就減少的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行修飾的轉(zhuǎn)基因植物、衍生產(chǎn)物和相關(guān)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明部分涉及轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因煙草植物和衍生種子，其進(jìn)行遺傳修飾以通過(guò)減少HMA相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平，阻礙從轉(zhuǎn)基因植物的根系到氣生部分的鎘(Cd)轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明包括經(jīng)遺傳修飾以穩(wěn)定表達(dá)編碼RNAi多核苷酸的RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述RNAi多核苷酸使得內(nèi)源NtHMA?RNA變體的降解成為可能。在轉(zhuǎn)基因植物中NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的減少導(dǎo)致葉片中基本上減少的鎘(Cd)含量。通過(guò)并入衍生自轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉可以產(chǎn)生基本上不含或在Cd含量中基本上減少的各種消費(fèi)品，所述轉(zhuǎn)基因煙草植物進(jìn)行修飾以減少NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】就減少的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行修飾的轉(zhuǎn)基因植物、衍生產(chǎn)物和相關(guān)方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年12月11日、申請(qǐng)?zhí)枮?00880125345.2、發(fā)明名稱(chēng)為“就減少的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行修飾的轉(zhuǎn)基因植物、衍生產(chǎn)物和相關(guān)方法”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]組合物、表達(dá)載體、多核苷酸、多肽、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因種子、以及制備且使用這些實(shí)施方案以產(chǎn)生可以減少重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)到氣生部分內(nèi)的各種植物的方法。
[0003]與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參照
[0004]本申請(qǐng)要求于2007年12月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/996，982的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)柕耐暾麅?nèi)容通過(guò)引用在此合并。
[0005]發(fā)明背景
[0006]植物通過(guò)各種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制從其環(huán)境中吸收金屬離子底物而獲得必需重金屬，例如Zn、Ni和Cu，所述轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制由在根細(xì)胞和各種維管組織的表面上表達(dá)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。分類(lèi)為P型ATP酶例如PlB型ATP酶的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是通過(guò)利用從放能ATP水解反應(yīng)釋放的能量轉(zhuǎn)移帶正電的底物穿過(guò)質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。PlB型ATP酶也稱(chēng)為重金屬ATP酶(“HMA”)或CPx型ATP酶。HMA已通過(guò)底物特異性分成2個(gè)亞類(lèi)，Cu/Ag和Zn/Co/Cd/Pb組。在植物中表征的第一種PlB型ATP酶是從擬南芥屬(Arabidopsis)中克隆的AtHMA4。通過(guò)HMAs的底物特異性并不嚴(yán)格限制于必需金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)，因?yàn)閹追N非必需金屬可以無(wú)差別地識(shí)別為底物，導(dǎo)致許多非必需金屬例如Cd、Pb、As和Hg的累積。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明的多個(gè)方面涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物包括轉(zhuǎn)基因煙草植物的組合物和方法，所述轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)遺傳修飾以通過(guò)減少HMA家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平而阻礙從根系到葉片(leaf lamina)的鎘(Cd)轉(zhuǎn)運(yùn)。HMA同系物(“NtHMA”)已在煙草中得到鑒定，其可以用于構(gòu)建多種RNAi構(gòu)建體，編碼可以促進(jìn)內(nèi)源NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物降解的目的NtHMARNAi多核苷酸。可以表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的NtHMA RNAi多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物可以用于減少NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)水平，并且因此用于減少可用于轉(zhuǎn)運(yùn)金屬穿過(guò)細(xì)胞膜的功能活性NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)目。
[0009]本發(fā)明的其他方面涉及包括多種NtHMA RNAi構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，經(jīng)遺傳修飾以?xún)?nèi)源表達(dá)NtHMA RNAi多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物和種子，衍生自轉(zhuǎn)基因植物和種子的細(xì)胞系，和并入衍生自根據(jù)所公開(kāi)方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的葉的消費(fèi)品。
[0010]根據(jù)本發(fā)明，在一個(gè)方面提供了選自下述的經(jīng)分離的多核苷酸:
[0011]包括這樣的序列或由這樣的序列組成且編碼具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多核苷酸，所述序列與SEQ ID NO:1具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70%序列同一性；
[0012]包括這樣的序列或由這樣的序列組成的多核苷酸，所述序列與SEQ ID N0:3具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%序列同一性，例如至少70%序列同一性；
[0013]包括這樣的序列或由這樣的序列組成的多核苷酸，所述序列與SEQ ID N0:47具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%序列同一性，例如至少70%序列同一性；
[0014]包括編碼這樣的多肽的序列或由編碼這樣的多肽的序列組成的多核苷酸，所述多肽與 SEQ ID NO:2 具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70 %序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；和
[0015]包括編碼這樣的多肽的序列或由編碼這樣的多肽的序列組成的多核苷酸，所述多肽與 SEQ ID NO:49 具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70%序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0016]本發(fā)明的經(jīng)分離的多核苷酸可以在高嚴(yán)格條件下與這樣的核酸分子雜交，所述核酸分子包括SEQ ID NO:1、3或47或SEQ ID NO:1、3或47的互補(bǔ)序列或由SEQ ID NO:1、3或47或SEQ ID NO:1、3或47的互補(bǔ)序列組成。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)方面是包括如本文所定義的經(jīng)分離的多核苷酸的表達(dá)載體。
[0018]還提供的是通過(guò)這樣的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物，所述方法包括引入如本文所定義的經(jīng)分離的多核苷酸或如本文所定義的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因植物可以是例如煙草植物。
[0019]進(jìn)一步提供的是通過(guò)這樣的方法制備的細(xì)胞系，所述方法包括引入如本文所定義的經(jīng)分離的多核苷酸或如本文所定義的表達(dá)載體。
[0020]在一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了并入從如本文所定義的轉(zhuǎn)基因植物中收獲的葉的可消費(fèi)煙草產(chǎn)品(例如但不限于可抽吸物品(smoking article)或無(wú)煙煙草制品)。
[0021]在另一個(gè)方面，提供了能夠抑制它與之相對(duì)應(yīng)的NtHMA信使RNA表達(dá)的NtHMARNAi構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括:
[0022]與SEQ ID NO:3 或 47 的部分具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70%序列同一性的第一序列；
[0023]第二序列；和
[0024]以與第一序列相同的定向放置的、具有第一序列的反向互補(bǔ)序列的第三序列，
[0025]其中第二序列放置在第一序列和第三序列之間，并且第二序列與第一序列和第三序列可操作地連接。
[0026]在NtHMA RNAi 構(gòu)建體中:
[0027](a)第一序列可以與選自下述一個(gè)或多個(gè)的序列具有至少50^^55^^60 %、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少95%序列同一性:外顯子I (SEQ ID NO:5)、外顯子I (SEQ ID NO:5)的片段、外顯子2 (SEQID NO:7)、外顯子 2 (SEQ ID NO:7)的片段、外顯子 3 (SEQ ID NO:9)、外顯子 3 (SEQ ID NO:9)的片段、外顯子4 (SEQ ID NO: 11)、外顯子4 (SEQ ID NO:11)的片段、外顯子5 (SEQ IDNO: 13)、外顯子 5 (SEQ ID NO: 13)的片段、外顯子 6 (SEQ ID NO: 15)、外顯子 6 (SEQ ID NO:15)的片段、外顯子7 (SEQ ID NO: 17)、外顯子7 (SEQ ID NO:17)的片段、外顯子8 (SEQ IDNO:19)、外顯子 8 (SEQ ID NO:19)的片段、外顯子 9 (SEQ ID NO:21)、外顯子 9 (SEQ ID NO:
21)的片段、外顯子10 (SEQ ID NO:23)、外顯子10 (SEQ ID NO:23)的片段、外顯子11 (SEQID NO:25)、和外顯子 11 (SEQ ID NO:25)的片段；
[0028](b)第二序列可以與選自下述一個(gè)或多個(gè)的序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少95%序列同一性:內(nèi)含子I (SEQ ID NO:4)、內(nèi)含子I (SEQ ID NO:4)的片段、內(nèi)含子2 (SEQID NO:6)、內(nèi)含子 2 (SEQ ID NO:6)的片段、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO:8)、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO:8)的片段、內(nèi)含子4 (SEQ ID NO: 10)、內(nèi)含子4 (SEQ ID NO:10)的片段、內(nèi)含子5 (SEQ IDNO: 12)、內(nèi)含子 5 (SEQ ID NO: 12)的片段、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO: 14)、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO:14)的片段、內(nèi)含子7 (SEQ ID NO: 16)、內(nèi)含子7 (SEQ ID NO:16)的片段、內(nèi)含子8 (SEQ IDNO: 18)、內(nèi)含子 8 (SEQ ID NO: 18)的片段、內(nèi)含子 9 (SEQ ID NO: 20)、內(nèi)含子 9 (SEQ ID NO:20)的片段、內(nèi)含子10 (SEQ ID NO:22)、內(nèi)含子10 (SEQ ID NO:22)的片段、內(nèi)含子11 (SEQID NO:24)、內(nèi)含子 11 (SEQ ID NO:24)的片段、內(nèi)含子 12 (SEQ ID NO:26)、和內(nèi)含子 12 (SEQID NO:26)的片段；
[0029](c)第三序列可以與選自下述一個(gè)或多個(gè)的序列具有至少50^^55^^60 %、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少95%序列同一性:SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:27 的片段、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28 的片段、SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:29 的片段、SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:30 的片段、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO: 31 的片段、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32 的片段、SEQ ID NO:33、SEQID NO:33 的片段、SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:34 的片段、SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:35 的片段、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:36 的片段、SEQ ID NO:37、和 SEQ ID NO:37 的片段；
