專利名稱：就減少的鎘轉(zhuǎn)運進(jìn)行修飾的轉(zhuǎn)基因植物、衍生產(chǎn)物和相關(guān)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
組合物、表達(dá)載體、多核苷酸、多肽、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因種子、以 及制備且使用這些實施方案以產(chǎn)生可以減少重金屬轉(zhuǎn)運到氣生部分內(nèi)的各種植物的方法。與相關(guān)申請的交叉參照本申請要求于2007年12月13日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/996，982的優(yōu)先 權(quán)，所述美國臨時專利申請?zhí)柕耐暾麅?nèi)容通過引用在此合并。
背景技術(shù)：
植物通過各種轉(zhuǎn)運機制從其環(huán)境中吸收金屬離子底物而獲得必需重金屬，例如 Zn、Ni和Cu，所述轉(zhuǎn)運機制由在根細(xì)胞和各種維管組織的表面上表達(dá)的膜轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)。 分類為P型ATP酶例如PlB型ATP酶的轉(zhuǎn)運蛋白，是通過利用從放能ATP水解反應(yīng)釋放的 能量轉(zhuǎn)移帶正電的底物穿過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運蛋白。PlB型ATP酶也稱為重金屬ATP酶(“HMA”) 或CPx型ATP酶。HMA已通過底物特異性分成2個亞類，Cu/Ag和Zn/Co/Cd/Pb組。在植物 中表征的第一種PlB型ATP酶是從擬南芥屬(Arabidopsis)中克隆的AtHMA4。通過HMAs 的底物特異性并不嚴(yán)格限制于必需金屬的轉(zhuǎn)運，因為幾種非必需金屬可以無差別地識別為 底物，導(dǎo)致許多非必需金屬例如Cd、Pb、As和Hg的累積。發(fā)明概述本發(fā)明的多個方面涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物包括轉(zhuǎn)基因煙草植物的組合物和方 法，所述轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)遺傳修飾以通過減少HMA家族的轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)水平而阻礙從根系 到葉片(leaf lamina)的鎘(Cd)轉(zhuǎn)運。HMA同系物(“NtHMA”)已在煙草中得到鑒定，其可 以用于構(gòu)建多種RNAi構(gòu)建體，編碼可以促進(jìn)內(nèi)源NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物降解的目的NtHMA RNAi 多核苷酸?？梢员磉_(dá)根據(jù)本發(fā)明的NtHMARNAi多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物可以用于減少NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)水平，并且因 此用于減少可用于轉(zhuǎn)運金屬穿過細(xì)胞膜的功能活性NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)目。本發(fā)明的其他方面涉及包括多種NtHMA RNAi構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，經(jīng)遺傳修飾 以內(nèi)源表達(dá)NtHMA RNAi多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物和種子，衍生自轉(zhuǎn)基因植物和種子的細(xì)胞 系，和并入衍生自根據(jù)所公開方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的葉的消費品。根據(jù)本發(fā)明，在一個方面提供了選自下述的經(jīng)分離的多核苷酸包括這樣的序列或由這樣的序列組成且編碼具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn) 運蛋白的多核苷酸，所述序列與SEQ ID NO :1具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70%序列同一性；包括這樣的序列或由這樣的序列組成的多核苷酸，所述序列與SEQ ID N0:3具有 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%序 列同一性，例如至少70%序列同一性；包括這樣的序列或由這樣的序列組成的多核苷酸，所述序列與SEQ ID NO :47具有 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%序
5列同一性，例如至少70%序列同一性；包括編碼這樣的多肽的序列或由編碼這樣的多肽的序列組成的多核苷酸，所述 多肽與 SEQ ID NO :2 具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %序列同一性，例如至少70 %序列同一性，其中所述多肽是具有PlB 型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白；和包括編碼這樣的多肽的序列或由編碼這樣的多肽的序列組成的多核苷酸，所述多 肽與 SEQ ID NO :49 具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %序列同一性，例如至少70 %序列同一性，其中所述多肽是具有PlB 型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白。本發(fā)明的經(jīng)分離的多核苷酸可以在高嚴(yán)格條件下與這樣的核酸分子雜交，所述核 酸分子包括SEQ ID NO :1、3或47或SEQ ID NO :1、3或47的互補序列或由SEQ ID NO :1、 3或47或SEQ ID NO :1、3或47的互補序列組成。本發(fā)明的另一個方面是包括如本文所定義的經(jīng)分離的多核苷酸的表達(dá)載體。還提供的是通過這樣的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物，所述方法包括引入如本文所定義 的經(jīng)分離的多核苷酸或如本文所定義的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因植物可以是例如煙草植物。進(jìn)一步提供的是通過這樣的方法制備的細(xì)胞系，所述方法包括弓I入如本文所定義 的經(jīng)分離的多核苷酸或如本文所定義的表達(dá)載體。在一個進(jìn)一步的方面，提供了并入從如本文所定義的轉(zhuǎn)基因植物中收獲的葉的可 消費煙草產(chǎn)品(例如但不限于可抽吸物品(smokingarticle)或無煙煙草制品)。在另一個方面，提供了能夠抑制它與之相對應(yīng)的NtHMA信使RNA表達(dá)的NtHMA RNAi構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括與SEQ ID NO :3 或 47 的部分具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少70%序列同一性的第一序 列；第二序列；和以與第一序列相同的定向放置的、具有第一序列的反向互補序列的第三序列，其中第二序列放置在第一序列和第三序列之間，并且第二序列與第一序列和第三 序列可操作地連接。在NtHMA RNAi 構(gòu)建體中(a)第一序列可以與選自下述一個或多個的序列具有至少50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少 95%序列同一性外顯子1 (SEQ ID NO :5)、外顯子1(SEQ ID NO 5)的片段、外顯子2 (SEQ ID NO :7)、外顯子 2 (SEQ ID NO 7)的片段、外顯子 3 (SEQ ID NO :9)、外顯子 3 (SEQ ID NO: 9)的片段、外顯子4 (SEQ ID NO: 11)、外顯子4 (SEQ ID NO 11)的片段、外顯子5 (SEQ ID NO 13)、外顯子 5 (SEQ ID NO: 13)的片段、外顯子 6 (SEQ ID NO 15)、外顯子 6 (SEQ ID NO: 15)的片段、外顯子7 (SEQ ID NO: 17)、外顯子7 (SEQ ID NO 17)的片段、外顯子8 (SEQ ID NO 19)、外顯子 8 (SEQ ID NO: 19)的片段、外顯子 9 (SEQ ID NO :21)、外顯子 9 (SEQ ID NO: 21)的片段、外顯子10 (SEQ ID NO :23)、外顯子10 (SEQ ID NO 23)的片段、外顯子11 (SEQ ID NO 25)、和外顯子 11 (SEQ ID NO 25)的片段；
(b)第二序列可以與選自下述一個或多個的序列具有至少50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少 95%序列同一性內(nèi)含子1 (SEQ ID NO :4)、內(nèi)含子1(SEQ ID NO 4)的片段、內(nèi)含子2 (SEQ ID NO :6)、內(nèi)含子 2 (SEQ ID NO 6)的片段、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO :8)、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO: 8)的片段、內(nèi)含子4 (SEQ ID NO: 10)、內(nèi)含子4 (SEQ ID NO 10)的片段、內(nèi)含子5 (SEQ ID NO 12)、內(nèi)含子 5 (SEQ ID NO: 12)的片段、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO 14)、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO: 14)的片段、內(nèi)含子7 (SEQ ID NO 16)、內(nèi)含子7 (SEQ ID NO 16)的片段、內(nèi)含子8 (SEQ ID NO 18)、內(nèi)含子 8 (SEQ ID N0:18)的片段、內(nèi)含子 9 (SEQ ID NO :20)、內(nèi)含子 9 (SEQ ID NO: 20)的片段、內(nèi)含子10 (SEQ ID NO :22)、內(nèi)含子10 (SEQ ID NO 22)的片段、內(nèi)含子11 (SEQ ID NO :24)、內(nèi)含子 11 (SEQ ID NO :24)的片段、內(nèi)含子 12 (SEQ ID NO :26)、和內(nèi)含子 12 (SEQ ID NO 26)的片段；(c)第三序列可以與選自下述一個或多個的序列具有至少50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，例如至少 95%序列同一性=SEQ IDNO :27、SEQ ID NO 27 的片段、SEQ ID NO 28,SEQ ID NO 28 的片 段、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 29 的片段、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 30 的片段、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO 31 的片段、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 32 的片段、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO 33 的片段、SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 34 的片段、SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 35 的 片段、SEQ ID NO :36、SEQ IDNO 36 的片段、SEQ ID NO :37、禾口 SEQ ID NO 37 的片段；(d)第一序列可以包括SEQ ID NO 38，第二序列可以包括SEQID NO 39，并且第三 序列可以包括SEQ ID NO 40 ；(e)第一序列可以包括SEQ ID NO :42，第二序列可以包括SEQID NO :43，并且第三 序列可以包括SEQ ID NO 44 ；或(f)可以應(yīng)用(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的一個或兩個或三個。本發(fā)明還涵蓋包括啟動子的表達(dá)載體，所述啟動子放置在如本文所定義的NtHMA RNAi構(gòu)建體的上游且與之可操作地連接。啟動子可以選自組織特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟 動子和組成型啟動子。在NtHMA RNAi構(gòu)建體中，第一個和第二序列可以各自具有選自下述的長度 20-30個核苷酸、30-50個核苷酸、50-100個核苷酸、100-150個核苷酸、150-200個核苷酸、 200-300個核苷酸、300-400個核苷酸、400-500個核苷酸、500-600個核苷酸、和600-700個
核苷酸。本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是包括如本文所定義的RNAi (或NtHMA RNAi構(gòu)建體或 表達(dá)載體)的轉(zhuǎn)基因植物，其中與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物中的部分相比較，所述轉(zhuǎn)基因植物在植 物的至少部分中具有減少的Cd水平。轉(zhuǎn)基因植物可以是例如煙草植物。還提供的是并入從包括如本文所定義RNAi的轉(zhuǎn)基因植物中收獲的葉的可消費煙 草產(chǎn)品(例如但不限于可抽吸物品或無煙煙草制品)。產(chǎn)品可以具有至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的％ Cd 減少值。產(chǎn)品可以具有值為約0. 01至約0. 05ppm、約0. 01至約0. Ippm,約0. 01至約0. 5ppm、約0. 01至約1. Oppm、或約0. 01至約5ppm的Cd含量。在本發(fā)明的另一個方面，提供的是用于減少植物的至少部分中的Cd水平的方法， 其包括通過引起RNAi構(gòu)建體的表達(dá)減少植物中的NtHMA mRNA水平。對于這種方法，RNAi構(gòu)建體可以是如本文所定義的，并且特別可以包括與SEQ ID NO :3 或 47 的部分具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，例如至少90%序列同一性的第一序 列；第二序列；和以與第一序列相同的定向放置、具有第一序列的反向互補序列的第三序列，其中第二序列放置在第一序列和第三序列之間，并且第二序列與第一序列和第三 序列可操作地連接。根據(jù)該方法，在RNAi構(gòu)建體表達(dá)后，植物的部分可以具有減少至少約5%、10%、 15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的 Cd 含量。另外或備選地，在RNAi構(gòu)建體表達(dá)后，植物的部分可以具有約0. 01至約0. 05ppm、 約 0. 01 至約 0. IppmJ^] 0. 01 至約 0. 5ppm、約 0. 01 至約 1. Oppm、或約 0. 01 至約 5ppm 的 Cd含量。根據(jù)本發(fā)明的一個進(jìn)一步的方面，提供的是與SEQ ID NO :2或49具有至少50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性， 例如至少70%序列同一性或至少95%序列同一性的基本上純化的多肽，其中所述多肽是 具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白。與如本文所定義的多肽特異性結(jié)合的抗體也由本發(fā)明涵蓋，所述多肽例如包括 SEQ ID NO 2 或 49 或由 SEQ ID NO 2 或 49 組成。下文描述了本發(fā)明的進(jìn)一步和多個方面(在本文中也稱為“實施方案”)。附圖簡述

圖1是包括11個外顯子的NtHMA基因組克隆的示意圖。圖2A舉例說明用于構(gòu)建NtHMA RNAi表達(dá)載體的示例性亞克隆策略，所述NtHMA RNAi表達(dá)載體使得目的NtHMA RNAi多核苷酸的組成性表達(dá)成為可能，如實施例2中描述 的。圖2B舉例說明由NtHMA RNAi多核苷酸內(nèi)的分子內(nèi)、堿基配對相互作用形成的假 定雙鏈RNA雙鏈體(作為“莖-環(huán)-莖”結(jié)構(gòu))，所述NtHMA RNAi多核苷酸作為由示例性 NtHMA RNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物產(chǎn)生。圖3A顯示用于產(chǎn)生目的NtHMA RNAi多核苷酸的示例性RNAi序列， NtHMA (660-915)，如實施例2中描述的。圖3B-3D顯示在代表3個變種的多個第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系的葉片中的Cd減 少，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)NtHMARNAi多核苷酸(660-915)，如實施例5中 描述的。圖4A顯示用于產(chǎn)生目的NtHMA RNAi多核苷酸的示例性RNAi序列，
8NtHMA (1382-1584)，如實施例3中描述的。圖4B-4D顯示在代表3個變種的多個第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系的葉片中的Cd減少， 所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)NtHMARNAi多核苷酸(1382-1584)，如實施例5中描 述的。圖5A-C顯示在多個第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系中的標(biāo)準(zhǔn)化NtHMARNA轉(zhuǎn)錄物水平，所 述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)目的NtHMA RNAi多核苷酸，如通過葉片提取物的定量 實時PCR分析測定的，如實施例6中描述的。圖6顯示在多個第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系的葉片和根之間的Cd和Zn分布，所述轉(zhuǎn) 基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)目的NtHMARNAi多核苷酸，如表2中呈現(xiàn)的和實施例7中 描述的。圖7顯示在多個第一代(TO)轉(zhuǎn)基因品系的樹皮(“B”)、葉片(“L”)、木髓(“P”) 和根(“R”)組織中的Cd分布，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)目的NtHMA RNAi多 核苷酸，如表3中呈現(xiàn)的和實施例8中描述的。圖8顯示在多個第二代(Tl)轉(zhuǎn)基因品系的葉片(“L”)和根(“R”)之間的Cd 分布，所述轉(zhuǎn)基因品系已進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)目的NtHMA RNAi多核苷酸，如實施例9中描 述的。發(fā)明詳述I.煙草NtHMA基因和基因產(chǎn)物的分離圖1是包括11個外顯子的NtHMA基因組克隆的示意圖，所述外顯子編碼與HMA轉(zhuǎn) 運蛋白家族相關(guān)的重金屬轉(zhuǎn)運蛋白。實施例1進(jìn)一步描述了 NtHMA基因組克隆(_H0-18-2) 和4個NtHMA cDNA克隆的鑒定。下表1提供了與在NtHMA基因組克隆(_Η0_18_2)內(nèi)作圖 的外顯子和內(nèi)含子亞區(qū)相對應(yīng)的核苷酸位置。A. NtHMA 多核苷酸術(shù)語“多核苷酸”指長度包括至少10個堿基的核苷酸聚合物。多核苷酸可以是 DNA、RNA或DNA/RNA雜交物，包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和核糖核 苷酸的組合、以及堿基和/或修飾的組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、 肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥嘌呤。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA或RNA。 術(shù)語“DNA”包括基因組DNA、cDNA、化學(xué)合成的DNA、PCR擴增的DNA及其組合/等價物。術(shù) 語“經(jīng)分離的多核苷酸”指與起源任何的基因組不鄰接、或從天然背景中分離的多核苷酸。 該術(shù)語包括任何重組多核苷酸分子，例如NtHMA RNAi構(gòu)建體、NtHMA RNAi表達(dá)載體、NtHMA 基因組克隆及其片段和變體。如圖1中所示，指定為SEQ ID NO 1的NtHMA基因組克隆包括內(nèi)含子1 (SEQ ID NO :4)、外顯子 1(SEQ ID NO :5)、內(nèi)含子 2 (SEQ ID NO :6)、外顯子 2 (SEQ ID N0:7)、內(nèi)含子 3 (SEQ IDNO :8)、外顯子 3 (SEQ ID NO :9)、內(nèi)含子 4 (SEQ ID NO 10)、外顯子 4 (SEQ ID NO: 11)、內(nèi)含子 5 (SEQ ID NO 12)、外顯子 5 (SEQ ID NO 13)、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO: 14)、外顯子 6 (SEQ IDNO : 15)、內(nèi)含子 7 (SEQ ID NO : 16)、外顯子 7 (SEQ ID NO : 17)、內(nèi)含子 8 (SEQ ID NO: 18)、外顯子 8 (SEQ ID NO : 19)、內(nèi)含子9 (SEQ ID NO :20)、外顯子 9 (SEQ ID N0:21)、內(nèi)含子 10 (SEQ IDNO :22)、外顯子 10 (SEQ ID NO :23)、內(nèi)含子 11 (SEQ ID NO :24、外顯子 11 (SEQ ID NO :25)、和內(nèi)含子12 (SEQ ID NO :26)。