者中的BCI指數(shù)的因變量的前期(0至5年)和后期 (5至10年)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險的圖。圖A-前期遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險；圖B-后期遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險。
[0030] 圖9是顯示針對NR+N0患者(組合的兩臂和獨(dú)立的阿那曲挫(ANA)和它莫昔芬(TAM) 臂）中的總共10年遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的IHC4的事后分析確定類別風(fēng)險組和BCI和RS的預(yù)定風(fēng)險組的 效能的圖。圖A-組合的兩臂；圖B-組合的兩臂中的RS;圖C-組合的兩臂中的IHC4;圖D-單獨(dú) 的阿那曲挫臂的BCI;圖E-單獨(dú)的阿那曲挫臂的RS;圖F-單獨(dú)的阿那曲挫臂的IHC4;圖G-單 獨(dú)的它莫昔芬臂的BCI;圖H-單獨(dú)的它莫昔芬臂的RS;圖I-單獨(dú)的它莫昔芬臂的IHC4。
[0031] 圖10是顯示針對ER+結(jié)節(jié)陽性患者中的總共10年的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的預(yù)定風(fēng)險組的效能 的圖。
【具體實施方式】
[0032] 本文使用的單數(shù)形式"一個"、"一種"和"所述"擬指也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文 另有明確說明。另外，"或者"的使用擬指包括"和/或"，除非上下文另有明確說明。
[0033] 室義
[0034] i胃表達(dá)"模式"或者"圖譜"或者"簽名"是指兩個或者多個臨床結(jié)果、癌癥結(jié)果、 癌癥復(fù)發(fā)和/或存活結(jié)果之間的一種或者多種基因的相對表達(dá)，其與區(qū)分所述結(jié)果的能力 相關(guān)聯(lián)。在一些情況中，所述結(jié)果是乳腺癌的結(jié)果。
[0035] "基因"是編碼離散產(chǎn)物(不管性質(zhì)上是RNA還是蛋白）的多核巧酸。應(yīng)當(dāng)理解的是， 多于一種多核巧酸可W能夠編碼離散的產(chǎn)物。該術(shù)語包括編碼相同產(chǎn)物及其根據(jù)染色體定 位和正常有絲分裂過程中重組的能力為功能相關(guān)(包括功能的獲得、失去或調(diào)節(jié)）的基因的 等位基因和多態(tài)性。
[0036] 術(shù)語"相關(guān)聯(lián)"或"相關(guān)"或者其等同措辭是指通過使用本文所述的方法鑒定的一 個或者多個基因的表達(dá)和細(xì)胞的生理學(xué)狀態(tài)(排除一種或者多種其他狀態(tài))之間的相關(guān)性。 基因可W W較高水平或者較低水平表達(dá)，但是仍然與一種或者多種癌癥狀態(tài)或者結(jié)果相關(guān) 聯(lián)。
[0037] "多核巧酸"是具有任意長度的核巧酸(不管是核糖核巧酸還是多氧核糖核巧酸） 的聚合物形式。運(yùn)個術(shù)語僅指分子的初級結(jié)構(gòu)。因此，運(yùn)個術(shù)語包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。 它還包括已知類型的改變形式，包括本領(lǐng)域已知的標(biāo)簽、甲基化、"帽"、使用類似物對一種 或者多種天然存在的核巧酸進(jìn)行的取代、和核巧酸內(nèi)部的修飾例如無電荷連接(例如硫代 憐酸、二硫代憐酸等）W及多核巧酸的無修飾形式。
[0038] 術(shù)語"擴(kuò)增"W廣泛的含義使用，是指形成擴(kuò)增產(chǎn)物可W通過采用DNA或者RNA聚合 酶W酶法例如使用本領(lǐng)域已知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實現(xiàn)。本文使用的"擴(kuò)增"一般是指 生成所需序列尤其是樣品的那些的多個拷貝的過程。"多個拷貝"是指至少兩個拷貝。"拷 貝"不一定是指與模板序列的互補(bǔ)或者等同的完美序列。