[0030](d)第一序列可以包括SEQ ID NO:38，第二序列可以包括SEQ ID N0:39，并且第三序列可以包括SEQ ID NO:40 ；
[0031](e)第一序列可以包括SEQ ID NO:42，第二序列可以包括SEQ ID N0:43，并且第三序列可以包括SEQ ID NO:44 ;或
[0032](f)可以應(yīng)用(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的一個(gè)或兩個(gè)或三個(gè)。
[0033]本發(fā)明還涵蓋包括啟動(dòng)子的表達(dá)載體，所述啟動(dòng)子放置在如本文所定義的NtHMARNAi構(gòu)建體的上游且與之可操作地連接。啟動(dòng)子可以選自:組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子。
[0034]在NtHMA RNAi構(gòu)建體中，第一個(gè)和第二序列可以各自具有選自下述的長(zhǎng)度:20-30個(gè)核苷酸、30-50個(gè)核苷酸、50-100個(gè)核苷酸、100-150個(gè)核苷酸、150-200個(gè)核苷酸、200-300個(gè)核苷酸、300-400個(gè)核苷酸、400-500個(gè)核苷酸、500-600個(gè)核苷酸、和600-700個(gè)核苷酸。
[0035]本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面是包括如本文所定義的RNAi (或NtHMA RNAi構(gòu)建體或表達(dá)載體)的轉(zhuǎn)基因植物，其中與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物中的部分相比較，所述轉(zhuǎn)基因植物在植物的至少部分中具有減少的Cd水平。轉(zhuǎn)基因植物可以是例如煙草植物。
[0036]還提供的是并入從包括如本文所定義RNAi的轉(zhuǎn)基因植物中收獲的葉的可消費(fèi)煙草產(chǎn)品(例如但不限于可抽吸物品或無(wú)煙煙草制品)。
[0037]產(chǎn)品可以具有至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的％ Cd 減少值。
[0038]產(chǎn)品可以具有值為約0.01至約0.05ppm、約0.01至約0.lppm、約0.01至約0.5ppm、約0.01至約1.0ppm、或約0.01至約5ppm的Cd含量。
[0039]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供的是用于減少植物的至少部分中的Cd水平的方法，其包括:
[0040]通過(guò)引起RNAi構(gòu)建體的表達(dá)減少植物中的NtHMA mRNA水平。
[0041]對(duì)于這種方法，RNAi構(gòu)建體可以是如本文所定義的，并且特別可以包括:
[0042]與SEQ ID NO:3 或 47 的部分具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一丨生,例如至少90%序列同一丨生的第一序列；
[0043]第二序列；和
[0044]以與第一序列相同的定向放置、具有第一序列的反向互補(bǔ)序列的第三序列，
[0045]其中第二序列放置在第一序列和第三序列之間，并且第二序列與第一序列和第三序列可操作地連接。
[0046]根據(jù)該方法， 在RNAi構(gòu)建體表達(dá)后，植物的部分可以具有減少至少約5%、10%、15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的 Cd 含量。
[0047]另外或備選地，在RNAi構(gòu)建體表達(dá)后，植物的部分可以具有約0.01至約0.05ppm、約 0.01 至約 0.lppm、約 0.01 至約 0.5ppm、約 0.01 至約 1.0ppm、或約 0.01 至約 5ppm 的 Cd含量。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供的是與SEQ ID NO:2或49具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性，例如至少70%序列同一性或至少95%序列同一性的基本上純化的多肽，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0049]與如本文所定義的多肽特異性結(jié)合的抗體也由本發(fā)明涵蓋，所述多肽例如包括SEQ ID NO:2 或 49 或由 SEQ ID NO:2 或 49 組成。
[0050]下文描述了本發(fā)明的進(jìn)一步和多個(gè)方面(在本文中也稱(chēng)為“實(shí)施方案”)。
[0051]附圖簡(jiǎn)述
[0052]圖1是包括11個(gè)外顯子的NtHMA基因組克隆的示意圖。
[0053]圖2A舉例說(shuō)明用于構(gòu)建NtHMA RNAi表達(dá)載體的示例性亞克隆策略，所述NtHMARNAi表達(dá)載體使得目的NtHMA RNAi多核苷酸的組成性表達(dá)成為可能，如實(shí)施例2中描述的。
[0054]圖2B舉例說(shuō)明由NtHMA RNAi多核苷酸內(nèi)的分子內(nèi)、堿基配對(duì)相互作用形成的假定雙鏈RNA雙鏈體(作為“莖-環(huán)-莖”結(jié)構(gòu))，所述NtHMA RNAi多核苷酸作為由示例性NtHMA RNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物產(chǎn)生。
[0055]圖3A顯示用于產(chǎn)生目的NtHMA RNAi多核苷酸的示例性RNAi序列，NtHMA (660-915)，如實(shí)施例2中描述的。
[0056]圖3B-3D顯示在代表3個(gè)變種的多個(gè)第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系的葉片中的Cd減少，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)NtHMA RNAi多核苷酸(660-915)，如實(shí)施例5中描述的。
[0057]圖4A顯示用于產(chǎn)生目的NtHMA RNAi多核苷酸的示例性RNAi序列，NtHMA (1382-1584)，如實(shí)施例3中描述的。
[0058]圖4B-4D顯示在代表3個(gè)變種的多個(gè)第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系的葉片中的Cd減少，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)NtHMA RNAi多核苷酸(1382-1584)，如實(shí)施例5中描述的。
[0059]圖5A-C顯示在多個(gè)第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系中的標(biāo)準(zhǔn)化NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物水平，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)目的NtHMA RNAi多核苷酸，如通過(guò)葉片提取物的定量實(shí)時(shí)PCR分析測(cè)定的，如實(shí)施例6中描述的。
[0060]圖6顯示在多個(gè)第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系的葉片和根之間的Cd和Zn分布，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)目的NtHMA RNAi多核苷酸，如表2中呈現(xiàn)的和實(shí)施例7中描述的。
[0061]圖7顯示在多個(gè)第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系的樹(shù)皮(“B”)、葉片(“L”)、木髓(“P”)和根(“R”)組織中的Cd分布，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)目的NtHMA RNAi多核苷酸，如表3中呈現(xiàn)的和實(shí)施例8中描述的。
[0062]圖8顯示在多個(gè)第二代(Tl)轉(zhuǎn)基因品系的葉片(“L”)和根(“R”)之間的Cd分布，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)目的NtHMA RNAi多核苷酸，如實(shí)施例9中描述的。
[0063]發(fā)明詳述
[0064]1.煙草NtHMA基因和基因產(chǎn)物的分離
[0065]圖1是包括11個(gè)外顯子的NtHMA基因組克隆的示意圖，所述外顯子編碼與HMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族相關(guān)的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。實(shí)施例1進(jìn)一步描述了 NtHMA基因組克隆(_H0-18-2)和4個(gè)NtHMA cDNA克隆的鑒定。下表1提供了與在NtHMA基因組克隆(_Η0_18_2)內(nèi)作圖的外顯子和內(nèi)含子亞區(qū)相對(duì)應(yīng)的核苷酸位置。
[0066]A.NtHMA 多核苷酸
[0067]術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指長(zhǎng)度包括至少10個(gè)堿基的核苷酸聚合物。多核苷酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA雜交物，包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合、以及堿基和/或修飾的組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥(niǎo)嘌呤。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式的DNA或RNA。術(shù)語(yǔ)“DNA”包括基因組DNA、cDNA、化學(xué)合成的DNA、PCR擴(kuò)增的DNA及其組合/等價(jià)物。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的多核苷酸”指與起源任何的基因組不鄰接、或從天然背景中分離的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)包括任何重組多核苷酸分子，例如NtHMA RNAi構(gòu)建體、NtHMA RNAi表達(dá)載體、NtHMA基因組克隆及其片段和變體。
[0068]如圖1中所示，指定為SEQ ID NO:1的NtHMA基因組克隆包括:內(nèi)含子I (SEQ IDN0:4)、外顯子 1(SEQ ID NO:5)、內(nèi)含子 2 (SEQ ID N0:6)、外顯子 2 (SEQ ID N0:7)、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO: 8)、外顯子 3 (SEQ ID NO: 9)、內(nèi)含子 4 (SEQ ID NO: 10)、外顯子 4 (SEQ IDNO: 11)、內(nèi)含子 5 (SEQ ID NO: 12)、外顯子 5 (SEQ ID NO: 13)、內(nèi)含子6 (SEQ ID NO: 14)、外顯子 6 (SEQ ID NO: 15)、內(nèi)含子 7 (SEQ ID NO: 16)、外顯子 7 (SEQ ID NO: 17)、內(nèi)含子 8 (SEQ IDNO: 18)、外顯子8 (SEQ ID NO: 19)、內(nèi)含子9(SEQ ID N0:20)、外顯子9 (SEQ ID N0:21)、內(nèi)含子 10 (SEQ ID NO: 22)、外顯子 10 (SEQ ID NO: 23)、內(nèi)含子 11 (SEQ ID NO: 24、外顯子 11 (SEQID NO:25)、和內(nèi)含子12(SEQ ID NO:26)。關(guān)于序列，參見(jiàn)下文序列表。本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案涉及代表在NtHMA基因座處分離的基因組片段的經(jīng)分離的多核苷酸，包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的片段或其變體。多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體，其包括與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:1 的片段至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。
[0069]多個(gè)實(shí)施方案涉及具有互補(bǔ)于NtHMA多核苷酸變體的序列的經(jīng)分離的多核苷酸，所述變體包括與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的片段至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。多個(gè)實(shí)施方案涉及這樣的經(jīng)分離的多核苷酸，其可以在中至高嚴(yán)格條件下與多核苷酸特異性雜交，所述多核苷酸包括 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:1 的片段。
[0070]多個(gè)實(shí)施方案涉及NtHMA cDNA(克隆P6663)的經(jīng)分離的多核苷酸，其包括SEQ IDN0:3、SEQ ID NO:3的片段或其變體。多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體，其包括與 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:3 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體，其包括與SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:3 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性，并且其中T已由U替換(例如RNA)。多個(gè)實(shí)施方案涉及這樣的經(jīng)分離的多核苷酸，其可以在中至高嚴(yán)格條件下與多核苷酸特異性雜交，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的片段。多個(gè)實(shí)施方案涉及具有互補(bǔ)于NtHMA多核苷酸變體的序列的經(jīng)分離的多核苷酸，所述變體包括與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的片段至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。