關(guān)于序列，參見下文序列表。本發(fā)明的多個實施方案涉及代表在NtHMA基因座處分離的基因組片段的經(jīng)分離的多核苷酸，包括SEQ ID NO=U SEQ ID NO :1的片段或其變體。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體，其包括與 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :1 的片段至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。多個實施方案涉及具有互補于NtHMA多核苷酸變體的序列的經(jīng)分離的多核苷酸， 所述變體包括與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :1的片段至少50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。多個實施方案涉及這樣 的經(jīng)分離的多核苷酸，其可以在中至高嚴(yán)格條件下與多核苷酸特異性雜交，所述多核苷酸 包括 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 1 的片段。多個實施方案涉及NtHMA cDNA(克隆P6663)的經(jīng)分離的多核苷酸，其包括SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :3的片段或其變體。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體，其 包括與 SEQ IDNO :3 或 SEQ ID NO :3 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%和99%序列同一性。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體，其包括與 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :3 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%和99%序列同一性，并且其中T已由U替換(例如RNA)。多個實施方案涉及這樣的經(jīng) 分離的多核苷酸，其可以在中至高嚴(yán)格條件下與多核苷酸特異性雜交，所述多核苷酸包括 SEQ ID NO :3或SEQID NO 3的片段。多個實施方案涉及具有互補于NtHMA多核苷酸變體的 序列的經(jīng)分離的多核苷酸，所述變體包括與SEQ ID NO 3或SEQID NO 3的片段至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。多個實施方案涉及NtHMA cDNA(克隆P6643)的經(jīng)分離的多核苷酸，其包括SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :47的片段或其變體。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體， 其包括與 SEQ IDN0:47 或 SEQ ID NO :47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96 %、97 %、98 %和99 %序列同一性。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多核苷酸變體， 其包括與 SEQ ID N0:47 或 SEQ ID NO :47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%和99%序列同一性，并且其中T已由U替換(例如RNA)。多個實施方案涉 及這樣的經(jīng)分離的多核苷酸，其可以在中至高嚴(yán)格條件下與多核苷酸特異性雜交，所述多 核苷酸包括SEQ ID N0:47或SEQID NO :47的片段。多個實施方案涉及具有互補于NtHMA 多核苷酸變體的序列的經(jīng)分離的多核苷酸，所述變體包括與SEQ ID N0:47或SEQ ID NO 47 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。多個實施方案涉及與NtHMA多核苷酸和NtHMA多肽同源的生物聚合物(“NtHMA同 系物”)，其可以從不同植物物種中鑒定。例如，NtHMA同系物可以通過篩選衍生自不同目的 植物物種的合適核酸文庫在實驗上分離。備選地，NtHMA同系物可以利用衍生自NtHMA多核 苷酸和/或NtHMA多肽的序列通過篩選包含來自一個或多個物種的序列的基因組數(shù)據(jù)庫得 到鑒定。此類基因組數(shù)據(jù)庫可對于許多物種容易地獲得(例如在環(huán)球網(wǎng)(www)上在tigr. org/tdb ；genetics, wise, edu ；Stanford, edu/. about, ball ；hiv-web. lanl. gov ；ncbi. nlm. nig. gov ；ebi. ac. uk ；禾口 pasteur. fr/other/biology 處)。例如，簡并寡核昔酸序列可 以通過“回譯”由NtHMA多肽片段獲得。NtHMA多核苷酸可以可以用作探針或引物以鑒定/ 擴增相關(guān)序列，或例如通過PCR或通過其他眾所周知的技術(shù)(例如，參見PCR Protocols =A Guide to Methods and Applications, Innis等人，編輯，Academic Press, Inc. (1990))獲得關(guān)于相關(guān)NtHMAs的全長序列。B. NtHMA 多肽術(shù)語“NtHMA多肽”指包括指定為SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽；與SEQ ID NO 2具有基本同源性(即序列相似性)或序列同一性的多肽；SEQ ID NO 2的片段；及其 變體。NtHMA多肽包括與SEQ ID NO :2具有足夠或基本同一性或相似性程度并且可以通過 轉(zhuǎn)運重金屬穿過細(xì)胞膜起作用的序列。NtHMA多肽包括通過引入任何類型的改變(例如，氨基酸的插入、缺失或置換；糖 基化狀態(tài)中的改變；影響重折疊或異構(gòu)化、三維結(jié)構(gòu)或自結(jié)合狀態(tài)的改變)而產(chǎn)生的變體， 其可以是有意改造的或天然分離的。NtHMA多肽可以為線性形式的或使用已知方法環(huán)化 的(例如 H. U. Saragovi，等人，Bio/Technology 10,773(1992)；和 R. S. McDowell，等人， J. Amer. Chem. Soc. 114 :9245 (1992)，兩者都通過引用合并入本文)。NtHMA多肽包括至少8 至10個、至少20個、至少30個或至少40個鄰接氨基酸。多個實施方案涉及由多核苷酸序列SEQ ID NO 1編碼的經(jīng)分離的NtHMA多肽，包 括SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 2的片段或其變體。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽 變體，包括與 SEQ IDNO :2 或 SEQ ID NO :2 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%和 99%序列同一性。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽(克隆P6663)，包括SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 2的片段或其變體。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽變體，包括與SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :2 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序 列同一性。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽(克隆P6643)，包括SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :49的片段或其變體。多個實施方案涉及經(jīng)分離的NtHMA多肽變體，包括與SEQ ID N0:49 或 SEQ ID NO :49 的片段至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性。II.用于減少NtHMA基因表達(dá)和/或NtHMA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運蛋白活性的組合物和相關(guān) 方法可以下調(diào)NtHMA和NtHMA變體的表達(dá)和/或活性的合適拮抗性組合物包括可以干 擾一種或多種內(nèi)源NtHMA基因的轉(zhuǎn)錄的序列特異性多核苷酸；可以干擾NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物 的翻譯的序列特異性多核苷酸(例如，dsRNA、siRNA、核酶)；可以干擾NtHMA的蛋白質(zhì)穩(wěn)定 性、NtHMA的酶促活性、和/或NtHMA就底物和/或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)而言的結(jié)合活性的序列特異 性多肽；顯示關(guān)于NtHMA的特異性的抗體；和可以干擾NtHMA的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、NtHMA的酶 促活性、和/或NtHMA的結(jié)合活性的小分子化合物。有效拮抗劑可以使重金屬(例如Cd)轉(zhuǎn) 運到葉片結(jié)構(gòu)內(nèi)減少至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。A.定義本公開內(nèi)容和附加權(quán)利要求自始至終，術(shù)語“a”和“the”充當(dāng)單數(shù)和復(fù)數(shù)指示物， 除非上下文另有明確說明。因此，例如提及“RNAi多核苷酸”包括多個此類RNAi多核苷酸， 并且提及“植物”包括提及一個或多個此類植物。術(shù)語“定向”指多核苷酸相對于參考多核苷酸的位置放置的特定順序。線性DNA具有2個可能定向5'-至-3'方向和3'-至-5 ‘方向。例如，如果參考序列以 5'-至-3'方向放置，并且如果第二序列以5'-至-3'方向放置在相同多核苷酸分子/ 鏈內(nèi)，那么參考序列和第二序列以相同方向定向，或具有相同定向。