本發(fā)明屬于育種技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種基于苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)及usw47標(biāo)記篩選小麥籽粒鎘高低積累品種的方法。

背景技術(shù)：

鎘(cd)是自然界中毒性最大的重金屬元素之一，其遷移性強(qiáng)、毒性大、極易被作物吸收和累積，通過食物鏈最終富集在人體，嚴(yán)重影響人類健康。2014年環(huán)境保護(hù)部和國土資源部公布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，土壤環(huán)境總體不容樂觀，鎘源污染物位點超標(biāo)率達(dá)7％，鎘污染耕地面積超過20萬hm²，由重金屬污染造成直接危害包括全國年均糧食減產(chǎn)1000萬噸以上，經(jīng)濟(jì)損失超200億元(胡鵬杰，李柱，鐘道旭，等.我國土壤重金屬污染植物吸取修復(fù)研究進(jìn)展[j].植物生理學(xué)報，2014(5)：577-584.)。鎘對人體腎、肺、肝、睪丸、腦、骨骼及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒性，其在體內(nèi)的生物半衰期長達(dá)10-30年，為已知的最易在體內(nèi)蓄積的毒物(劉毅.鎘的危害及其研究進(jìn)展(綜述)[j].中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2003(4):12-13.)。通過篩選小麥鎘高低積累品種，發(fā)掘籽粒鎘含量低的種質(zhì)資源，是解決鎘危害的一種經(jīng)濟(jì)有效的措施。

同時小麥?zhǔn)侵袊诙蠹Z食作物，在我國的糧食安全中占有重要地位。小麥作為鎘中積累型作物，其籽粒鎘含量要高于水稻、玉米等糧食作物(邢維芹，張紅毅，scheckelkg，等.鉛冶煉污染區(qū)小麥籽粒鎘含量及低積累品種篩選[j].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2015(10)：2039-2040.)。鑒于不同基因型小麥籽粒鎘含量存在顯著差異，故篩選鎘高低積累品種具有必要性及可行性。

已知的小麥鎘高低積累品種的篩選方法有傳統(tǒng)篩選法、模型預(yù)測法等。傳統(tǒng)篩選法通過全生育培養(yǎng)并測定小麥成熟期籽粒的鎘含量，利用統(tǒng)計分析方法篩選小麥籽粒鎘高、低積累品種。傳統(tǒng)分析方法篩選小麥籽粒鎘高低積累品種的優(yōu)點在于其準(zhǔn)確性與真實性，真實反應(yīng)小麥自然生長環(huán)境下對鎘的累積能力，因此其他篩選方法的開發(fā)均需要建立在傳統(tǒng)分析測試的基礎(chǔ)上進(jìn)行。但傳統(tǒng)分析測試方法的缺點也非常明顯，首先小麥正常生育期很長，其次小麥籽粒鎘含量受土壤鎘濃度、ph值、施肥習(xí)慣等多因素影響，通常需要多年多點試驗方可確定鎘高低積累品種。也有相關(guān)研究者通過苗期指標(biāo)、土壤ph等數(shù)據(jù)建立相關(guān)數(shù)學(xué)模型，快速預(yù)測籽粒鎘含量，但由于小麥全生育期不同部位鎘含量的分布均會對最終籽粒鎘含量造成影響，某些苗期鎘累積能力強(qiáng)的品種成熟期籽粒鎘含量反而不高，因此這種方法也存在一定不確定性。