[0071]多個(gè)實(shí)施方案涉及NtHMA cDNA(克隆P6643)的經(jīng)分離的多核苷酸，其包括SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:47的片段或其變體。多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體，其包括與 SEQ ID N0:47 或 SEQ ID NO:47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96 %、97%、98 %和99 %序列同一性。多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體，其包括與 SEQ ID N0:47 或 SEQ ID NO:47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性，并且其中T已由U替換(例如RNA)。多個(gè)實(shí)施方案涉及這樣的經(jīng)分離的多核苷酸，其可以在中至高嚴(yán)格條件下與多核苷酸特異性雜交，所述多核苷酸包括SEQ ID N0:47或SEQ ID NO:47的片段。多個(gè)實(shí)施方案涉及具有互補(bǔ)于NtHMA多核苷酸變體的序列的經(jīng)分離的多核苷酸，所述變體包括與SEQ ID N0:47或SEQ ID NO:47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。
[0072]多個(gè)實(shí)施方案涉及與NtHMA多核苷酸和NtHMA多肽同源的生物聚合物(“NtHMA同系物”)，其可以從不同植物物種中鑒定。例如，NtHMA同系物可以通過(guò)篩選衍生自不同目的植物物種的合適核酸文庫(kù)在實(shí)驗(yàn)上分離。備選地，NtHMA同系物可以利用衍生自NtHMA多核苷酸和/或NtHMA多肽的序列通過(guò)篩選包含來(lái)自一個(gè)或多個(gè)物種的序列的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到鑒定。此類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)可對(duì)于許多物種容易地獲得(例如在環(huán)球網(wǎng)(《?W)上在tigr.0rg/tdb ；genetics.wise, edu ；stanford.edu/.about, ball ；hiv-web.1an1.gov ；ncb1.nlm.nig.gov ；eb1.ac.uk ;和 pasteur.fr/other/b1logy 處)。例如，簡(jiǎn)并寡核苷酸序列可以通過(guò)“回譯”由NtHMA多肽片段獲得。NtHMA多核苷酸可以可以用作探針或引物以鑒定/擴(kuò)增相關(guān)序列，或例如通過(guò)PCR或通過(guò)其他眾所周知的技術(shù)(例如，參見(jiàn)PCR Protocols:AGuide to Methods and Applicat1ns, Innis等人，編輯,Academic Press, Inc.(1990))獲得關(guān)于相關(guān)NtHMAs的全長(zhǎng)序列。
[0073]B.NtHMA 多肽
[0074]術(shù)語(yǔ)“NtHMA多肽”指包括指定為SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽；與SEQ IDNO:2具有基本同源性(即序列相似性)或序列同一性的多肽；SEQ ID NO:2的片段；及其變體。NtHMA多肽包括與SEQ ID NO:2具有足夠或基本同一性或相似性程度并且可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬穿過(guò)細(xì)胞膜起作用的序列。
[0075]NtHMA多肽包括通過(guò)引入任何類(lèi)型的改變(例如，氨基酸的插入、缺失或置換；糖基化狀態(tài)中的改變；影響重折疊或異構(gòu)化、三維結(jié)構(gòu)或自結(jié)合狀態(tài)的改變)而產(chǎn)生的變體，其可以是有意改造的或天然分離的。NtHMA多肽可以為線(xiàn)性形式的或使用已知方法環(huán)化的(例如 H.U.Saragovi,等人，B1/Technology 10, 773 (1992);和 R.S.McDowell,等人，J.Amer.Chem.Soc.11 4:9245 (1992)，兩者都通過(guò)引用合并入本文)。NtHMA多肽包括至少8至10個(gè)、至少20個(gè)、至少30個(gè)或至少40個(gè)鄰接氨基酸。
[0076]多個(gè)實(shí)施方案涉及由多核苷酸序列SEQ ID NO:1編碼的經(jīng)分離的NtHMA多肽，包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的片段或其變體。多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽變體，包括與 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:2 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。
[0077]多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽(克隆P6663)，包括SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:2的片段或其變體。多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽變體，包括與SEQ ID NO:2或 SEQ ID NO:2 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一'I"生。
[0078]多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽(克隆P6643)，包括SEQ ID NO:49、SEQID NO:49的片段或其變體。多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽變體，包括與SEQ IDN0:49 或 SEQ ID NO:49 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。
[0079]I1.用于減少NtHMA基因表達(dá)和/或NtHMA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的組合物和相關(guān)方法
[0080]可以下調(diào)NtHMA和NtHMA變體的表達(dá)和/或活性的合適拮抗性組合物包括可以干擾一種或多種內(nèi)源NtHMA基因的轉(zhuǎn)錄的序列特異性多核苷酸；可以干擾NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯的序列特異性多核苷酸(例如，dsRNA、siRNA、核酶)；可以干擾NtHMA的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、NtHMA的酶促活性、和/或NtHMA就底物和/或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)而言的結(jié)合活性的序列特異性多肽；顯示關(guān)于NtHMA的特異性的抗體；和可以干擾NtHMA的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、NtHMA的酶促活性、和/或NtHMA的結(jié)合活性的小分子化合物。有效拮抗劑可以使重金屬(例如Cd)轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片結(jié)構(gòu)內(nèi)減少至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。
[0081]A.定義
[0082]本公開(kāi)內(nèi)容和附加權(quán)利要求自始至終，術(shù)語(yǔ)“a”和“the”充當(dāng)單數(shù)和復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有明確說(shuō)明。因此，例如提及“RNAi多核苷酸”包括多個(gè)此類(lèi)RNAi多核苷酸，并且提及“植物”包括提及一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)植物。
[0083]術(shù)語(yǔ)“定向”指多核苷酸相對(duì)于參考多核苷酸的位置放置的特定順序。線(xiàn)性DNA具有2個(gè)可能定向:5’_至-3’方向和3’-至-5’方向。例如，如果參考序列以5’-至-3’方向放置，并且如果第二序列以5’-至-3’方向放置在相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)，那么參考序列和第二序列以相同方向定向，或具有相同定向。一般地，啟動(dòng)子序列和在給定啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下的目的基因以相同方向放置。然而，就以5’-至-3’方向放置的參考序列而言，如果第二序列以3’ -至-5’方向放置在相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)，那么參考序列和第二序列以反義方向定向，或具有反義定向。就彼此而言具有反義定向的2個(gè)序列可以備選地描述為具有相同定向，如果參考序列(5’_至-3’方向)和參考序列的反向互補(bǔ)序列(以5’-至-3’放置的參考序列)放置在相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)。
[0084]術(shù)語(yǔ)“NtHMA RNAi表達(dá)載體”指包括DNA組分的組合用于使得NtHMA RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)成為可能的核酸媒介物。合適的表達(dá)載體包括能夠染色體外復(fù)制的附加體，例如環(huán)狀、雙鏈DNA質(zhì)粒；線(xiàn)性化雙鏈DNA質(zhì)粒；和任何起源的其他功能上等價(jià)的表達(dá)載體。合適的NtHMA RNAi表達(dá)載體至少包括放置在上游且與NtHMA RNAi構(gòu)建體可操作地連接的啟動(dòng)子，如下文定義的。
[0085]術(shù)語(yǔ)“NtHMA RNAi構(gòu)建體”指編碼具有RNA干擾活性的“NtHMA RNAi多核苷酸”的雙鏈、重組DNA片段。NtHMA RNAi構(gòu)建體包括與互補(bǔ)“正義或編碼鏈”堿基配對(duì)的“模板鏈”。給定NtHMA RNAi構(gòu)建體可以以2個(gè)可能的定向插入NtHMA RNAi表達(dá)載體內(nèi)，就放置在NtHMA RNAi表達(dá)載體內(nèi)的啟動(dòng)子定向而言的相同(或正義)定向或相反(或反義)定向。
[0086]術(shù)語(yǔ)“NtHMA RNAi多核苷酸”可以靶向NtHMA RNA用于酶促降解，涉及NtHMA RNAi多核苷酸的較小片段(“siRNA”)的形成，其可以與靶NtHMA RNA內(nèi)的多個(gè)互補(bǔ)序列結(jié)合。一種或多種NtHMA基因的表達(dá)水平可以通過(guò)NtHMA RNAi多核苷酸的RNA干擾活性減少。
[0087]術(shù)語(yǔ)“模板鏈”指包括互補(bǔ)于DNA雙鏈體的“正義或編碼鏈”序列的序列的鏈，所述DNA雙鏈體例如NtHMA基因組片段、NtHMA cDNA或NtHMA RNAi構(gòu)建體、或包括可以由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的核酸序列的任何DNA片段。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA聚合酶可以在新生RNA合成過(guò)程中以3’-至-5’方向沿著模板鏈移動(dòng)。
[0088]術(shù)語(yǔ)“正義鏈”或“編碼鏈”指包括互補(bǔ)于DNA雙鏈體中的模板鏈序列的序列的鏈。例如，關(guān)于經(jīng)鑒定的NtHMA基因組克隆的正義鏈的序列(“正義序列”)指定為SEQ IDNO:1。例如，關(guān)于經(jīng)鑒定為克隆P6663的NtHMA cDNA的正義序列指定為SEQ ID NO:3。例如，關(guān)于經(jīng)鑒定為克隆P6643的NtHMA cDNA的正義序列指定為SEQ ID NO:46。例如，如果正義鏈包括假定序列5’ -TAATCCGGT-3’，那么在假定靶mRNA內(nèi)基本上相同的相對(duì)應(yīng)序列是5，-UAAUCCG⑶-3，。
[0089]術(shù)語(yǔ)“反向互補(bǔ)序列”指互補(bǔ)于就正義序列而言以相同定向放置在相同鏈內(nèi)的目的“正義序列”(例如外顯子序列)的序列。例如，如果鏈包括假定序列5’-TAATCCGGT-3’，那么反向互補(bǔ)序列5’-ACCGGATTA-3’可以與正義序列可操作地連接，通過(guò)間隔物序列分開(kāi)。
[0090]在RNA干擾上下文中的術(shù)語(yǔ)“NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物”或“NtHMA RNA”指在目的宿主植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的多核糖核酸分子，產(chǎn)生于HMA家族的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，包括經(jīng)分離的NtHMA基因(SEQ ID NO:1)。因此，這些術(shù)語(yǔ)包括作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由HMA相關(guān)基因產(chǎn)生的任何RNA種類(lèi)或RNA變體，所述HMA相關(guān)基因可以不同于經(jīng)分離的NtHMA基因(SEQ ID N0:1)，但在結(jié)構(gòu)和/或功能水平上具有足夠的相似性以分類(lèi)在相同家族內(nèi)。例如，如果根據(jù)所公開(kāi)的方法就遺傳修飾選擇的宿主植物細(xì)胞是煙草，那么靶NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物包括:(I)由經(jīng)分離的NtHMA基因(SEQ ID NO:1)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體和mRNA ; (2)由與經(jīng)分離的NtHMA基因(SEQ ID NO:1)序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的任何基因(即與經(jīng)鑒定的NtHMA基因基本上等同且編碼HMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相關(guān)同種型的其他不同基因)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體和mRNA ;和(3)由NtHMA基因(SEQ ID NO:1)的等位基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體和mRNA。NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物包括由于特定NtHMA基因的異核RNA( “hnRNA”)的可變RNA剪接反應(yīng)產(chǎn)生的RNA變體、起因于此類(lèi)可變RNA剪接反應(yīng)的mRNA變體、和任何中間RNA變體。