一般地，啟動子序列和 在給定啟動子調(diào)節(jié)下的目的基因以相同方向放置。然而，就以5'-至-3'方向放置的參 考序列而言，如果第二序列以3'-至-5'方向放置在相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)，那么參考 序列和第二序列以反義方向定向，或具有反義定向。就彼此而言具有反義定向的2個序列 可以備選地描述為具有相同定向，如果參考序列(5'-至-3'方向)和參考序列的反向互 補序列(以5'-至-3'放置的參考序列)放置在相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)。術(shù)語“NtHMA RNAi表達(dá)載體”指包括DNA組分的組合用于使得NtHMA RNAi構(gòu)建 體的轉(zhuǎn)運和表達(dá)成為可能的核酸媒介物。合適的表達(dá)載體包括能夠染色體外復(fù)制的附加 體，例如環(huán)狀、雙鏈DNA質(zhì)粒；線性化雙鏈DNA質(zhì)粒；和任何起源的其他功能上等價的表達(dá) 載體。合適的NtHMA RNAi表達(dá)載體至少包括放置在上游且與NtHMA RNAi構(gòu)建體可操作地 連接的啟動子，如下文定義的。術(shù)語“NtHMA RNAi構(gòu)建體”指編碼具有RNA干擾活性的“NtHMA RNAi多核苷酸” 的雙鏈、重組DNA片段。NtHMA RNAi構(gòu)建體包括與互補“正義或編碼鏈”堿基配對的“模板 鏈”。給定NtHMA RNAi構(gòu)建體可以以2個可能的定向插入NtHMA RNAi表達(dá)載體內(nèi)，就放置 在NtHMA RNAi表達(dá)載體內(nèi)的啟動子定向而言的相同(或正義)定向或相反(或反義)定向。術(shù)語“NtHMA RNAi多核苷酸”可以靶向NtHMA RNA用于酶促降解，涉及NtHMA RNAi 多核苷酸的較小片段(“siRNA”)的形成，其可以與靶NtHMA RNA內(nèi)的多個互補序列結(jié)合。 一種或多種NtHMA基因的表達(dá)水平可以通過NtHMA RNAi多核苷酸的RNA干擾活性減少。術(shù)語“模板鏈”指包括互補于DNA雙鏈體的“正義或編碼鏈”序列的序列的鏈，所述 DNA雙鏈體例如NtHMA基因組片段、NtHMA cDNA或NtHMA RNAi構(gòu)建體、或包括可以由RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄的核酸序列的任何DNA片段。在轉(zhuǎn)錄過程中，RNA聚合酶可以在新生RNA合成 過程中以3'-至-5'方向沿著模板鏈移動。術(shù)語“正義鏈”或“編碼鏈”指包括互補于DNA雙鏈體中的模板鏈序列的序列的鏈。 例如，關(guān)于經(jīng)鑒定的NtHMA基因組克隆的正義鏈的序列(“正義序列”)指定為SEQ ID NO 1。例如，關(guān)于經(jīng)鑒定為克隆P6663的NtHMA cDNA的正義序列指定為SEQ ID NO :3。例如， 關(guān)于經(jīng)鑒定為克隆P6643的NtHMA cDNA的正義序列指定為SEQ ID NO :46。例如，如果正 義鏈包括假定序列5' -TAATCCGGT-3'，那么在假定靶mRNA內(nèi)基本上相同的相對應(yīng)序列是 5' -UAAUCCG⑶-3'。術(shù)語“反向互補序列”指互補于就正義序列而言以相同定向放置在相同鏈內(nèi)的目 的“正義序列”(例如外顯子序列)的序列。例如，如果鏈包括假定序列5' -TAATCCGGT-3'， 那么反向互補序列5' -ACCGGATTA-3'可以與正義序列可操作地連接，通過間隔物序列分開。在RNA干擾上下文中的術(shù)語“NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物”或“NtHMA RNA”指在目的宿主植 物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的多核糖核酸分子，產(chǎn)生于HMA家族的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，包括經(jīng)分離的NtHMA 基因(SEQ ID NO :1)。因此，這些術(shù)語包括作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由HMA相關(guān)基因產(chǎn)生的任何RNA 種類或RNA變體，所述HMA相關(guān)基因可以不同于經(jīng)分離的NtHMA基因(SEQ ID :1)，但在結(jié)構(gòu)和/或功能水平上具有足夠的相似性以分類在相同家族內(nèi)。例如，如果根據(jù)所公開的 方法就遺傳修飾選擇的宿主植物細(xì)胞是煙草，那么靶NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物包括(1)由經(jīng)分離 的NtHMA基因(SEQ ID NO 1)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體和mRNA ； (2)由與經(jīng)分離的NtHMA基因 (SEQ ID NO :1)序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%和99%序列同一性的任何基因(即與經(jīng)鑒定的NtHMA基因基本上等同且編 碼HMA轉(zhuǎn)運蛋白的相關(guān)同種型的其他不同基因)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體和mRNA ；和(3)由 NtHMA基因(SEQ ID NO 1)的等位基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體和mRNA。NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物 包括由于特定NtHMA基因的異核RNA ( “hnRNA”)的可變RNA剪接反應(yīng)產(chǎn)生的RNA變體、起 因于此類可變RNA剪接反應(yīng)的mRNA變體、和任何中間RNA變體。術(shù)語“同源性”或“同一性”或“相似性”指通過序列比對相比較的2個多肽之間或2 個核酸分子之間的序列相似性程度。被比較的2個不連續(xù)核酸序列之間的同源性程度是在 可比較位置上的等同或匹配核苷酸數(shù)目的函數(shù)。同一性百分比可以通過目視檢查和數(shù)學(xué)計 算進(jìn)行測定。備選地，2個核酸序列的同一性百分比可以使用GAP計算機程序、版本6.0通過 比較序列信息進(jìn)行測定，所述GAP計算機程序由Devereux等人(Nuc 1. Acids Res. 12 :387， 1984)描述，且可從 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffGCG)獲得。 用于GAP程序的一般缺省參數(shù)包括(1)用于核苷酸的一元比較矩陣(包含值1用于同一 性和 0 用于非同一性)，以及 Gribskov 和 Burgess,Nucl. Acids Res. 14 :6745，1986 的加權(quán) 比較矩陣，如由 Schwartz 禾口 Dayhoff,編輯,Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation，第 353-358 頁，1979 描述的；(2)罰分 3.0 用 于每個缺口和另外的0. 10罰分用于每個缺口中的每個符號；和(3)對于末端缺口無罰分。 備選地可以利用序列比較領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種程序。術(shù)語“上游”指沿著線性多核苷酸序列就參考元件而言的相對方向/位置，這指示 朝向多核苷酸序列的5'末端的方向/位置?！吧嫌巍笨梢耘c“參考元件的5'末端”互換使用。術(shù)語“可操作地連接”指不同DNA元件、片段或序列的連接，以產(chǎn)生功能轉(zhuǎn)錄單位 或功能表達(dá)載體。術(shù)語“啟動子”指一般放置在雙鏈DNA片段的上游且與之可操作地連接的核酸元 件/序列，所述雙鏈DNA片段例如NtHMA RNAi構(gòu)建體。例如，合適的啟動子通過召募轉(zhuǎn)錄 復(fù)合物使得NtHMA RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄激活成為可能，所述轉(zhuǎn)錄復(fù)合物包括RNA聚合酶和各 種因子，以起始RNA合成?！皢幼印笨梢酝耆苌耘c目的天然基因鄰近的區(qū)域，或可以 由衍生自不同天然啟動子的不同元件和/或合成DNA區(qū)段組成。合適的啟動子包括由組織 特異性因子識別的組織特異性啟動子，所述組織特異性因子在不同組織或細(xì)胞類型中出現(xiàn) (例如，根特異性啟動子、芽特異性啟動子、木質(zhì)部特異性啟動子)、或在不同發(fā)育階段過程 中出現(xiàn)、或響應(yīng)不同環(huán)境條件而出現(xiàn)。合適的啟動子包括無需特異性誘導(dǎo)劑即可在大多數(shù) 細(xì)胞類型中激活的組成型啟動子。用于控制NtHMA RNAi多肽產(chǎn)生的合適啟動子的例子包 括花椰菜花葉病毒35S(CaMV/35S)、SSU、0CS、lib4、usp、STLSU B33、nos或泛素或菜豆球 蛋白啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生重組啟動子的多重變化，如許多參考文獻(xiàn)中描述的， 例如 Okamuro 和 Goldberg, Biochemistry of Plants，第 15 卷第 1-82 頁(1989)。組織特異性啟動子是僅在植物發(fā)育過程中的特定時間在特定細(xì)胞或組織中活躍的轉(zhuǎn)錄控制元件，例如在營養(yǎng)組織或生殖組織中。例如當(dāng)多核苷酸在特定組織中的表達(dá)是 優(yōu)選的時，組織特異性表達(dá)可以是有利的。在發(fā)育控制下的組織特異性啟動子的例子包括 可以僅(或僅最初)在特定組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子，所述特定組織例如營養(yǎng)組織例如根 或葉，或生殖組織例如果實、胚珠、種子、花粉、雌蕊、花或任何胚胎組織。生殖組織特異性啟 動子可以是例如花藥特異性、胚珠特異性、胚特異性、胚乳特異性、珠被特異性、種子和種皮 特異性、花粉特異性、花瓣特異性、萼片特異性的或其組合。合適的葉特異性啟動子包括來自C4植物(玉蜀黍)的丙酮酸正磷酸二激酶 (PPDK)啟動子、來自玉蜀黍的cab-mlCa+2啟動子、擬南芥myb相關(guān)基因啟動子(Atmyb5)、 核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)啟動子(例如在葉和光生長(light-grown)幼苗中表達(dá)的煙 草RBCS URBCS2和RBCS3A基因，在發(fā)育番茄果實中表達(dá)的RBCSl和RBCS2，和/或以高水 平在葉片和葉鞘中的葉肉細(xì)胞中幾乎專一地表達(dá)的核酮糖二磷酸羧化酶啟動子)。合適的衰老特異性啟動子包括在果實催熟、葉枯萎和脫落過程中活躍的番茄啟動 子、編碼半胱氨酸蛋白酶的基因的玉蜀黍啟動子?？梢允褂煤线m的花藥特異性啟動子。