分子標(biāo)記作為一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域的研究，而將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于篩選鎘高低積累的作物品種是一種比較新穎且可行的方法。通過發(fā)掘與作物cd積累相關(guān)的基因，并建立相關(guān)的分子標(biāo)記，可以將其作為快速篩選作物cd低積累品種的一種輔助手段。若是采用常規(guī)種質(zhì)資源篩選手段，土壤鎘濃度的變差引起的籽粒鎘濃度差異，因此很難有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鎘高低積累品種的篩選，而利用分子標(biāo)記進(jìn)行小麥鎘高低積累品種篩選理論上可以避免這一現(xiàn)象。

wiebe等(2010)在cdu1(反映小麥鎘富集能力的主效基因)的基礎(chǔ)上開發(fā)了一個與作物鎘吸收性狀基因變異共分離的est衍生標(biāo)記(xbf474090)，該標(biāo)記已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)化為一個共顯性caps標(biāo)記(基于pcr)，并被定名為usw47(wiebek,harrisns,farisjdetal.targetedmappingofcdu1,amajorlocusregulatinggraincadmiumconcentrationindurumwheat(triticumturgiduml.vardurum)[j].theoreticalandappliedgenetics,2010,121(6):1047-1105.)。前人對這該標(biāo)記有了一定的研究，但試驗的小麥品種還是局限于典型的鎘高、低積累品種，而未涉及大量未知小麥種質(zhì)資源的篩選。本發(fā)明試驗中當(dāng)大量鎘高、中、低積累型小麥品種共存時，usw47標(biāo)記的有效性就大大降低，遠(yuǎn)無法達(dá)到篩選小麥籽粒鎘高低積累品種的要求。

本發(fā)明利用苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)與usw47標(biāo)記相結(jié)合的方式，來篩選小麥籽粒鎘高低積累品種，最大化地消除單獨(dú)利用以上兩種方式篩選的不足。在提升篩選效率的同時提高了小麥籽粒鎘高低積累品種篩選的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、快速、適用性廣及可操作性強(qiáng)的篩選小麥籽粒鎘高低積累品種的方法，該方法進(jìn)一步提高了分子標(biāo)記usw47的有效性，通過苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)+分子標(biāo)記的兩步法進(jìn)行，相比以往小麥鎘高低積累種質(zhì)篩選方法顯著提升了小麥籽粒鎘高低積累品種篩選的準(zhǔn)確性。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

一種基于苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)及usw47標(biāo)記篩選小麥籽粒鎘高低積累品種的方法，包括如下步驟：

(1)收集100種以上不同品種的小麥。

(2)選取鎘濃度1.0±0.2mg/kg的土壤進(jìn)行小麥苗期培養(yǎng)。

(3)出苗15-20天，采集小麥幼葉葉片樣品提取dna。

(4)利用usw47標(biāo)記檢測不同小麥品種的dna：以所提取dna為模板，使用引物f：5’-gctaggacttgattcattgat-3’、r：5’-agtgatctaaacgttcttata-3’進(jìn)行pcr擴(kuò)增；pcr產(chǎn)物經(jīng)hpy188ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(5)小麥苗期鎘含量獲取

1)獲取鎘脅迫下小麥苗期地上部樣品；小麥苗期優(yōu)選三葉期；

2)收獲的樣品洗凈、烘干、粉碎后測定鎘含量。

(6)苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)(0-1標(biāo)準(zhǔn)化)的獲得

根據(jù)如下公式計算苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)(0-1標(biāo)準(zhǔn)化)：

x標(biāo)準(zhǔn)值＝(x1-xmin)/(xmax-xmin)；

式中，x標(biāo)準(zhǔn)值為0-1標(biāo)準(zhǔn)化后的苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)，x1為計算所得的苗期地上部鎘富集系數(shù)，xmin為所有小麥品種中苗期地上部鎘富集系數(shù)的最小值，xmax為所有小麥品種中苗期地上部鎘富集系數(shù)的最大值，苗期地上部鎘富集系數(shù)＝苗期地上部鎘含量/土壤實際鎘含量。

(7)確定小麥籽粒鎘高低積累品種

1)苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)大于0.8，且usw47標(biāo)記特異性條帶為225bp的小麥品種為籽粒鎘高積累品種；

2)苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)小于0.3，且usw47標(biāo)記特異性條帶為375bp的小麥品種為籽粒鎘低積累品種。