[0039] 對應(yīng)是指核酸分子與另一個核酸分子共有實質(zhì)量的序列同一性。實質(zhì)量是指至少 95%、一般至少98 % W及更一般為至少99 %，并且序列同一性使用如Altschul等， J. Mol. Biol. 215 :403-410( 1990)(使用公開的缺省設(shè)定，即參數(shù)w = 4，t = 17)中所述的 BLAST算法確定。用于擴(kuò)增mRNA的方法通常在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) W及美國專利6,794,141中描述的那些方法?？蒞使用的另一種方法是定量PCR(或者 Q-PCR)。作為選擇，RNA可W通過本領(lǐng)域已知的方法直接標(biāo)記為對應(yīng)的cDNA。
[0040] "微陣列"是形成在固體支持物例如但不限于玻璃、塑料或者合成膜上的優(yōu)選具有 離散區(qū)域(各個具有所限定的面積)的線性或者二維陣列。微陣列上的離散區(qū)域的密度通過 擬在單個固相支持物的表面上進(jìn)行檢測的固定多核巧酸的總數(shù)來確定，優(yōu)選為至少約50/ cm 2、更優(yōu)選為至少約100/cm2、甚至更優(yōu)選為至少約500/cm2,但是優(yōu)選為小于約l，000/cm 2。 優(yōu)選的是所述陣列包含總共為至少約500、約1000、約1500、約2000、約2500、或者約3000的 固定多核巧酸。本文使用的DNA微陣列是布置在忍片或者其他表面上用于雜交來自樣品的 擴(kuò)增或者克隆的多核巧酸的低聚核巧酸或多核巧酸的陣列。由于陣列中的每一個特定的引 物組的位置是已知的，因此樣品多核巧酸的身份可W根據(jù)它們與微陣列中的特定位置的結(jié) 合來確定。
[0041] 因為所公開內(nèi)容依賴于對過表達(dá)或者低表達(dá)的基因的鑒定，所W所公開內(nèi)容的一 個實施方式設(shè)及通過樣品細(xì)胞的mRNA或者其擴(kuò)增本或克隆本與對于特定的基因序列而言 是唯一的多核巧酸的雜交來確定表達(dá)。優(yōu)選的運(yùn)種類型的多核巧酸包含基因序列的在其他 基因序列中沒有發(fā)現(xiàn)的至少約20、至少約22、至少約24、至少約26、至少約28、至少約30、或 者至少約32個連續(xù)的堿基對。在前個句子中使用的術(shù)語"約"是指所述數(shù)值增加1或者減去 1。甚至更優(yōu)選的是一個基因序列的在其他基因序列中沒有發(fā)現(xiàn)的至少或約50、至少或約 100、至少或約150、至少或約200、至少或約250、至少或約300、至少或約350、或者至少或約 400個堿基對。在前個句子中使用的術(shù)語"約"是指所述數(shù)值增加或者減少10%。運(yùn)些多核巧 酸還指能夠與本文所述的基因的序列或者其獨(dú)特部分雜交的多核巧酸探針。優(yōu)選的是，所 述序列是由所述基因編碼的mRNA的那些序列，與運(yùn)些mRNA對應(yīng)的CDNA和/或運(yùn)些序列的擴(kuò) 增本。在所公開內(nèi)容的一些優(yōu)選的實施方式中，所述多核巧酸探針被固定在定位該探針的 陣列、其他裝置或者單個點上。
[0042] 在所公開內(nèi)容的另一個實施方式中，所公開的序列的所有或者一部分可W通過諸 如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或者其變化方式例如但不限于定量PCR(Q-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和實時PCR(可選為實時RT-PCR)等方法進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。運(yùn)些方法將利用能夠與所公 開的序列的部分互補(bǔ)的一個或者兩個引物，其中所述引物被用來引導(dǎo)核酸的合成。新合成 的核酸可選地進(jìn)行標(biāo)記并且可W被直接檢測或者通過所公開內(nèi)容的多核巧酸的雜交進(jìn)行 檢測