此 類啟動子是本領(lǐng)域已知的，或可以通過已知技術(shù)發(fā)現(xiàn)；參見例如，Bhalla和Singh(1999) Molecular control of male fertility in Brassica, Proc. 10th Annual Rapeseed Congress,Canberra,Australia ；van Tunen^A (1990)Pollen-and anther-specific chi promoters from petunia :tandem promoter regulation of the chiA gene. Plant Cell 2 393-40 ；Jeon ^A (1999) Isolation and characterization of an anther-specific gene, RA8, from rice(Oryza sativa L). Plant Molecular Biology 39:35-44; 禾口 Twell 等人(1993)Activation and developmental regulation of an Arabidopsis anther-specific promoter in microspores and pollen of Nicotiana tabacum. Sex. Plant Reprod. 6 :217_224?？梢赃x擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的根優(yōu)選啟動子。參見例如，Hire等人 (1992) Plant Mol. Biol. 20 (2) :207_218 (大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller 和 Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) 1051-1061 (在菜豆的 GRP 1.8 基因中的根特 異性控制元件)；Sanger 等人(1990)Plant Mol. Biol. 14(3) :433_443 (根瘤土 壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)的甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；和Miao等 人(1991)Plant Cell 3(1) : 11-22 (編碼細(xì)胞溶質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆， 其在大豆的根和根瘤中表達(dá))。還參見Bogusz等人(1990)Plant Cell 2(7) :633_641，其中 描述了從來自固氮的非豆科Parasponia andersonii和相關(guān)非固氮的非豆科山黃麻(Trema tomentosa)的血紅蛋白基因中分離的2種根特異性啟動子。合適的種子優(yōu)選啟動子包括種子特異性啟動子(這些啟動子在種子發(fā)育過程中 活躍，例如種子儲存蛋白質(zhì)的啟動子)和種子發(fā)芽啟動子(這些啟動子在種子發(fā)芽過程中 活躍)。參見例如，通過引用合并入本文的Thompson等人(1989)BioEssays 10:108。此 類種子優(yōu)選啟動子包括但不限于，Ciml (細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的信使)；cZ19Bl(玉蜀黍19kDa 玉米醇溶蛋白)；milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2也稱為Zm-40(美國專利號 6, 403, 862);皿(1(3(美國專利號6，407，315)；和 celA (纖維素合酶)(參見 WO 00/11177)。 Y-玉米醇溶蛋白是胚乳特異性啟動子。Glob-I是胚胎特異性啟動子。對于雙子葉植物，種 子特異性啟動子包括但不限于豆菜豆球蛋白、napin、β _伴大豆球蛋白、大豆凝集素、
14cruciferin等。對于單子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶 蛋白啟動子、22kDa玉米醇溶蛋白啟動子、27kDa玉米醇溶蛋白啟動子、g_玉米醇溶蛋白啟 動子、27kD. Y.-玉米醇溶蛋白啟動子(例如gzw64A啟動子，參見Genbank登記#S78780)、 蠟質(zhì)基因(waxy)啟動子、shrunken 1啟動子、shrunken 2啟動子、球蛋白1啟動子(參見 Genbank登記 #L22344)、Itp2 啟動子(Kalla，等人，Plant Journal 6:849-860(1994)；美國 專利號5，525，716)、ciml啟動子(參見美國專利號6，225，529)玉蜀黍endl和end2啟動 子(參見2002年12月4日提交的美國專利號6，528，704和申請10/310，191) ；nucl啟動子 (美國專利號6，407，315) ；Zm40啟動子(美國專利號6，403，862) ；eepl和e印2 ；Iecl (美 國專利申請序列號09/718，754)；硫氧還蛋白H啟動子(美國臨時專利申請60/514，123)； mlipl5啟動子(美國專利號6，479，734) ；PCNA2啟動子；和shrunken-2啟動子。(Shaw等 人，Plant Phys 98 1214-1216、1992 ；Zhong Chen 等人，PNAS US100 :3525_3530、2003)。誘導(dǎo)型啟動子的例子包括響應(yīng)病原體攻擊、缺氧情況、溫度升高、光、干旱、寒冷溫 度或高鹽濃度的啟動子。病原體誘導(dǎo)型啟動子包括來自發(fā)病機理相關(guān)蛋白質(zhì)O3R蛋白質(zhì)) 的那些，其在受病原體感染后被誘導(dǎo)(例如，I3R蛋白質(zhì)、SAR蛋白質(zhì)、β-1，3-葡聚糖酶、殼 多糖酶)。參見例如，Redolfi 等人(1983)Neth. J. Plant Pathol. 89 :245_254 ；Uknes 等人 (1992)Plant Cell 4 :645_656 ；和 Van Loon(1985)Plant Mol. Virol. 4 :111_116。還參見 1999年2月25曰提交的名稱為"Inducible Maize Promoters"的申請，美國專利申請序 列號 09/257，583。除植物啟動子外，其他合適的啟動子可以衍生自細(xì)菌來源(例如，章魚堿合酶啟 動子、胭脂堿合酶啟動子和衍生自Ti質(zhì)粒的其他啟動子)，或可以衍生自病毒啟動子(例 如，花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19S RNA啟動子、煙草花葉病毒的組成型啟動子、花椰 菜花葉病毒(CaMV) 19S和35S啟動子、或玄參花葉病毒35S啟動子)。術(shù)語“增強子”指核酸分子或核酸序列，其可以召募轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄激活 因子，以通過增加啟動子活性而增強轉(zhuǎn)錄激活。合適的增強子可以衍生自與目的天然啟動 子鄰近的區(qū)域(同源來源)，或可以衍生自非天然背景(異源來源)且與NtHMA RNAi表達(dá) 載體內(nèi)的任何目的啟動子可操作地連接，以增強啟動子的活性和/或組織特異性。某些增 強子可以以就轉(zhuǎn)錄單位定向而言的任何定向起作用。例如，增強子可以放置在轉(zhuǎn)錄單位的 上游或下游，所述轉(zhuǎn)錄單位包括啟動子和NtHMA RNAi構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使增強 子和啟動子可操作地連接，以最佳化NtHMA RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄水平。B.包括編碼NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi構(gòu)建體的RNAi表達(dá)載體RNA干擾(“RNAi”)或RNA沉默是可以通過其而靶向特異性mRNA用于酶促降解的 進(jìn)化上保守的過程。雙鏈RNA(dsRNA)必須由細(xì)胞引入或產(chǎn)生(例如，dsRNA病毒或NtHMA RNAi多核苷酸)，以起始RNAi途徑。dsRNA可以通過RNA酶III轉(zhuǎn)變?yōu)?1_23bp長度的多 重siRNA雙鏈體(“siRNA”)，所述RNA酶III是dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(“Dicer”)。 siRNA隨后可以由RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(“RISC”)識別，所述RISC通過ATP依賴性過程 促進(jìn)siRNA的解鏈。siRNA展開的反義鏈將激活的RISC引導(dǎo)至被靶向的mRNA(例如，NtHMA RNA變體)，所述被靶向的mRNA包括與siRNA反義鏈互補的序列。被靶向的mRNA和反義鏈 可以形成A型螺旋，并且A型螺旋的大溝可以被激活的RISC識別。靶mRNA可以被激活的 RISC在由siRNA鏈的5'末端的結(jié)合位點限定的單個位點處切割。激活的RISC可以再循環(huán)以催化另一個切割單位。圖2A舉例說明示例性NtHMA RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建。在圖2A中，“S I”指構(gòu)建過 程的步驟I并且“S II”指步驟II。多個實施方案涉及包括編碼NtHMA RNAi多核苷酸的 NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，通過減少NtHMA mRNA、NtHMA mRNA前體和相 關(guān)NtHMA RNA變體的表達(dá)水平來顯示RNA干擾活性。表達(dá)載體包括放置在NtHMA RNAi構(gòu) 建體上游并且與之可操作地連接的啟動子，如下文進(jìn)一步定義的。NtHMA RNAi表達(dá)載體包 括合適的最低限度的核心啟動子，目的NtHMA RNAi構(gòu)建體，上游(5')調(diào)節(jié)區(qū)，下游(3') 調(diào)節(jié)區(qū)包括轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他序列，例如各種 選擇標(biāo)記ONtHMA多核苷酸可以以各種形式產(chǎn)生，包括作為雙鏈發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)(“dsRNAi”)。 NtHMA dsRNAi可以酶促轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈NtHMAsiRNA。NtHMA siRNA雙鏈體的鏈之一可以對靶 NtHMA mRNA和相關(guān)NtHMA RNA變體內(nèi)的互補序列退火。siRNA/mRNA雙鏈體由RISC識另ij， 所述RISC可以以序列依賴性方式在多重位點處切割NtHMA RNA，導(dǎo)致靶NtHMA mRNA和相關(guān) NtHMA RNA變體的降解。圖2B舉例說明作為由示例性NtHMA RNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物形成的假定雙鏈RNA 雙鏈體(作為“莖-環(huán)-莖”結(jié)構(gòu))的形成。