[0091]術(shù)語(yǔ)“同源性”或“同一性”或“相似性”指通過(guò)序列比對(duì)相比較的2個(gè)多肽之間或2個(gè)核酸分子之間的序列相似性程度。被比較的2個(gè)不連續(xù)核酸序列之間的同源性程度是在可比較位置上的等同或匹配核苷酸數(shù)目的函數(shù)。同一性百分比可以通過(guò)目視檢查和數(shù)學(xué)計(jì)算進(jìn)行測(cè)定。備選地，2個(gè)核酸序列的同一性百分比可以使用GAP計(jì)算機(jī)程序、版本6.0通過(guò)比較序列信息進(jìn)行測(cè)定，所述GAP計(jì)算機(jī)程序由Devereux等人(Nuc1.Acids Res.12:387,1984)描述，且可從 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffGCG)獲得。用于GAP程序的一般缺省參數(shù)包括:(I)用于核苷酸的一元比較矩陣(包含值I用于同一性和 O 用于非同一性)，以及 Gribskov 和 Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986 的加權(quán)比較矩陣，如由 Schwartz 和 Dayhoff,編輯，Atlas of Protein Sequence and Structure,Nat1nal B1medical Research Foundat1n,第 353-358 頁(yè)，1979 描述的；(2)罰分 3.0 用于每個(gè)缺口和另外的0.10罰分用于每個(gè)缺口中的每個(gè)符號(hào)；和(3)對(duì)于末端缺口無(wú)罰分。備選地可以利用序列比較領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種程序。
[0092]術(shù)語(yǔ)“上游”指沿著線(xiàn)性多核苷酸序列就參考元件而言的相對(duì)方向/位置，這指示朝向多核苷酸序列的5’末端的方向/位置。“上游”可以與“參考元件的5’末端”互換使用。
[0093]術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指不同DNA元件、片段或序列的連接，以產(chǎn)生功能轉(zhuǎn)錄單位或功能表達(dá)載體。
[0094]術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指一般放置在雙鏈DNA片段的上游且與之可操作地連接的核酸元件/序列，所述雙鏈DNA片段例如NtHMA RNAi構(gòu)建體。例如，合適的啟動(dòng)子通過(guò)召募轉(zhuǎn)錄復(fù)合物使得NtHMA RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄激活成為可能，所述轉(zhuǎn)錄復(fù)合物包括RNA聚合酶和各種因子，以起始RNA合成。“啟動(dòng)子”可以完全衍生自與目的天然基因鄰近的區(qū)域，或可以由衍生自不同天然啟動(dòng)子的不同元件和/或合成DNA區(qū)段組成。合適的啟動(dòng)子包括由組織特異性因子識(shí)別的組織特異性啟動(dòng)子，所述組織特異性因子在不同組織或細(xì)胞類(lèi)型中出現(xiàn)(例如，根特異性啟動(dòng)子、芽特異性啟動(dòng)子、木質(zhì)部特異性啟動(dòng)子)、或在不同發(fā)育階段過(guò)程中出現(xiàn)、或響應(yīng)不同環(huán)境條件而出現(xiàn)。合適的啟動(dòng)子包括無(wú)需特異性誘導(dǎo)劑即可在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中激活的組成型啟動(dòng)子。用于控制NtHMA RNAi多肽產(chǎn)生的合適啟動(dòng)子的例子包括花椰菜花葉病毒35S (CaMV/35S)、SSU、0CS、lib4、usp、STLSU B33、nos或泛素或菜豆球蛋白啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生重組啟動(dòng)子的多重變化，如許多參考文獻(xiàn)中描述的，例如 Okamuro 和 Goldberg, B1chemistry of Plants,第 15 卷:第 1-82 頁(yè)(1989)。
[0095]組織特異性啟動(dòng)子是僅在植物發(fā)育過(guò)程中的特定時(shí)間在特定細(xì)胞或組織中活躍的轉(zhuǎn)錄控制元件，例如在營(yíng)養(yǎng)組織或生殖組織中。例如當(dāng)多核苷酸在特定組織中的表達(dá)是優(yōu)選的時(shí)，組織特異性表達(dá)可以是有利的。在發(fā)育控制下的組織特異性啟動(dòng)子的例子包括可以?xún)H(或僅最初)在特定組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述特定組織例如營(yíng)養(yǎng)組織例如根或葉，或生殖組織例如果實(shí)、胚珠、種子、花粉、雌蕊、花或任何胚胎組織。生殖組織特異性啟動(dòng)子可以是例如花藥特異性、胚珠特異性、胚特異性、胚乳特異性、珠被特異性、種子和種皮特異性、花粉特異性、花瓣特異性、萼片特異性的或其組合。
[0096]合適的葉特異性啟動(dòng)子包括來(lái)自C4植物(玉蜀黍)的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)啟動(dòng)子、來(lái)自玉蜀黍的cab-mlCa+2啟動(dòng)子、擬南芥myb相關(guān)基因啟動(dòng)子(Atmyb5)、核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)啟動(dòng)子(例如在葉和光生長(zhǎng)(light-grown)幼苗中表達(dá)的煙草RBCS URBCS2和RBCS3A基因，在發(fā)育番茄果實(shí)中表達(dá)的RBCSl和RBCS2，和/或以高水平在葉片和葉鞘中的葉肉細(xì)胞中幾乎專(zhuān)一地表達(dá)的核酮糖二磷酸羧化酶啟動(dòng)子)。
[0097]合適的衰老特異性啟動(dòng)子包括在果實(shí)催熟、葉枯萎和脫落過(guò)程中活躍的番茄啟動(dòng)子、編碼半胱氨酸蛋白酶的基因的玉蜀黍啟動(dòng)子?？梢允褂煤线m的花藥特異性啟動(dòng)子。此類(lèi)啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，或可以通過(guò)已知技術(shù)發(fā)現(xiàn)；參見(jiàn)例如，Bhalla和Singh(1999)Molecular control of male fertility in Brassica, Proc.1Oth Annual RapeseedCongress, Canberra, Australia ；van Tunen 等人(1990) Pollen-and anther-specific chipromoters from petunia:tandem promoter regulat1n of the chiA gene.Plant Cell2:393-40 ;Jeon 等人(1999) Isolat1n and characterizat1n of an anther-specificgene, RA8, from rice(Oryza sativa L).Plant Molecular B1logy 39:35-44;和Twell 等人(1993)Activat1n and developmental regulat1n of an Arabidopsisanther-specific promoter in microspores and pollen of Nicotiana tabacum.Sex.Plant Reprod.6:217-224。
[0098]可以選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的根優(yōu)選啟動(dòng)子。參見(jiàn)例如，Hire等人(1992) Plant Mol.B1l.20(2): 207-218 (大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和 Baumgartner (1991)Plant Cell 3 (10): 1051-1061 (在菜豆的 GRP 1.8 基因中的根特異性控制元件)；Sanger 等人(1990)Plant Mol.B1l.14(3):433-443 (根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動(dòng)子)；和Miao等人(1991)Plant Cell 3 (I): 11-22 (編碼細(xì)胞溶質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長(zhǎng)cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達(dá))。還參見(jiàn)Bogusz等人(1990) Plant Cell 2 (7): 633-641，其中描述了從來(lái)自固氮的非豆科Parasponia andersonii和相關(guān)非固氮的非豆科山黃麻(Trematomentosa)的血紅蛋白基因中分離的2種根特異性啟動(dòng)子。
[0099]合適的種子優(yōu)選啟動(dòng)子包括種子特異性啟動(dòng)子(這些啟動(dòng)子在種子發(fā)育過(guò)程中活躍，例如種子儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子)和種子發(fā)芽啟動(dòng)子(這些啟動(dòng)子在種子發(fā)芽過(guò)程中活躍)。參見(jiàn)例如，通過(guò)引用合并入本文的Thompson等人(1989)B1Essays 10:108。此類(lèi)種子優(yōu)選啟動(dòng)子包括但不限于，Ciml (細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的信使)；cZ19Bl(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；milps (肌-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2也稱(chēng)為Zm-40(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6, 403, 862) ;nuclc (美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，407，315);和 celA (纖維素合酶)(參見(jiàn) WO 00/11177)。Y -玉米醇溶蛋白是胚乳特異性啟動(dòng)子。Glob-1是胚胎特異性啟動(dòng)子。對(duì)于雙子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于豆β_菜豆球蛋白、napin、β _伴大豆球蛋白、大豆凝集素、cruciferin等。對(duì)于單子葉植物,種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、22kDa玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、27kDa玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、g_玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、27kD.Y.-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子(例如gzw64A啟動(dòng)子，參見(jiàn)Genbank登記#S78780)、臘質(zhì)基因(waxy)啟動(dòng)子、shrunken I啟動(dòng)子、shrunken2啟動(dòng)子、球蛋白I啟動(dòng)子(參見(jiàn)Genbank登記 #L22344)、Itp2 啟動(dòng)子(Kalla，等人，Plant Journal 6:849-860(1994);美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，525，716)、ciml啟動(dòng)子(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，225，529)玉蜀黍endl和end2啟動(dòng)子(參見(jiàn)2002年12月4日提交的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，528，704和申請(qǐng)10/310，191) ;nucl啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，407，315) ；Zm40啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，403，862) ；eepl和e印2 ；lecl (美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/718，754);硫氧還蛋白H啟動(dòng)子(美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/514，123)；mlipl5啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，479，734) ；PCNA2啟動(dòng)子；和shrunken-2啟動(dòng)子。(Shaw等人，Plant Phys 98:1214-1216、1992 ;Zhong Chen 等人，PNAS US100:3525_3530、2003)。
[0100]誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括響應(yīng)病原體攻擊、缺氧情況、溫度升聞、光、干旱、寒冷溫度或高鹽濃度的啟動(dòng)子。病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括來(lái)自發(fā)病機(jī)理相關(guān)蛋白質(zhì)(PR蛋白質(zhì))的那些，其在受病原體感染后被誘導(dǎo)(例如，PR蛋白質(zhì)、SAR蛋白質(zhì)、β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶)。參見(jiàn)例如，Redolfi 等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254 ;Uknes 等人(1992)Plant Cell 4:645-656 ;和 Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:111-116。還參見(jiàn)1999年2月25日提交的名稱(chēng)為〃Inducible Maize Promoters〃的申請(qǐng),美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào) 09/257，583。
[0101]除植物啟動(dòng)子外，其他合適的啟動(dòng)子可以衍生自細(xì)菌來(lái)源(例如，章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子和衍生自Ti質(zhì)粒的其他啟動(dòng)子)，或可以衍生自病毒啟動(dòng)子(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19S RNA啟動(dòng)子、煙草花葉病毒的組成型啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒(CaMV) 1 9S和35S啟動(dòng)子、或玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子)。