本發(fā)明利用大數(shù)據(jù)分析了分子標(biāo)記(usw47)與小麥真實鎘累積能力的相關(guān)性，結(jié)合分子標(biāo)記以及苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)，建立了更加快速、經(jīng)濟(jì)、合理有效的以苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)、分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的小麥鎘低積累品種快速篩選方法，鑒于我國的實際國情，本發(fā)明具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果：

(1)創(chuàng)新性：首次利用大田試驗分析大量鎘累積能力未知的小麥品種的真實鎘積累能力與分子標(biāo)記的相關(guān)性。采用苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)與分子標(biāo)記結(jié)合的篩選小麥籽粒鎘高低積累品種，相比單獨(dú)利用苗期鎘累積能力或分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，鑒別準(zhǔn)確率顯著提高。

(2)成本低廉：實際生產(chǎn)僅需進(jìn)行dna抽提、相關(guān)標(biāo)記的檢驗、苗期鎘含量測定，常規(guī)實驗室均可完成，成本較低。

(3)適用性廣：由于本發(fā)明選取的小麥品種數(shù)量龐大，分布廣泛，代表了中國大部分小麥主產(chǎn)區(qū)的品種，因此該方法的重現(xiàn)性較高，適用性也較廣泛。

附圖說明

圖1是usw47標(biāo)記部分結(jié)果圖。

圖2是不同usw47標(biāo)記結(jié)果下的小麥苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)、籽粒鎘含量示意圖。

圖3是不同小麥苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)(0.3、0.8臨界值)下的小麥籽粒含量示意圖。

圖4是usw47標(biāo)記結(jié)果與小麥苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)(0.3、0.8臨界值)共同篩選下不同小麥的籽粒鎘含量示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

一、一種小面積篩選大量小麥品種的方法

1.分子標(biāo)記部分

(1)在人工氣候箱中用培養(yǎng)皿和蒸餾水培養(yǎng)小麥幼苗，大約15天左右取樣，樣品保存于-80℃冰箱(該實施例為保證試驗嚴(yán)謹(jǐn)性，選擇單獨(dú)培養(yǎng)小麥幼苗，實際操作可直接選取田間小麥幼葉提取dna)。供試小麥品種由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供(品種信息見表1，所有品種均可在市場購買獲得)。

(2)使用改良的ctab法提取水培小麥dna：①取2-3cm小麥幼葉，加500μl的ctab(含1％的巰基乙醇)，研磨成勻漿(冰浴)，倒入2ml離心管中。②65℃恒溫水浴30min，其中將離心管上下顛倒數(shù)次。30min后取出，冷卻至常溫。③加入等體積的24:1(氯仿:異戊醇)，上下顛倒15min后12000g離心10min。④移取上清液至新離心管中并加入兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻后放入4℃冰箱中30min使dna沉淀。⑤7500g離心5min，倒去酒精，加入75％酒精500μl，彈起管底的沉淀。-20℃過夜，重復(fù)兩次。⑥倒盡酒精，待揮發(fā)完，加入40μlddh2o溶解，-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)使用usw47分子標(biāo)記驗證134個小麥品種：引物序列為f：5’-gctaggacttgattcattgat-3’，r:5’-agtgatctaaacgttcttata-3’。pcr條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。pcr產(chǎn)物經(jīng)hpy188ⅰ限制性內(nèi)切酶消化，37℃反應(yīng)1h；65℃酶變性20min；最后維持在10℃。酶切結(jié)果采用2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

2.大田試驗

為了獲取最終籽粒內(nèi)鎘含量，因此進(jìn)行全生育期的大田試驗。供試小麥品種由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供(品種信息見表1，所有品種均可在市場購買獲得)。2015-2016年田間試驗地點為武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)重金屬實驗基地，試驗土壤理論值為1.0mg/kg(cd1.0處理)。

(1)土壤基本理化性質(zhì)：ph5.39，有機(jī)質(zhì)5.40g/kg，堿解氮45.96mg/kg，速效磷39.29mg/kg，速效鉀179.58mg/kg，全鎘0.846mg/kg。