在圖2B中，顯示了假定的NtHMA RNAi構(gòu)建體 10，包括3個雙鏈DNA片段，例如片段1-3。箭頭I指示RNAi構(gòu)建體的形成，箭頭II轉(zhuǎn)錄， 并且箭頭III dsRNA的形成。片段1放置在片段2上游并且與之可操作地連接，所述片段2 放置在片段3上游并且與之可操作地連接，對于其DNA鏈/序列4、6和8串聯(lián)連接在一起 以形成鏈11，如所示的。備選地，NtHMA RNAi構(gòu)建體包括“正義序列” 5，所述“正義序列” 5 放置在“間隔物序列” 7上游并且與之可操作地連接，所述“間隔物序列” 7放置在“反向互 補序列”9上游并且與之可操作地連接。鏈/序列5、7和9可以串聯(lián)連接在一起以形成鏈 /序列12。備選地，NtHMARNAi構(gòu)建體包括“正義序列”8，所述“正義序列”8放置在“間隔 物序列”6上游并且與之可操作地連接，所述“間隔物序列”6放置在“反向互補序列”4上游 并且與之可操作地連接。鏈/序列8、6和4可以串聯(lián)連接在一起以形成鏈/序列11。鏈 12與鏈11互補。鏈11是可以轉(zhuǎn)錄成NtHMA RNAi多核苷酸13的模板鏈。NtHMA RNAi多 核苷酸13形成發(fā)夾(“莖-環(huán)-莖”)結(jié)構(gòu)，其中莖16是起因于NtHMARNAi多核苷酸15的 分子內(nèi)堿基對相互作用的互補區(qū)，并且環(huán)17代表由間隔物序列例如鏈/序列6或7編碼的 非互補區(qū)。任何目的NtHMA RNA多核苷酸都可以通過選擇用于產(chǎn)生NtHMA發(fā)夾雙鏈體的 合適序列組成、環(huán)尺寸和莖長度而產(chǎn)生。用于設(shè)計發(fā)夾雙鏈體的莖長度的合適范圍包括 20-30個核苷酸、30-50個核苷酸、50-100個核苷酸、100-150個核苷酸、150-200個核苷酸、 200-300個核苷酸、300-400個核苷酸、400-500個核苷酸、500-600個核苷酸、和600-700個 核苷酸的莖長度。如果發(fā)夾雙鏈體的莖長度是基本的，那么用于設(shè)計發(fā)夾雙鏈體的環(huán)長度 的合適范圍包括4-25個核苷酸、25-50個核苷酸或更長的環(huán)長度。在特定背景下，具有長于 21個核苷酸的雙鏈體區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)有效的siRNA指導(dǎo)的沉默，與環(huán)序列和長度無 關(guān)。用于下調(diào)NtHMA基因(SEQ ID NO 1)和其他NtHMA相關(guān)基因的表達(dá)水平的示例性 NtHMA RNAi構(gòu)建體包括下述
多個實施方案涉及包括NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMA RNAi構(gòu)建體包括下述中的一種或多種內(nèi)含子1 (SEQ ID NO 4)、外顯子1 (SEQ ID NO 5)、 內(nèi)含子 2 (SEQ IDNO :6)、外顯子 2 (SEQ ID NO :7)、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO :8)、外顯子 3 (SEQ ID NO :9)、內(nèi)含子 4 (SEQ ID NO 10)、外顯子 4 (SEQ ID NO 11)、內(nèi)含子 5 (SEQ ID NO: 12)、外顯 子 5 (SEQ IDNO 13)、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO 14)、外顯子 6 (SEQ ID NO 15)、內(nèi)含子 7 (SEQ ID NO: 16)、外顯子 7 (SEQ ID NO 17)、內(nèi)含子 8 (SEQ ID NO 18)、外顯子 8 (SEQ ID NO: 19)、內(nèi) 含子9 (SEQ IDNO 20)、外顯子 9 (SEQ ID NO :21)、內(nèi)含子 10 (SEQ ID NO :22)、外顯子 10 (SEQ ID NO :23)、內(nèi)含子 11 (SEQ ID NO :24、外顯子 11 (SEQ ID NO :25)、和內(nèi)含子 12 (SEQ ID NO: 26)、其片段及其變體。多個實施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體與選自下述的序列具有至 少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同一性的 NtHMA RNAi 構(gòu) 建體外顯子1(SEQID NO :5)、外顯子1(SEQ ID NO 5)的片段、外顯子2 (SEQ IDNO 7)、外 顯子2 (SEQ ID NO 7)的片段、外顯子3 (SEQ ID NO :9)、外顯子3 (SEQ ID NO 9)的片段、外 顯子 4 (SEQ ID NO 11)、外顯子 4 (SEQ ID NO 11)的片段、外顯子 5 (SEQ ID NO: 13)、外顯 子 5 (SEQ ID N0:13)的片段、外顯子 6 (SEQ ID NO 15)、外顯子 6 (SEQ ID NO 15)的片段、 外顯子7 (SEQ ID NO 17)、外顯子7 (SEQ ID N0:17)的片段、外顯子8 (SEQ ID NO: 19)、外顯 子 8 (SEQ ID NO: 19)的片段、外顯子 9 (SEQ ID NO :21)、外顯子 9 (SEQ ID NO 21)的片段、 外顯子 10 (SEQ ID NO :23)、外顯子 10 (SEQ ID NO 23)的片段、外顯子 11 (SEQ ID NO :25)、 和外顯子11 (SEQ ID NO 25)的片段。多個實施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體編碼能夠自身退火以形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMARNAi構(gòu)建體，其中RNAi構(gòu)建體包括(a)與SEQ ID NO :3 或 47 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同 一性的第一序列；(b)編碼形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)的NtHMARNAi多核苷酸的間隔物元件的第二 序列；和(c)以與第一序列相同的方向放置、包括第一序列的反向互補序列的第三序列，其 中第二序列放置在第一序列和第三序列之間，并且第二序列與第一序列和第三序列可操作 地連接。多個實施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體編碼能夠自身退火以形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的NtHMA RNAi多核苷酸的NtHMARNAi構(gòu)建體，其中RNAi構(gòu)建體包括(a)與SEQ ID NO :3 或 47 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99%序列同 一性的第一序列；(b)編碼形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)的NtHMARNAi多核苷酸的間隔物元件的第二 序列；和(c)以與第一序列相同的方向放置、包括第一序列(SEQ ID N0:46或SEQ ID N0: 48)的反向互補序列的第三序列，其中第二序列放置在第一序列和第三序列之間，并且第二 序列與第一序列和第三序列可操作地連接。多個實施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體包括與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 3的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%, 97%、98%和99%序列同一性的第一序列的NtHMA RNAi構(gòu)建體。多個實施方案涉及包括 NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMA RNAi構(gòu)建體包括與SEQ ID N0: 47或SEQ ID NO :47的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的第一序列。
多個實施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體包括與選自下述的序列具 有“基本相似性”，或具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和 99% 序列同一性的第二序列的NtHMA RNAi構(gòu)建體內(nèi)含子1 (SEQ ID NO 4)、內(nèi)含子1 (SEQID NO 4)的片段、內(nèi)含子2 (SEQ ID NO :6)、內(nèi)含子2 (SEQ IDNO 6)的片段、內(nèi)含子3 (SEQ ID NO :8)、內(nèi)含子 3 (SEQ ID NO :8)的片段、內(nèi)含子4 (SEQ ID NO 10)、內(nèi)含子4 (SEQ ID NO 10) 的片段、內(nèi)含子5 (SEQ ID NO 12)、內(nèi)含子5 (SEQ ID NO: 12)的片段、內(nèi)含子6 (SEQ ID NO: 14)、內(nèi)含子 6 (SEQ ID NO: 14)的片段、內(nèi)含子 7 (SEQ ID NO 16)、內(nèi)含子 7 (SEQ ID NO: 16) 的片段、內(nèi)含子8 (SEQ ID NO 18)、內(nèi)含子8 (SEQ ID NO 18)的片段、內(nèi)含子9 (SEQ ID NO: 20)、內(nèi)含子 9 (SEQ ID NO 20)的片段、內(nèi)含子 10 (SEQ ID NO :22)、內(nèi)含子 10 (SEQ ID NO: 22)的片段、內(nèi)含子11 (SEQ ID NO :24)、內(nèi)含子11 (SEQ ID NO 24)的片段、內(nèi)含子12 (SEQ ID NO :26)、和內(nèi)含子12 (SEQ ID NO 26)的片段。備選地，可以隨機產(chǎn)生NtHMA RNAi構(gòu)建 體的第二序列，而不利用衍生自NtHMA基因(SEQ ID N0:1)的內(nèi)含子序列。多個實施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體包括與SEQ ID NO :46或SEQ ID NO 46的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%, 97%、98%和99%序列同一性的第三序列的NtHMA RNAi構(gòu)建體。多個實施方案涉及包括 NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMA RNAi構(gòu)建體包括與SEQ ID N0: 48或SEQ ID NO :48的部分具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%和99%序列同一性的第三序列。