[0102]術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)子”指核酸分子或核酸序列，其可以召募轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄激活因子，以通過(guò)增加啟動(dòng)子活性而增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活。合適的增強(qiáng)子可以衍生自與目的天然啟動(dòng)子鄰近的區(qū)域(同源來(lái)源)，或可以衍生自非天然背景(異源來(lái)源)且與NtHMA RNAi表達(dá)載體內(nèi)的任何目的啟動(dòng)子可操作地連接，以增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性和/或組織特異性。某些增強(qiáng)子可以以就轉(zhuǎn)錄單位定向而言的任何定向起作用。例如，增強(qiáng)子可以放置在轉(zhuǎn)錄單位的上游或下游，所述轉(zhuǎn)錄單位包括啟動(dòng)子和NtHMA RNAi構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使增強(qiáng)子和啟動(dòng)子可操作地連接，以最佳化NtHMA RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄水平。
[0103]B.包括編碼NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi構(gòu)建體的RNAi表達(dá)載體
[0104]RNA干擾(“RNAi”)或RNA沉默是可以通過(guò)其而靶向特異性mRNA用于酶促降解的進(jìn)化上保守的過(guò)程。雙鏈RNA(dsRNA)必須由細(xì)胞引入或產(chǎn)生(例如，dsRNA病毒或NtHMARNAi多核苷酸)，以起始RNAi途徑。dsRNA可以通過(guò)RNA酶III轉(zhuǎn)變?yōu)?1_23bp長(zhǎng)度的多重siRNA雙鏈體(“siRNA”)，所述RNA酶III是dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(“Dicer”)。siRNA隨后可以由RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(“RISC”)識(shí)別，所述RISC通過(guò)ATP依賴(lài)性過(guò)程促進(jìn)siRNA的解鏈。siRNA展開(kāi)的反義鏈將激活的RISC引導(dǎo)至被靶向的mRNA(例如，NtHMARNA變體)，所述被靶向的mRNA包括與siRNA反義鏈互補(bǔ)的序列。被靶向的mRNA和反義鏈可以形成A型螺旋，并且A型螺旋的大溝可以被激活的RISC識(shí)別。靶mRNA可以被激活的RISC在由siRNA鏈的5’末端的結(jié)合位點(diǎn)限定的單個(gè)位點(diǎn)處切割。激活的RISC可以再循環(huán)以催化另一個(gè)切割單位。
[0105]圖2A舉例說(shuō)明示例性NtHMA RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建。在圖2A中，“S I”指構(gòu)建過(guò)程的步驟I并且“S II”指步驟II。多個(gè)實(shí)施方案涉及包括編碼NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，通過(guò)減少NtHMA mRNA、NtHMA mRNA前體和相關(guān)NtHMA RNA變體的表達(dá)水平來(lái)顯示RNA干擾活性。表達(dá)載體包括放置在NtHMA RNAi構(gòu)建體上游并且與之可操作地連接的啟動(dòng)子，如下文進(jìn)一步定義的。NtHMA RNAi表達(dá)載體包括合適的最低限度的核心啟動(dòng)子，目的NtHMA RNAi構(gòu)建體，上游(5’)調(diào)節(jié)區(qū)，下游(3’)調(diào)節(jié)區(qū)包括轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號(hào)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他序列，例如各種選擇標(biāo)記。
[0106]NtHMA多核苷酸可以以各種形式產(chǎn)生，包括作為雙鏈發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)(“dsRNAi”)。NtHMA dsRNAi可以酶促轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈NtHMA siRNA。NtHMA siRNA雙鏈體的鏈之一可以對(duì)靶NtHMA mRNA和相關(guān)NtHMA RNA變體內(nèi)的互補(bǔ)序列退火。siRNA/mRNA雙鏈體由RISC識(shí)別，所述RISC可以以序列依賴(lài)性方式在多重位點(diǎn)處切割NtHMA RNA，導(dǎo)致靶NtHMA mRNA和相關(guān)NtHMA RNA變體的降解。
[0107]圖2B舉例說(shuō)明作為由示例性NtHMA RNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物形成的假定雙鏈RNA雙鏈體(作為“莖-環(huán)-莖”結(jié)構(gòu))的形成。在圖2B中，顯示了假定的NtHMA RNAi構(gòu)建體10，包括3個(gè)雙鏈DNA片段，例如片段1-3。箭頭I指示RNAi構(gòu)建體的形成，箭頭II轉(zhuǎn)錄，并且箭頭III dsRNA的形成。片段I放置在片段2上游并且與之可操作地連接，所述片段2放置在片段3上游并且與之可操作地連接，對(duì)于其DNA鏈/序列4、6和8串聯(lián)連接在一起以形成鏈11，如所示的。備選地，NtHMA RNAi構(gòu)建體包括“正義序列” 5，所述“正義序列” 5放置在“間隔物序列” 7上游并且與之可操作地連接，所述“間隔物序列” 7放置在“反向互補(bǔ)序列”9上游并且與之可操作地連接。鏈/序列5、7和9可以串聯(lián)連接在一起以形成鏈/序列12。備選地，NtHMA RNAi構(gòu)建體包括“正義序列”8，所述“正義序列”8放置在“間隔物序列”6上游并且與之可操作地連接，所述“間隔物序列”6放置在“反向互補(bǔ)序列”4上游并且與之可操作地連接。鏈/序列8、6和4可以串聯(lián)連接在一起以形成鏈/序列11。鏈12與鏈11互補(bǔ)。鏈11是可以轉(zhuǎn)錄成NtHMA RNAi多核苷酸13的模板鏈。NtHMA RNAi多核苷酸13形成發(fā)夾(“莖-環(huán)-莖”)結(jié)構(gòu)，其中莖16是起因于NtHMA RNAi多核苷酸15的分子內(nèi)堿基對(duì)相互作用的互補(bǔ)區(qū)，并且環(huán)17代表由間隔物序列例如鏈/序列6或7編碼的非互補(bǔ)區(qū)。
[0108]任何目的NtHMA RNA多核苷酸都可以通過(guò)選擇用于產(chǎn)生NtHMA發(fā)夾雙鏈體的合適序列組成、環(huán)尺寸和莖長(zhǎng)度而產(chǎn)生。用于設(shè)計(jì)發(fā)夾雙鏈體的莖長(zhǎng)度的合適范圍包括20-30個(gè)核苷酸、30-50個(gè)核苷酸、50-100個(gè)核苷酸、100-150個(gè)核苷酸、150-200個(gè)核苷酸、200-300個(gè)核苷酸、300-400個(gè)核苷酸、400-500個(gè)核苷酸、500-600個(gè)核苷酸、和600-700個(gè)核苷酸的莖長(zhǎng)度。如果發(fā)夾雙鏈體的莖長(zhǎng)度是基本的，那么用于設(shè)計(jì)發(fā)夾雙鏈體的環(huán)長(zhǎng)度的合適范圍包括4-25個(gè)核苷酸、25-50個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)的環(huán)長(zhǎng)度。在特定背景下，具有長(zhǎng)于21個(gè)核苷酸的雙鏈體區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)有效的siRNA指導(dǎo)的沉默，與環(huán)序列和長(zhǎng)度無(wú)關(guān)。
[0109]用于下調(diào)NtHMA基因(SEQ ID NO:1)和其他NtHMA相關(guān)基因的表達(dá)水平的示例性NtHMA RNAi構(gòu)建體包括下述:
[0110]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMARNAi構(gòu)建體包括下述中的一種或多種:內(nèi)含子I (SEQ ID NO:4)、外顯子I (SEQ ID N0:5)、內(nèi)含子 2 (SEQ ID NO: 6)、外顯子 2 (SEQ ID NO: 7)、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO: 8)、外顯子 3 (SEQ IDNO: 9)、內(nèi)含子 4 (SEQ ID NO: 10)、外顯子 4 (SEQ ID NO: 11)、內(nèi)含子 5 (SEQ ID N0:12)、外顯子 5 (SEQ ID NO: 13)、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO: 14)、外顯子 6 (SEQ ID NO: 15)、內(nèi)含子 7 (SEQ IDNO: 16)、外顯子 7 (SEQ ID NO: 17)、內(nèi)含子 8 (SEQ ID NO: 18)、外顯子8 (SEQ ID N0:19)、內(nèi)含子9(SEQ ID NO:20)、外顯子9(SEQ ID NO:21)、內(nèi)含子 10(SEQ ID NO:22)、外顯子 10 (SEQ IDNO: 23)、內(nèi)含子 11 (SEQ ID NO: 24、外顯子 11 (SEQ ID NO: 25)、和內(nèi)含子 12 (SEQ ID NO: 26),其片段及其變體。
[0111]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體:與選自下述的序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的 NtHMA RNAi 構(gòu)建體:外顯子I (SEQ ID NO:5)、外顯子I (SEQ ID NO:5)的片段、外顯子2 (SEQ ID NO:7)、外顯子2 (SEQ ID NO:7)的片段、外顯子3 (SEQ ID NO:9)、外顯子3 (SEQ ID NO:9)的片段、外顯子4 (SEQ ID NO: 11)、外顯子4 (SEQ ID NO: 11)的片段、外顯子5 (SEQ ID NO: 13)、外顯子 5 (SEQ ID NO: 13)的片段、外顯子 6 (SEQ ID NO: 15)、外顯子 6 (SEQ ID NO:15)的片段、外顯子7 (SEQ ID NO: 17)、外顯子7 (SEQ ID NO: 17)的片段、外顯子8 (SEQ ID NO: 19)、外顯子 8 (SEQ ID NO: 19)的片段、外顯子 9 (SEQ ID NO:21)、外顯子 9 (SEQ ID NO:21)的片段、外顯子 10 (SEQ ID NO:23)、外顯子 10 (SEQ ID NO:23)的片段、外顯子 11 (SEQ ID NO:25)、和外顯子11 (SEQ ID NO:25)的片段。
[0112]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體:編碼能夠自身退火以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi構(gòu)建體，其中RNAi構(gòu)建體包括(a)與SEQID NO:3 或 47 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的第一序列；(b)編碼形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)的NtHMA RNAi多核苷酸的間隔物元件的第二序列；和(c)以與第一序列相同的方向放置、包括第一序列的反向互補(bǔ)序列的第三序列，其中第二序列放置在第一序列和第三序列之間，并且第二序列與第一序列和第三序列可操作地連接。
[0113]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體:編碼能夠自身退火以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi構(gòu)建體，其中RNAi構(gòu)建體包括(a)與SEQID NO:3 或 47 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的第一序列；(b)編碼形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)的NtHMA RNAi多核苷酸的間隔物元件的第二序列；和(c)以與第一序列相同的方向放置、包括第一序列(SEQ ID N0:46或SEQ IDNO:48)的反向互補(bǔ)序列的第三序列，其中第二序列放置在第一序列和第三序列之間，并且第二序列與第一序列和第三序列可操作地連接。
[0114]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體:包括與SEQ ID NO:3或SEQID NO:3的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%、98%和99%序列同一性的第一序列的NtHMA RNAi構(gòu)建體。多個(gè)實(shí)施方案涉及包括NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMA RNAi構(gòu)建體包括與SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:47的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的第一序列。
[0115]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體:包括與選自下述的序列具有“基本相似性”，或具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的第二序列的NtHMA RNAi構(gòu)建體:內(nèi)含子I (SEQ ID NO:4)、內(nèi)含子I (SEQ IDNO:4)的片段、內(nèi)含子2 (SEQ ID NO:6)、內(nèi)含子2 (SEQ ID NO:6)的片段、內(nèi)含子3 (SEQ IDNO:8)、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO:8)的片段、內(nèi)含子4 (SEQ ID NO: 10)、內(nèi)含子4 (SEQ ID NO:10)的片段、內(nèi)含子5 (SEQ ID NO: 12)、內(nèi)含子5 (SEQ ID NO:12)的片段、內(nèi)含子6 (SEQ ID NO:14)、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO: 14)的片段、內(nèi)含子 7 (SEQ ID NO: 16)、內(nèi)含子 7 (SEQ ID NO:16)的片段、內(nèi)含子8 (SEQ ID NO: 18)、內(nèi)含子8 (SEQ ID NO:18)的片段、內(nèi)含子9 (SEQ ID NO:20)、內(nèi)含子 9 (SEQ ID NO:20)的片段、內(nèi)含子 10 (SEQ ID NO:22)、內(nèi)含子 10 (SEQ ID NO:
22)的片段、內(nèi)含子11 (SEQ ID NO:24)、內(nèi)含子11 (SEQ ID NO:24)的片段、內(nèi)含子12 (SEQID NO:26)、和內(nèi)含子12 (SEQ ID NO:26)的片段。備選地，可以隨機(jī)產(chǎn)生NtHMA RNAi構(gòu)建體的第二序列，而不利用衍生自NtHMA基因(SEQ ID NO: I)的內(nèi)含子序列。
[0116]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體:包括與SEQ ID NO:46或SEQID NO:46的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%、98%和99%序列同一性的第三序列的NtHMA RNAi構(gòu)建體。多個(gè)實(shí)施方案涉及包括NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMA RNAi構(gòu)建體包括與SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:48的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的第三序列。
[0117]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體:包括與選自下述的反向互補(bǔ)序列具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的第三序列的NtHMA RNAi構(gòu)建體:SEQ ID NO:27(外顯子I)、SEQ IDNO:27(外顯子I)的片段、SEQ ID NO:28 (外顯子2)、SEQ ID NO:28(外顯子2)的片段、SEQ ID NO:29(外顯子 3)、SEQ ID NO:29(外顯子 3)的片段、SEQ ID NO:30(外顯子 4)、SEQ ID NO:30(外顯子 4)的片段、SEQ ID NO:31 (外顯子 5)、SEQ ID NO:31(外顯子 5)的片段、SEQ ID NO:32(外顯子 6)、SEQ ID NO:32(外顯子 6)的片段、SEQ ID NO:33(外顯子 7)、SEQ ID NO:33(外顯子 7)的片段、SEQ ID NO:34(外顯子 8)、SEQ ID NO:34(外顯子8)的片段、SEQ ID NO:35(外顯子9)、SEQ ID NO:35(外顯子9)的片段、SEQ ID NO:36 (外顯子 10), SEQ ID NO:36(外顯子 10)的片段、SEQ ID NO:37 (外顯子 11)、和 SEQ IDNO:37(外顯子11)的片段。
[0118]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMARNAi構(gòu)建體包括:SEQ ID NO:38( “正義序列/片段”)、包括SEQ ID NO:39的第二序列(“間隔物序列/片段”)和包括SEQ ID NO:40的第三序列(“反義序列/片段”)。
[0119]多個(gè)實(shí)施方案涉及包括NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMARNAi構(gòu)建體包括:SEQ ID NO:42( “正義序列/片段”)、包括SEQ ID NO:43的第二序列(“間隔物序列/片段”)和包括SEQ ID NO:44的第三序列(“反義序列/片段”)。
[0120]備選地，所公開(kāi)的序列可以用于構(gòu)建不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的多種NtHMA多核苷酸。例如，NtHMA長(zhǎng)雙鏈RNA可以通過(guò)下述形成:(I)通過(guò)與第一個(gè)啟動(dòng)子可操作地連接轉(zhuǎn)錄NtHMAcDNA的第一條鏈，和(2)通過(guò)與第二個(gè)啟動(dòng)子可操作地連接轉(zhuǎn)錄NtHMA cDNA片段的第一條鏈的反向互補(bǔ)序列。NtHMA多核苷酸的每條鏈可以由相同表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，或由不同表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。具有RNA干擾活性的NtHMA RNA雙鏈體可以酶促轉(zhuǎn)變?yōu)閟iRNAs，以減少NtHMA RNA 水平。
[0121]C.通過(guò)共抑制用于減少NtHMA基因表達(dá)的表達(dá)載體
[0122]提供了通過(guò)促進(jìn)NtHMA基因表達(dá)的共抑制用于減少關(guān)于NtHMA基因家族成員的內(nèi)源表達(dá)水平的多種組合物和方法。共抑制現(xiàn)象由于將轉(zhuǎn)基因的多個(gè)拷貝引入植物細(xì)胞宿主內(nèi)而發(fā)生。轉(zhuǎn)基因的多個(gè)拷貝的整合可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因和所靶向的內(nèi)源基因的表達(dá)減少。共抑制的程度依賴(lài)于轉(zhuǎn)基因和所靶向的內(nèi)源基因之間的序列同一性程度。內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因的沉默可以通過(guò)所沉默的基因座(即，內(nèi)源啟動(dòng)子和內(nèi)源目的基因)的廣泛甲基化而發(fā)生，所述所沉默的基因座可以排除轉(zhuǎn)錄。備選地，在某些情況下，內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因的共抑制可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(“PTGS”)而發(fā)生，其中可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物但增強(qiáng)的降解率排除轉(zhuǎn)錄物的累積。關(guān)于通過(guò)PTGS共抑制的機(jī)制被認(rèn)為類(lèi)似RNA干擾，因?yàn)镽NA看起來(lái)是這些過(guò)程中的重要起始因子和靶，并且可以至少部分通過(guò)相同分子機(jī)制介導(dǎo)，可能通過(guò)RNA引導(dǎo)的mRNAs降解。
[0123]NtHMA基因家族成員的共抑制可以通過(guò)將作為轉(zhuǎn)基因的NtHMA cDNA或其片段的多個(gè)拷貝整合到目的植物的基因組內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)。宿主植物可以用表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述表達(dá)載體包括與NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子。多個(gè)實(shí)施方案涉及用于促進(jìn)NtHMA家族的內(nèi)源基因的共抑制的表達(dá)載體，其包括:與經(jīng)鑒定為克隆P6663 (SEQ ID NO: 3)的NtHMA cDNA或其片段，或經(jīng)鑒定為克隆P6643(SEQ ID NO:47)的NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子。多個(gè)實(shí)施方案涉及用于促進(jìn)NtHMA家族的內(nèi)源基因的共抑制的表達(dá)載體，其包括:與NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子，所述NtHMA cDNA或其片段與 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:47 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
[0124]多個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)將NtHMA cDNA或其片段的多個(gè)拷貝整合到植物基因組內(nèi)，用于減少NtHMA家族的內(nèi)源基因的表達(dá)水平的方法，所述方法包括:用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞宿主，所述表達(dá)載體包括與SEQ ID NO:3或其片段；或者SEQ ID N0:47或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子。多個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)將NtHMA cDNA或其片段的多個(gè)拷貝整合到植物基因組內(nèi)，用于減少NtHMA家族的內(nèi)源基因的表達(dá)水平的方法，所述方法包括:用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞宿主，所述表達(dá)載體包括與NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子，所述 NtHMA cDNA 或其片段與 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:47 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性。
[0125]D.通過(guò)經(jīng)由反義試劑抑制翻譯用于減少NtHMA基因表達(dá)的表達(dá)載體
[0126]提供了通過(guò)抑制NtHMA mRNA翻譯用于減少NtHMA基因家族的內(nèi)源表達(dá)水平的多種組合物和方法。宿主植物細(xì)胞可以用表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述表達(dá)載體包括:與以就啟動(dòng)子而言的反義定向放置的NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子，以使得具有與NtHMA mRNA的部分互補(bǔ)的序列的RNA多核苷酸的表達(dá)成為可能。用于抑制HMA mRNA翻譯的多種表達(dá)載體包括:與經(jīng)鑒定為克隆P6663 (SEQ ID NO: 3)的NtHMA cDNA或其片段；或經(jīng)鑒定為克隆P6643(SEQ ID NO:47)的NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子；其中NtHMA cDNA或其片段以就啟動(dòng)子而言的反義定向放置。用于抑制HMA mRNA翻譯的多種表達(dá)載體包括:與NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子，所述NtHMA cDNA或其片段與SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:47 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，其中NtHMA cDNA或其片段以就啟動(dòng)子而言的反義定向放置。反義NtHMA RNA多核苷酸的長(zhǎng)度可以改變，包括15-20個(gè)核苷酸、20-30個(gè)核苷酸、30-50個(gè)核苷酸、50-75個(gè)核苷酸、75-100個(gè)核苷酸、100-150個(gè)核苷酸、150-200個(gè)核苷酸、和200-300個(gè)核苷酸。
[0127]多個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)抑制NtHMA mRNA翻譯用于減少NtHMA家族的內(nèi)源基因的表達(dá)水平的方法，所述方法包括:用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞宿主，所述表達(dá)載體包括與經(jīng)鑒定為克隆P6663(SEQ ID NO: 3)的NtHMA cDNA或其片段；或經(jīng)鑒定為克隆P6643 (SEQ IDNO:47)的NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子，其中NtHMA cDNA或其片段以就啟動(dòng)子而言的反義定向放置。多個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)抑制NtHMA mRNA翻譯用于減少NtHMA家族的內(nèi)源基因的表達(dá)水平的方法，所述方法包括:用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞宿主，所述表達(dá)載體包括與NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動(dòng)子，所述NtHMA cDNA或其片段與SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:47 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，其中NtHMA cDNA或其片段以就啟動(dòng)子而言的反義定向放置。
[0128]E.用于減少NtHMA基因表達(dá)的其他組合物和方法
[0129]用于獲得NtHMA多核苷酸和多肽的保守變體和更趨異變體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。任何目的植物可以通過(guò)已知誘導(dǎo)誘變的多種方法進(jìn)行遺傳修飾，所述方法包括定點(diǎn)誘變、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、化學(xué)誘導(dǎo)的誘變、輻射誘導(dǎo)的誘變和其他等價(jià)方法。例如，定點(diǎn)誘變?cè)谙率鲋忻枋?例如Smith(1985) "In vitro mutagenesis, 〃Αηη.Rev.Genet.19:423-462，和其中的參考文獻(xiàn)例如 Botstein&Shortle (1985) 〃Strategies and Applicat1ns of in vitro Mutagenesis, 〃Science229:1193-1201, 和Carter (1986) "Site-directed mutagenesis, "B1chem.J.237:1-7。寡核苷酸指導(dǎo)的誘變?cè)诶?Zoller&Smith(1982)"Oligonucleotide-directed Mutagenesis usingM13-derived Vectors:an Efficient and General Procedure for the Product1n ofPoint mutat1ns in any DNA Fragment, "Nucleic Acids Res.10:6487-6500 中描述。利用修飾喊基的誘變?cè)诶鏚unkel (1985) "Rapid and Efficient Site-specific Mutagenesiswithout Phenotypic Select1n, ^Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:488-492,和 Taylor 等人(1985)〃The Rapid Generat1n of Oligonucleotide-directed Mutat1ns at HighFrequency using Phosphoroth1ate-modified DNA, ^Nucl.Acids Res.13:8765-8787中描述。