(2)試驗設(shè)置四個重復(fù)小區(qū)。小區(qū)長6.7米，寬2.35米，品種間距10cm，每個小區(qū)品種隨機(jī)分布。

(3)底肥為n:p2o5:k2o＝25:10:16比例的復(fù)合肥，41kg/畝均勻施入。拔節(jié)期按6kg/畝追施尿素，水溶后均勻施入。

(4)進(jìn)行統(tǒng)一常規(guī)的田間管理，包括間苗、鋤草、澆水和防治病蟲害。

(5)分別在苗期三葉期、成熟期收獲樣品，并對收獲樣品洗凈、烘干、粉碎后自封袋保存。

(6))根據(jù)gb5009.15-2014食品中鎘的測定方法，測定苗期地上部、成熟期不同品種籽粒鎘含量。

(7)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)處理采用excel、spss軟件，繪圖采用sigmaplot12.0軟件。其中，苗期地上部鎘富集系數(shù)、苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)(0-1標(biāo)準(zhǔn)化)的計算如下：

苗期地上部鎘富集系數(shù)＝苗期地上部鎘含量/土壤實際鎘含量。

x標(biāo)準(zhǔn)值＝(x1-xmin)/(xmax-xmin)，式中，x標(biāo)準(zhǔn)值為0-1標(biāo)準(zhǔn)化后的苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)；x1為計算所得的苗期地上部鎘富集系數(shù)；xmin為所有小麥品種中苗期地上部鎘富集系數(shù)的最小值；xmax為所有小麥品種中苗期地上部鎘富集系數(shù)的最大值。

(8)通過對數(shù)據(jù)處理結(jié)果比較分析，分別得出苗期、籽粒鎘高低累積小麥品種。

二、結(jié)果

(1)鎘脅迫下不同小麥品種鎘累積的差異

鎘脅迫下不同小麥品種對鎘的累積存在顯著基因型差異。在本次試驗中，不同小麥品種苗期地上部鎘含量為11.196～19.074mg/kg(表2)；不同小麥品種成熟期籽粒鎘含量為1.336～3.014mg/kg(表3)，可以看出不管是在苗期還是成熟期籽粒中的鎘含量，不同小麥品種的種間差異是顯著的，通過聚類分析結(jié)果可得籽粒鎘高積累品種有周麥22、周麥18、寧麥13、山農(nóng)15等，籽粒鎘低積累品種有長旱58、北4、小偃15、中育10號等。

(2)分子標(biāo)記驗證結(jié)果

usw47(caps標(biāo)記)，由wiebe開發(fā)，與作物鎘吸收性狀基因變異共分離的est衍生標(biāo)記，使用限制性內(nèi)切酶hpy188i消化后，可以檢測鎘吸收性狀基因的兩個等位基因，225bp(高鎘吸收)，375bp(低鎘吸收)。根據(jù)“張樂等(2012)”所使用的方法進(jìn)行試驗(張樂，陳為序，董慧等.普通小麥鎘吸收基因cdu1組成的功能標(biāo)記檢測[j].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,1(01)：002.)。結(jié)果顯示，不同小麥品種會呈現(xiàn)出不同的分子標(biāo)記結(jié)果，分別為225bp和375bp(圖1)，分別對應(yīng)鎘高積累品種和鎘低積累品種。

分析usw47標(biāo)記和苗期地上部、籽粒鎘含量的相關(guān)性，若單獨(dú)使用usw47標(biāo)記進(jìn)行小麥籽粒鎘高低積累品種的篩選，所有產(chǎn)生225bp條帶(高積累)的品種苗期地上部平均鎘含量為15.307mg/kg，籽粒平均鎘含量為2.010mg/kg，此類小麥品種中有40％的品種確定為籽粒鎘高積累品種；產(chǎn)生375bp條帶(低積累)的品種的苗期地上部平均鎘含量為15.253mg/kg，籽粒平均鎘含量為2.023mg/kg，此類小麥品種中有32.7％的品種確定為籽粒鎘低積累品種(圖2，表4)。單獨(dú)利用分子標(biāo)記usw47所篩的小麥籽粒鎘高、低積累品種的籽粒鎘含量差異不顯著，由此可見單獨(dú)利用分子標(biāo)記無法有效篩選小麥鎘高低積累品種。