多個實施方案涉及包括下述的NtHMA RNAi表達(dá)載體包括與選自下述的反向互 補序列具有“基本相似性”，或具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 和99%序列同一性的第三序列的NtHMA RNAi構(gòu)建體SEQ ID NO :27 (外顯子1)、SEQID NO: 27 (外顯子1)的片段、SEQ ID NO :28(外顯子2)、SEQID N0:28(外顯子2)的片段、SEQ ID N0:29(外顯子 3)、SEQID N0:29(外顯子 3)的片段、SEQ ID NO :30 (外顯子 4)、SEQID N0: 30 (外顯子4)的片段、SEQ ID NO :31(外顯子5)、SEQID N0:31(外顯子5)的片段、SEQ ID NO :32(外顯子 6)、SEQID N0:32(外顯子 6)的片段、SEQ ID NO :33 (外顯子 7)、SEQID N0: 33 (外顯子7)的片段、SEQ ID NO :34 (外顯子8)、SEQID N0:34(外顯子8)的片段、SEQ ID NO :35(外顯子 9)、SEQID N0:35(外顯子 9)的片段、SEQ ID NO :36 (外顯子 10)、SEQID NO: 36 (外顯子10)的片段、SEQ ID NO :37 (外顯子11)、和SEQ ID N0:37(外顯子11)的片段。多個實施方案涉及包括NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMA RNAi構(gòu)建體包括SEQ ID NO :38 ( “正義序列/片段”)、包括SEQ ID NO :39的第二序列 (“間隔物序列/片段”)和包括SEQ ID NO 40的第三序列(“反義序列/片段”)。多個實施方案涉及包括NtHMA RNAi構(gòu)建體的NtHMA RNAi表達(dá)載體，所述NtHMA RNAi構(gòu)建體包括SEQ ID NO 42( “正義序列/片段”)、包括SEQ ID NO 43的第二序列 (“間隔物序列/片段”)和包括SEQ ID NO 44的第三序列(“反義序列/片段”)。備選地，所公開的序列可以用于構(gòu)建不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的多種NtHMA多核苷酸。例 如，NtHMA長雙鏈RNA可以通過下述形成(1)通過與第一個啟動子可操作地連接轉(zhuǎn)錄NtHMA cDNA的第一條鏈，和(2)通過與第二個啟動子可操作地連接轉(zhuǎn)錄NtHMA cDNA片段的第一條 鏈的反向互補序列。NtHMA多核苷酸的每條鏈可以由相同表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，或由不同表 達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。具有RNA干擾活性的NtHMA RNA雙鏈體可以酶促轉(zhuǎn)變?yōu)閟iRNAs，以減少NtHMARNA 水平。C.通過共抑制用于減少NtHMA基因表達(dá)的表達(dá)載體提供了通過促進(jìn)NtHMA基因表達(dá)的共抑制用于減少關(guān)于NtHMA基因家族成員的內(nèi) 源表達(dá)水平的多種組合物和方法。共抑制現(xiàn)象由于將轉(zhuǎn)基因的多個拷貝引入植物細(xì)胞宿主 內(nèi)而發(fā)生。轉(zhuǎn)基因的多個拷貝的整合可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因和所靶向的內(nèi)源基因的表達(dá)減少。共 抑制的程度依賴于轉(zhuǎn)基因和所靶向的內(nèi)源基因之間的序列同一性程度。內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因 的沉默可以通過所沉默的基因座(即，內(nèi)源啟動子和內(nèi)源目的基因)的廣泛甲基化而發(fā)生， 所述所沉默的基因座可以排除轉(zhuǎn)錄。備選地，在某些情況下，內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因的共抑制可 以通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默(“PTGS”)而發(fā)生，其中可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物但增強的降解率排除轉(zhuǎn)錄 物的累積。關(guān)于通過PTGS共抑制的機制被認(rèn)為類似RNA干擾，因為RNA看起來是這些過程 中的重要起始因子和靶，并且可以至少部分通過相同分子機制介導(dǎo)，可能通過RNA引導(dǎo)的 mRNAs降解。NtHMA基因家族成員的共抑制可以通過將作為轉(zhuǎn)基因的NtHMA cDNA或其片段的 多個拷貝整合到目的植物的基因組內(nèi)來實現(xiàn)。宿主植物可以用表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述表 達(dá)載體包括與NtHMAcDNA或其片段可操作地連接的啟動子。多個實施方案涉及用于促進(jìn) NtHMA家族的內(nèi)源基因的共抑制的表達(dá)載體，其包括與經(jīng)鑒定為克隆P6663(SEQ ID NO: 3)的NtHMA cDNA或其片段，或經(jīng)鑒定為克隆P6643(SEQ ID NO 47)的NtHMA cDNA或其片 段可操作地連接的啟動子。多個實施方案涉及用于促進(jìn)NtHMA家族的內(nèi)源基因的共抑制的 表達(dá)載體，其包括與NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動子，所述NtHMA cDNA或其 片段與 SEQ ID NO :3 或 SEQID NO :47 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%序列同一性。多個實施方案涉及通過將NtHMA cDNA或其片段的多個拷貝整合到植物基因組內(nèi)， 用于減少NtHMA家族的內(nèi)源基因的表達(dá)水平的方法，所述方法包括用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物 細(xì)胞宿主，所述表達(dá)載體包括與SEQ ID NO :3或其片段；或者SEQ ID NO :47或其片段可操 作地連接的啟動子。多個實施方案涉及通過將NtHMA cDNA或其片段的多個拷貝整合到植 物基因組內(nèi)，用于減少NtHMA家族的內(nèi)源基因的表達(dá)水平的方法，所述方法包括用表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞宿主，所述表達(dá)載體包括與NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動子， 所述 NtHMA cDNA 或其片段與 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :47 具有至少約 70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性。D.通過經(jīng)由反義試劑抑制翻譯用于減少NtHMA基因表達(dá)的表達(dá)載體提供了通過抑制NtHMA mRNA翻譯用于減少NtHMA基因家族的內(nèi)源表達(dá)水平的多 種組合物和方法。宿主植物細(xì)胞可以用表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述表達(dá)載體包括與以就啟 動子而言的反義定向放置的NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動子，以使得具有與 NtHMA mRNA的部分互補的序列的RNA多核苷酸的表達(dá)成為可能。用于抑制HMA mRNA翻譯 的多種表達(dá)載體包括與經(jīng)鑒定為克隆P6663 (SEQ ID NO 3)的NtHMA cDNA或其片段；或 經(jīng)鑒定為克隆P6643(SEQ ID N0:47)的NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動子；其中 NtHMA cDNA或其片段以就啟動子而言的反義定向放置。用于抑制HMA mRNA翻譯的多種表 達(dá)載體包括與NtHMAcDNA或其片段可操作地連接的啟動子，所述NtHMA cDNA或其片段與 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :47 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，其中NtHMAcDNA或其片段以就啟動子而言的反義定向放置。反義 NtHMA RNA多核苷酸的長度可以改變，包括15-20個核苷酸、20-30個核苷酸、30-50個核苷 酸、50-75個核苷酸、75-100個核苷酸、100-150個核苷酸、150-200個核苷酸、和200-300個
核苷酸。多個實施方案涉及通過抑制NtHMA mRNA翻譯用于減少NtHMA家族的內(nèi)源基因的 表達(dá)水平的方法，所述方法包括用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞宿主，所述表達(dá)載體包括與經(jīng)鑒 定為克隆P6663(SEQ ID NO 3)的NtHMA cDNA或其片段；或經(jīng)鑒定為克隆P6643 (SEQ ID NO 47)的NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動子，其中NtHMA cDNA或其片段以就啟 動子而言的反義定向放置。多個實施方案涉及通過抑制NtHMA mRNA翻譯用于減少NtHMA 家族的內(nèi)源基因的表達(dá)水平的方法，所述方法包括用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞宿主，所述表 達(dá)載體包括與NtHMA cDNA或其片段可操作地連接的啟動子，所述NtHMA cDNA或其片段與 SEQ ID NO :3 或 SEQ IDNO :47 具有至少約 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性，其中NtHMA cDNA或其片段以就啟動子而言的反義定向放置。E.用于減少NtHMA基因表達(dá)的其他組合物和方法用于獲得NtHMA多核苷酸和多肽的保守變體和更趨異變體的方法是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的。任何目的植物可以通過已知誘導(dǎo)誘變的多種方法進(jìn)行遺傳修飾，所述方法包 括定點誘變、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、化學(xué)誘導(dǎo)的誘變、輻射誘導(dǎo)的誘變和其他等價方法。例 如，定點誘變在下述中描述例如 Smith(1985) 〃 In vitro mutagenesis, “ Ann. Rev. Genet. 