利用缺口雙鏈體DNA的誘變?cè)诶鏚ramer等人(1984) 〃The Gapped DuplexDNA Approach to Oligonucleotide-directed Mutat1n Construct1n, 〃Nucl.AcidsRes.12:9441-9460)中描述。點(diǎn)錯(cuò)配誘變?cè)诶?Kramer 等人(1984) "Point MismatchRepair, "Cell 38:879-887)中描述。雙鏈斷裂誘變?cè)诶?Mandecki (1986) 〃01igonucleotide—directed Double-strand Break Repair in Plasmids of Escherichia coli:A Method for Site-specific Mutagenesis, 〃Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 83:7177-7181,和 Arnold (1993)"Protein Engineering for Unusual Environments,"CurrentOpin1n in B1technology 4:450-455)中描述。利用修復(fù)缺失型宿主菌株的誘變?cè)诶?Carter 等人(1985)"Improved Oligonucleotide Site-directed Mutagenesisusing M13Vectors, 〃Nucl.Acids Res.13:4431-4443 中描述。通過(guò)總基因合成的誘變?cè)诶?Nambiar 等人(1984) "Total Synthesis and Cloning of a Gene Coding forthe Ribonuclease S Protein, "Science 223: 1299-1301 中描述。DNA 改組在例如Stemmer(1994)"Rapid Evolut1n of a Protein in vitro by DNA Shuffling, "Nature370:389-391,和 Stemmer(1994)"DNA shuffling by random fragmentat1n andreassembly:1n Vitro Recombinat1n for Molecular Evolut1n, ^Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 91:10747-10751 中描述。
[0130]備選地，NtHMA基因可以通過(guò)將轉(zhuǎn)座子(和IS元件)引入目的植物的基因組內(nèi)而被靶向用于失活。這些活動(dòng)遺傳元件可以通過(guò)有性異體受精引入，并且插入突變體可以就NtHMA活性中的喪失例如減少的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行篩選。通過(guò)經(jīng)由例如有性異體受精使親本植物與未實(shí)施轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的誘變的植物雜交，可以將親本植物中斷裂的NtHMA基因引入其他植物內(nèi)?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)育種方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種NtHMA相關(guān)基因可以通過(guò)插入一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子被失活。突變可以導(dǎo)致一種或多種NtHMA基因的純合斷裂，一種或多種NtHMA基因的雜合斷裂，或如果斷裂超過(guò)一種NtHMA基因，那么純合和雜合斷裂的組合。合適的可轉(zhuǎn)座元件可以選自指定為類(lèi)別I和類(lèi)別II的2個(gè)廣泛類(lèi)別。合適的類(lèi)別I可轉(zhuǎn)座元件包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄子和SINE樣元件。此類(lèi)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如在Kumar和Bennetzen (1999), Plant Retrotransposonsin Annual Review of Genetics 33:479 中描述的。
[0131]備選地，NtHMA基因可以通過(guò)稱(chēng)為 Targeting Induced Local Les1ns INGenomics ("TILLING")的方法而被靶向用于失活，所述方法使高密度點(diǎn)突變與突變的快速靈敏檢測(cè)相組合。一般地，使植物種子暴露于誘變劑例如乙基甲磺酸(EMS)或EMS烷基化物鳥(niǎo)嘌呤，這一般導(dǎo)致錯(cuò)配。合適的試劑和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如在下述中描述的:McCallum 等人，(2000), "Targeting Induced Local Les1ns IN Genomics (TILLING)for Plant Funct1nal Genomics, "Plant Phys1logy 123:439-442 ;McCallum 等人，(2000)"Targeted screening for induced mutat1ns,^Nature B1technology18:455-457 ;和 Colbert 等人，(2001) 〃High-Throughput Screening for Induced PointMutat1ns, "Plant Phys1logy 126:480-484。
[0132]備選地，NtHMA基因可以通過(guò)引入衍生自許多小環(huán)狀RNA的核酶而被靶向用于失活，所述小環(huán)狀RNA能夠在植物中自切割和復(fù)制。這些RNA可以單獨(dú)(類(lèi)病毒RNAs)或與輔助病毒(衛(wèi)星RNA) —起復(fù)制。合適RNA的例子包括衍生自鱷梨日斑病類(lèi)病毒的那些，以及衍生自煙草環(huán)斑病毒、紫花苜蓿短暫條紋病毒、絨毛煙草斑駁病毒、茄屬植物斑駁病毒、和地下三葉草斑駁病毒的衛(wèi)星RNA。各種靶RNA特異性核酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如在Haseloff 等人(1988) Nature, 334:585-591 中描述的。
[0133]II1.包括NtHMA RNAi多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞系和種子及相關(guān)方法
[0134]多個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)多種方法進(jìn)行遺傳修飾以減少NtHMA基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，所述方法可以用于沉默NtHMA基因表達(dá)，并且因此產(chǎn)生其中NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平可以在目的植物組織內(nèi)減少的轉(zhuǎn)基因植物。重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的速率和重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)特別地鎘轉(zhuǎn)運(yùn)的分布模式可以在根據(jù)所公開(kāi)的方法和組合物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物中改變。適合于遺傳修飾的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
[0135]多個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行遺傳修飾以減少NtHMA基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述方法可以用于下調(diào)NtHMA基因表達(dá)，并且因此產(chǎn)生其中NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平可以在目的植物組織內(nèi)減少的轉(zhuǎn)基因煙草植物。已提供多種表達(dá)載體，以產(chǎn)生顯示NtHMA基因表達(dá)水平減少的任何變種的煙草轉(zhuǎn)基因品系。所公開(kāi)的組合物和方法可以應(yīng)用于任何目的植物物種，包括煙草屬(Nicotiana)的植物，煙草屬的多個(gè)物種，包括黃花煙草(N.rustica)和紅花煙草(N.tabacum)(例如LAB21、LN KY17U TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1 和 Petico)。其他物種包括花煙草(N.acaulis)、尖葉腎厳(N.acuminata)、尖葉腎厳細(xì)葉變種(N.acuminatavar.multiflora)、N.africana、紅豬籠草(N.alata)、N.amplexicaulis、N.arentsi1、漸狹葉煙草(N.attenuata)、N.benavidesi1、本氏煙草(N.benthamiana)、N.bigelovi1、N.bonariensis、N.cavicola、克氏煙草(N.clevelandii)、N.cordifolia、N.corymbosa、德氏煙草(N.debneyi)、N.excels1r> 福氏煙草(N.forgetiana)、N.fragrans>N.glauca、粘煙草(N.glutinosa)、N.goodspeedi1、N.gosse1、N.hybrid、N.1ngulba、N.kawakamii> N.knightiana、N.langsdorffi1、漸尖葉煙草(N.linearis)、N.longiflora、N.maritima、N.megalosiphon、N.miersi1、N.noctiflora、N.nudicaulis、N.0btusifolia、N.0ccidentalism N.0ccidentalis subsp.hesperis、耳狀煙草(N.0tophora)、N.paniculata、N.pauciflora、碧冬煙草(N.petun1ides)、N.plumbaginifolia、N.quadrivalvis、N.raimondi1、N.repanda、N.rosulata、N.rosulata subsp.1ngulba、N.rotundifolia、N.setchelli1、N.simulans、N.solanifolia、N.spegazzini1、斯氏煙草(N.stocktonii)、香甜煙草(N.suaveolens)、美花煙草(N.sylvestris)、N.thyrsiflora>絨毛煙草(N.tomentosa)、擬鸞花煙草(N.tomentosiformis)、N.trigonophylla、N.umbratica、波葉煙草(N.undulata)、N.velutina、N.wigand1ides 和 N.x sanderae。用于轉(zhuǎn)化的合適植物包括能夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知轉(zhuǎn)化植物的多種方法轉(zhuǎn)化的任何植物組織，所述方法包括電穿孔、微粒轟擊和土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，如例如在下述中描述的:公開(kāi)了用包含Ti質(zhì)粒的土壤桿菌屬菌株用于轉(zhuǎn)化敏感植物包括雙子葉植物的方法的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，459，355 ;公開(kāi)了用土壤桿菌屬載體轉(zhuǎn)化木本植物的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，795，855 ;公開(kāi)了二元土壤桿菌屬載體的；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，940，838，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，945，050 ;和美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，015，580。
[0136]多個(gè)實(shí)施方案涉及經(jīng)遺傳修飾以?xún)?nèi)源表達(dá)編碼NtHMA RNAi多核苷酸的RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述NtHMA RNAi多核苷酸促進(jìn)NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物的降解，并且隨后減少可用于翻譯成NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目。多個(gè)實(shí)施方案涉及包括表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物，所述表達(dá)載體使得根據(jù)所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的NtHMA多核苷酸的表達(dá)成為可能。多個(gè)實(shí)施方案涉及衍生自根據(jù)所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞系。多個(gè)實(shí)施方案涉及衍生自根據(jù)所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。
[0137]多個(gè)實(shí)施方案涉及用于減少植物中的NtHMA基因表達(dá)水平的方法，所述方法包括減少NtHMA基因的表達(dá)水平，這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來(lái)完成。作為例子，本公開(kāi)內(nèi)容描述了:(1)通過(guò)表達(dá)NtHMA RNAi多核苷酸，用于減少可用于翻譯的內(nèi)源NtHMA RNA變體的穩(wěn)態(tài)水平的RNA干擾方法；(2)通過(guò)將作為轉(zhuǎn)基因的NtHMA cDNA或其片段的多個(gè)拷貝整合到植物基因組內(nèi)，用于減少一種或多種NtHMA基因轉(zhuǎn)錄的共抑制方法；
(3)通過(guò)表達(dá)反義多核苷酸用于減少NtHMA翻譯的反義方法，所述反義多核苷酸可以靶向NtHMA RNA;和⑷用于誘導(dǎo)誘變的多種方法。
[0138]多個(gè)實(shí)施方案涉及這樣的轉(zhuǎn)基因煙草植物，其通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行遺傳修飾以減少NtHMA基因表達(dá)水平，并且進(jìn)一步進(jìn)行修飾以減少第二種目的內(nèi)源基因(即非NtHMA相關(guān)的)的表達(dá)，或增強(qiáng)目的外源基因(即非NtHMA相關(guān)的)的表達(dá)。例如，編碼涉及生物堿生物合成的酶的第二種目的內(nèi)源基因的下調(diào)可能是希望的。在其他情況下，編碼目的重組蛋白質(zhì)例如用于治療用途的人激素的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平中的增強(qiáng)可能是希望的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，其可以進(jìn)行修飾例如以外源表達(dá)NtHMA RNAi多核苷酸和至少一種目的重組基因產(chǎn)物例如重組人生長(zhǎng)因子，或可以靶向與NtHMA家族不相關(guān)的第二種目的基因的RNAi多核苷酸。