若只利用苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)來篩選小麥籽粒鎘高低積累品種，以標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)0.3、0.8為臨界值，將所有品種劃分為苗期高鎘品種、苗期低鎘品種和苗期中鎘品種。所篩得苗期高鎘小麥品種的籽粒鎘含量為2.311mg/kg，此類小麥品種中有66.7％的品種確定為籽粒鎘高積累品種；所篩得苗期低鎘小麥品種的籽粒鎘含量為1.794mg/kg，此類小麥品種中有50％的品種確定為籽粒鎘低積累品種(圖3，表4)。但通過苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)所篩得的小麥籽粒鎘高、低積累品種的籽粒鎘含量雖然達(dá)到顯著差異，但均存在較大的變差。由于小麥較長的生育期，根系、莖稈、結(jié)點、葉片等部位的鎘累積能力均會影響最終籽粒鎘含量，由圖3也可以發(fā)現(xiàn)苗期鎘含量高(低)的品種，其籽粒鎘含量也可能會偏低(高)。

如果先利用苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)對所有品種進(jìn)行一次育篩，以標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)0.3、0.8為臨界值，將所有品種劃分為苗期高鎘品種、苗期低鎘品種和苗期中鎘品種。再利用分子標(biāo)記usw47對苗期高鎘品種和苗期低鎘品種進(jìn)行驗證，通過兩步法篩得的小麥鎘高低積累品種，籽粒鎘含量差異均達(dá)到極顯著。使用苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)+usw47標(biāo)記篩選的小麥鎘高、低積累品種籽粒平均鎘含量分別為2.538mg/kg和1.601mg/kg。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，通過兩步法篩選的小麥鎘高積累品種中有87.5％確定為籽粒鎘高積累品種，篩選的小麥鎘低積累品種中有80％確定為籽粒鎘低積累品種(圖4，表4)。

綜上所述，單獨(dú)利用usw47標(biāo)記無法在大量種質(zhì)資源存在的情況下輔助篩選小麥鎘高低積累品種，利用usw47標(biāo)記結(jié)果篩選得的小麥鎘高、低積累品種的苗期地上部鎘含量、籽粒鎘含量均不存在顯著差異。而采用苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)篩得的小麥鎘高低積累品種的籽粒鎘含量雖然存在顯著差異，但仍存在較大的不確定性。但若利用苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)對品種進(jìn)行預(yù)篩選后，再利用分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，能大大提高所篩得小麥鎘籽粒高低積累品種品種的準(zhǔn)確性，且相比單獨(dú)利用苗期鎘累積能力或分子標(biāo)記，兩者結(jié)合的方法所獲取的結(jié)果可信度更高，所篩選的小麥品種籽粒含量差異更加顯著，所得小麥籽粒鎘高、低積累品種準(zhǔn)確性可達(dá)80％以上。

表1.參試小麥品種信息

表2.不同小麥品種苗期地上部鎘含量(mg/kg)

表3.不同小麥品種成熟期籽粒鎘含量(mg/kg)

表4.分子標(biāo)記、苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘所篩得小麥鎘高低積累品種苗期、籽粒鎘含量差異

注：方差分析比較不同方式篩選的鎘高積累品種以及鎘低積累的苗期地上部鎘含量、籽粒鎘含量差異，***代表p<0.01的極顯著差異。標(biāo)注[1]鑒別率指通過通過苗期、分子標(biāo)記或者兩者結(jié)合的方式篩得的小麥品種存在多少比例的籽粒鎘高、低積累品種。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>基于苗期地上部標(biāo)準(zhǔn)化鎘富集系數(shù)及usw47標(biāo)記篩選小麥籽粒鎘高低積累品

種的方法

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物f

<400>1

gctaggacttgattcattgat21

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