[0139]根據(jù)所公開(kāi)的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物提供了許多優(yōu)點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因植物包括轉(zhuǎn)基因煙草植物可以在包含可變Cd濃度的土壤中或在包含小于所需Cd濃度的土壤中生長(zhǎng)。這些轉(zhuǎn)基因植物和衍生種子可以提供用于在更廣泛范圍的土壤環(huán)境中培養(yǎng)它們的更多選擇，這可以增加從業(yè)者(例如農(nóng)民)可獲得的可培養(yǎng)土壤量。此外，與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物相比較，顯示減少的Cd含量的這些轉(zhuǎn)基因植物可以直接作為可食用產(chǎn)物而消費(fèi)。與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物的消費(fèi)相比較，這些轉(zhuǎn)基因植物的可食用部分的消費(fèi)可以是更健康的選擇?？梢愿鶕?jù)所公開(kāi)的方法遺傳修飾的合適植物包括可用于農(nóng)業(yè)用途培養(yǎng)的植物，包括水稻、玉米、南瓜、大豆、萵苣、馬鈴薯、beats、藥草、小麥、大麥、胡蘿卜等。當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物相比較時(shí)，這些轉(zhuǎn)基因植物包括葉片部分中的Cd減少％可以是大約至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%和99%。這些轉(zhuǎn)基因植物包括葉片部分中的Cd含量是來(lái)自下述范圍的值:約0.01至約 0.05ppm、約 0.01 至約 0.lppm、約 0.01 至約 0.5ppm、約 0.01 至約 1.0ppm、和約 0.01 至約 δρρη?ο
[0140]IV.并入經(jīng)遺傳修飾以包含減少的Cd含量的煙草葉的消費(fèi)品
[0141]多個(gè)實(shí)施方案提供了轉(zhuǎn)基因植物，其中NtHMA基因家族成員的表達(dá)水平基本上減少，以減少或阻礙Cd轉(zhuǎn)移到葉片內(nèi)。衍生自根據(jù)所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉片可以并入包含Cd的多種消費(fèi)品內(nèi)，所述Cd處于基本上低于通過(guò)將衍生自相同基因型的植物的煙草葉制備的消費(fèi)品的那種的水平，所述衍生自相同基因型的植物在相同條件下生長(zhǎng)，但未就NtHMA基因家族成員的表達(dá)水平減少而言進(jìn)行遺傳修飾(“非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物”)。
[0142]在某些實(shí)施方案中，與非基因組對(duì)應(yīng)物相比較顯示減少的Cd含量的這些轉(zhuǎn)基因植物可以并入消費(fèi)品內(nèi)，包括各種可抽吸物品例如雪茄煙、香煙和無(wú)煙煙草產(chǎn)品(即不可燃的)。與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物相比較，通過(guò)并入衍生自煙草植物的煙草葉產(chǎn)生的可抽吸物品和無(wú)煙煙草產(chǎn)品可以提供更健康的選擇，所述煙草植物根據(jù)所公開(kāi)的方法進(jìn)行遺傳修飾以包含減少的Cd水平。
[0143]并入根據(jù)所公開(kāi)的方法進(jìn)行遺傳修飾的煙草植物的無(wú)煙煙草產(chǎn)品可以以適合于消費(fèi)者的口腔舒適的任何形式制造。無(wú)煙煙草產(chǎn)品包含以任何形式的煙草，包括作為沉積、混合、圍繞或以其他方式與以任何形式(例如薄片、薄膜、片劑、泡沫或珠)的其他成分相組合的干燥顆粒、碎屑、粒劑、粉劑或漿(即煙草提取物)。無(wú)煙煙草產(chǎn)品可以用材料進(jìn)行包裝，所述材料可以是可食用(即，經(jīng)口崩解的)或不可食用的。無(wú)煙煙草產(chǎn)品的液體內(nèi)含物可以以例如珠的形式封裝，以排除與水溶性包裝物的相互作用。包裝物可以作為小袋成形，以部分或完全封裝并入煙草的組合物，或充當(dāng)粘合劑以使煙草的多個(gè)片劑、珠或薄片保持在一起。包裝物也可以封裝可塑煙草組合物，其適應(yīng)消費(fèi)者的口的形狀。經(jīng)口崩解的包裝物可以封裝無(wú)煙煙草，例如作為干鼻煙或可溶煙草，并且可以在連續(xù)熱壓成形或水平形式/填充/密封設(shè)備或使用可食用薄膜(其可以包含或不包含煙草)的其他合適的包裝設(shè)備上成型。用于構(gòu)建包裝物的示例性材料包括薄膜組合物，包括HPMC、CMC、果膠、海藻酸鹽、支鏈淀粉和其他商購(gòu)可得的可食用薄膜成型聚合物。其他包裝材料可以包括由明膠、HPMCdg粉/角叉菜膠或其他商購(gòu)可得材料產(chǎn)生的預(yù)成型的膠囊。此類(lèi)包裝材料可以包括煙草作為成分。無(wú)法經(jīng)口崩解的包裝物可以由針織或非針織編織物(nonwoven fabrics)、涂層或無(wú)涂層紙、或穿孔或其他多孔塑料薄膜組成。包裝物可以并入調(diào)味劑和/或著色劑。無(wú)煙產(chǎn)品可以利用商業(yè)包裝領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與包裝物裝配在一起，包括諸如泡罩包裝和stik-包裝方法，其中小包裝可以通過(guò)垂直形式/填充/密封包裝機(jī)器成型。
[0144]當(dāng)與衍生自非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物的消費(fèi)品相比較時(shí)，通過(guò)并入衍生自經(jīng)遺傳修飾以包含減少的Cd水平的煙草植物的煙草葉產(chǎn)生的、這些可抽吸物品和無(wú)煙產(chǎn)品中的Cd減少％是至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的值。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)并入衍生自經(jīng)遺傳修飾以包含減少的Cd水平的煙草植物的煙草葉產(chǎn)生的、這些可抽吸物品和無(wú)煙產(chǎn)品中的Cd含量是來(lái)自下述范圍的值:約0.01至約0.05ppm、約0.01至約 0.lppm、約 0.01 至約 0.5ppm、約 0.01 至約 1.0ppm、和約 0.01 至約 5ppm。
[0145]植物中的Cd累積程度可以依賴(lài)于歸于基因型復(fù)雜度和生長(zhǎng)環(huán)境的幾種參數(shù)而基本上不同。例如，田間生長(zhǎng)的煙草葉中的Cd濃度可以依賴(lài)于諸如農(nóng)業(yè)氣候、土壤參數(shù)和栽培變種的因素而極端不同。此外，在煙草植物的不同部分內(nèi)的相對(duì)Cd分布模式可以根據(jù)物種、器官/組織和生長(zhǎng)條件(即田間生長(zhǎng)與水耕法生長(zhǎng)比較)而改變。平均起來(lái)，在田間生長(zhǎng)的煙草葉(包括中脈和葉脈)中測(cè)量的Cd濃度可以在約0.5至5ppm (百萬(wàn)分之，或ug/g煙草干重)的范圍內(nèi)。然而，許多公開(kāi)的Cd水平一般不限定煙草成熟階段、煙草變種或收獲用于分析的特定葉部分(即從葉柄位置切除)。在某些變種中，較低的葉可能累積比中部和較高的葉更高的Cd水平。在細(xì)胞內(nèi)水平上，Cd可以在植物細(xì)胞的各種細(xì)胞組分中發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、核和液泡。
[0146]此外，在煙草葉中測(cè)量的Cd含量可以依賴(lài)于其中煙草植物所生長(zhǎng)的土壤環(huán)境中的Cd水平而基本上改變。與在非污染區(qū)中生長(zhǎng)的遺傳上等同的對(duì)應(yīng)物的葉相比較(其可以累積約0.4至約Sppm的Cd)，在Cd污染區(qū)中生長(zhǎng)的煙草的葉可以累積約35ppm或更高的Cd。在Cd污染區(qū)中生長(zhǎng)的植物的葉內(nèi)的液泡可以累積極高的Cd濃度。用于修飾所公開(kāi)的組合物以適合于給定目的植物物種的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
實(shí)施例
[0147]實(shí)施例1
[0148]全長(zhǎng)煙草屬NtHMA基因組克隆的克隆和外顯子作圖
[0149]獨(dú)立地鑒定了代表內(nèi)源NtHMA基因的不同部分的2個(gè)部分基因組克隆，稱(chēng)為“CH0_0F96xf01.abl”和“CH0_0F261xo09cl.abl”?；诘米圆糠只蚪M克隆的序列信息，隨后鑒定了全長(zhǎng)基因組克隆(_H0-18-2)和4個(gè)全長(zhǎng)NtHMA cDNA，包括克隆P6663 (SEQ ID NO: 3)和克隆P6643(SEQ ID N0:47)。繪制了全長(zhǎng)基因組克隆(_Η0_18_2) (17，921bp)的外顯子和內(nèi)含子亞區(qū)的圖。如圖1中所示，從煙草屬中克隆的全長(zhǎng)內(nèi)源NtHMA基因包括由總共3392個(gè)核苷酸組成的11個(gè)外顯子。
[0150]實(shí)施例2
[0151]編碼RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi表達(dá)載體PBI121-NtHMA (660-915)的構(gòu)建
[0152]表1提供了對(duì)經(jīng)分離的NtHMA基因組克隆(SEQ ID NO: I)內(nèi)的每個(gè)外顯子作圖的核苷酸位置列表。
[0153]表1

【權(quán)利要求】
1.用于減少植物的至少部分中的Cd水平的方法，包括通過(guò)減少重金屬ATP酶(HMA)基因表達(dá)和/或HMA基因產(chǎn)物活性來(lái)修飾所述植物，其中所述修飾或未修飾形式的HMA基因選自: 包括這樣的序列或由這樣的序列組成且編碼具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，所述序列與SEQ ID NO:1具有至少70%序列同一性； 包括這樣的序列或由這樣的序列組成的基因，所述序列與SEQ ID NO:3具有至少70%序列同一性； 包括這樣的序列或由這樣的序列組成的基因，所述序列與SEQ ID NO:47具有至少70%序列同一性； 包括編碼這樣的多肽的序列或由編碼這樣的多肽的序列組成的基因，所述多肽與SEQID NO:2具有至少70%序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；和 包括編碼這樣的多肽的序列或由編碼這樣的多肽的序列組成的基因，所述多肽與SEQID NO:49具有至少70%序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
2.用于減少植物的至少部分中的Cd水平的方法，包括減少植物中重金屬ATP酶(HMA)基因表達(dá)和/或HMA基因產(chǎn)物活性，其中所述修飾或未修飾形式的HMA基因編碼與SEQ IDNO:2或49具有至少70%序列同一性或至少95%序列同一性的多肽，并且其中所述多肽具有PlB型ATP酶活性。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中減少HMA基因表達(dá)和/或HMA基因產(chǎn)物活性是通過(guò)對(duì)HMA基因的誘變的修飾而實(shí)現(xiàn)的。
4.權(quán)利要求3的方法，其中對(duì)HMA基因的誘變是通過(guò)定點(diǎn)誘變、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、化學(xué)誘導(dǎo)的誘變或輻射誘導(dǎo)的誘變而實(shí)現(xiàn)的。
5.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中減少HMA基因表達(dá)和/或HMA基因產(chǎn)物活性是通過(guò)對(duì)HMA基因的失活的修飾而實(shí)現(xiàn)的。
6.權(quán)利要求5的方法，其中失活是通過(guò)將轉(zhuǎn)座子和/或插入序列(IS)元件引入植物的基因組內(nèi)、通過(guò)Targeting Induced Local Les1ns IN Genomics ("TILLING")或通過(guò)引入靶RNA特異性核酶而實(shí)現(xiàn)的。
7.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中減少HMA基因表達(dá)和/或HMA基因產(chǎn)物活性是通過(guò)引起RNAi構(gòu)建體的表達(dá)而減少所述植物中的NtHMA mRNA水平而實(shí)現(xiàn)的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述RNAi構(gòu)建體包括: 與SEQ ID NO:3或47的部分具有至少90%序列同一性的第一序列； 第二序列；和 以與所述第一序列相同的定向放置、具有所述第一序列的反向互補(bǔ)序列的第三序列， 其中所述第二序列放置在所述第一序列和所述第三序列之間，并且所述第二序列與所述第一序列和所述第三序列可操作地連接。
9.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，還包括在修飾植物之后，就減少的HMA基因表達(dá)和/或HMA基因產(chǎn)物活性進(jìn)行篩選的步驟。
10.權(quán)利要求9的方法，包括就減少的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)和/或降低的Cd水平進(jìn)行篩選。
11.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是煙草。
12.根據(jù)權(quán)利要求1一 11中任一項(xiàng)獲得的或可獲得的修飾的植物，并且由于重金屬ATP酶(HMA)基因表達(dá)和/或HMA基因產(chǎn)物活性的減少，與未修飾的植物的部分相比，所述修飾的植物在其至少部分中具有降低的Cd水平。
13.權(quán)利要求12的修飾的植物，其中葉具有降低的Cd水平。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的修飾的植物，其中所述植物是煙草。
15.可消費(fèi)煙草產(chǎn)品，其并入從權(quán)利要求14的修飾的植物中收獲的葉，其中由于重金屬ATP酶(HMA)基因表達(dá)和/或HMA基因產(chǎn)物活性的減少，與未修飾的植物的葉相比，所述葉具有降低的Cd水平。
16.權(quán)利要求15的產(chǎn)品，其中Cd減少％是至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的值。
17.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的產(chǎn)品，其中所述Cd含量是約0.01至約0.05ppm、約.0.01至約0.lppm、約0.01至約0.5ppm、約0.01至約1.0ppm、或約0.01至約5ppm的值。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104131030SQ201410370663
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月13日
【發(fā)明者】A·哈耶斯, C·庫(kù)蒂斯普迪, R·范德霍文 申請(qǐng)人:菲利普莫里斯生產(chǎn)公司