19 :423-462，和其中的參考文獻(xiàn)例如 Botstein & Shortle (1985) 〃 Strategies and Applications of in vitro Mutagenesis, " Science 229 1193-1201, 禾口 Carter (1986) " Site-directed mutagenesis, “ Biochem. J. 237 :1-7。寡核苷酸指導(dǎo) 的誘變在例如 Zoller & Smith(1982)" Oligonucleotide-directed Mutagenesis using M13-derived Vectors :an Efficient and General Procedure for the Production of Point mutations in any DNA Fragment, “ Nucleic Acids Res. 10 6487-6500 ψ δ 述。利用修飾堿基的誘變在例如 Kunkel (1985) 〃 Rapid and Efficient Site-specific Mutagenesis without Phenotypic Selection, " Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492，禾口 Taylor 等人(1985) 〃 The Rapid Generation of Oligonucleotide-directed Mutations at High Frequency using Phosphorothioate-modified DNA, " Nuc 1. Acids Res. 13 :8765-8787中描述。利用缺口雙鏈體DNA的誘變在例如Kramer等人 (1984)“ The Gapped Duplex DNA Approach to Oligonucleotide-directed Mutation Construction, “ Nucl. Acids Res. 12 :9441_9460)中描述。點錯配誘變在例如 Kramer 等人(1984) “ Point Mismatch Repair, “ Cell 38 :879_887)中描述。雙鏈斷裂誘變 在例如 Mandecki (1986) 〃 Oligonucleotide-directed Double-strand Break Repair in Plasmids of Escherichia coli :A Method for Site-specific Mutagenesis, " Proc. Natl. Acad. Sci. USA，83 :7177-7181，和 Arnold (1993) “ Protein Engineering for Unusual Environments, " Current Opinion in Biotechnology 4 :450_455)中描述。利 用修復(fù)缺失型宿主菌株的誘變在例如Carter等人(1985)" Improved Oligonucleotide Site-directed Mutagenesis using M13 Vectors, “ Nucl. Acids Res. 13 4431-4443 中描述。通過總基因合成的誘變在例如Nambiar等人(1984) 〃 Total Synthesis andCloning of a Gene Coding for the Ribonuclease SProtein," Science 223 :1299-1301 中描述。DNA 改組在例如 Stemmer (1994) 〃 Rapid Evolution of a Protein in vitro by DNA Shuffling, “ Nature 370 :389_391，和 Stemmer(1994) “ DNA shuffling by random fragmentation and reassembly In Vitro Recombination for Molecular Evolution, “ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 中描述。備選地，NtHMA基因可以通過將轉(zhuǎn)座子(和IS元件)引入目的植物的基因組內(nèi)而 被靶向用于失活。這些活動遺傳元件可以通過有性異體受精引入，并且插入突變體可以就 NtHMA活性中的喪失例如減少的Cd轉(zhuǎn)運進(jìn)行篩選。通過經(jīng)由例如有性異體受精使親本植 物與未實施轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的誘變的植物雜交，可以將親本植物中斷裂的NtHMA基因引入其他 植物內(nèi)?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)育種方法。在一個實施方案中，一種或 多種NtHMA相關(guān)基因可以通過插入一個或多個轉(zhuǎn)座子被失活。突變可以導(dǎo)致一種或多種 NtHMA基因的純合斷裂，一種或多種NtHMA基因的雜合斷裂，或如果斷裂超過一種NtHMA基 因，那么純合和雜合斷裂的組合。合適的可轉(zhuǎn)座元件可以選自指定為類別I和類別II的2 個廣泛類別。合適的類別I可轉(zhuǎn)座元件包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄子和SINE樣元件。此類 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如在Kumar禾口 Bennetzen (1999)，Plant Retrotransposons in Annual Review of Genetics 33 479 中描述的。備選地，NtHMA基因可以通過稱為 Targeting Induced Local Lesions IN Genomics (" TILLING")的方法而被靶向用于失活，所述方法使高密度點突變與突變的快 速靈敏檢測相組合。一般地，使植物種子暴露于誘變劑例如乙基甲磺酸(EMS)或EMS烷基化 物鳥嘌呤，這一般導(dǎo)致錯配。合適的試劑和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如在下述中描述 的McCallum等人，(2000)，“ Targeting Induced Local Lesions IN Genomics (TILLING) for Plant Functional Genomics, “ Plant Physiology 123 439-442 ；McCallum ^A, (2000)" Targeted screening for induced mutations, " Nature Biotechnology 18 455-457 ；禾口 Colbert 等人，(2001) " High-Throughput Screening for Induced Point Mutations, “ Plant Physiology 126 :480一484。備選地，NtHMA基因可以通過引入衍生自許多小環(huán)狀RNA的核酶而被靶向用于失 活，所述小環(huán)狀RNA能夠在植物中自切割和復(fù)制。這些RNA可以單獨(類病毒RNAs)或與 輔助病毒(衛(wèi)星RNA) —起復(fù)制。合適RNA的例子包括衍生自鱷梨日斑病類病毒的那些，以 及衍生自煙草環(huán)斑病毒、紫花苜蓿短暫條紋病毒、絨毛煙草斑駁病毒、茄屬植物斑駁病毒、 和地下三葉草斑駁病毒的衛(wèi)星RNA。各種靶RNA特異性核酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如在 Haseloff 等人(1988)Nature，334 :585_591 中描述的。III.包括NtHMA RNAi多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞系和種子及相關(guān)方法多個實施方案涉及通過多種方法進(jìn)行遺傳修飾以減少NtHMA基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn) 基因植物，所述方法可以用于沉默NtHMA基因表達(dá)，并且因此產(chǎn)生其中NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白的表 達(dá)水平可以在目的植物組織內(nèi)減少的轉(zhuǎn)基因植物。重金屬轉(zhuǎn)運的速率和重金屬轉(zhuǎn)運特別地 鎘轉(zhuǎn)運的分布模式可以在根據(jù)所公開的方法和組合物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物中改變。適合于遺 傳修飾的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。多個實施方案涉及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行遺傳修飾以減少 NtHMA基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述方法可以用于下調(diào)NtHMA基因表達(dá)，并且因
21此產(chǎn)生其中NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)水平可以在目的植物組織內(nèi)減少的轉(zhuǎn)基因煙草植物。 已提供多種表達(dá)載體，以產(chǎn)生顯示NtHMA基因表達(dá)水平減少的任何變種的煙草轉(zhuǎn)基因品 系。所公開的組合物和方法可以應(yīng)用于任何目的植物物種，包括煙草屬(Nicotiana)的 植物，煙草屬的多個物種，包括黃花煙草(N. rustica)和紅花煙草(N. tabacum)(例如LA B21、LN KY17U TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1 和 Petico)。其他物 種包括花煙草(N. acaulis)、尖葉腎蕨(N. acuminata)、尖葉腎蕨細(xì)葉變種(N. acuminata var. multiflora)、N. africana、紅豬籠草(N. alata)、N. amplexicaulis、N. arentsii、漸 IJt Bf ^ (N. attenuata)、N. benavidesii> ^ K ^ (N. benthamiana)、N. bigelovii、 N. bonariensis、N. cavicola、克氏煙草(N. clevelandii)、N. cordifolia、N. corymbosa、 H ft 胃(N. debneyi) > N. excelsior> ？M K ^ (N. forgetiana) > N. fragrans> N. glauca、粘煙草(N. glutinosa)、N. goodspeedii、N. gossei、N. hybrid、N. ingulba、 N. kawakamii、N. knightiana、N. langsdorffii、漸尖葉煙草(N. linearis)、N. longiflora、 N. maritima、N. megalosiphon、N.miersii、N. noctiflora、N. nudicaulis、N.obtusifolia、 N. occidentalism N. occidentalis subsp. hesperis、 耳 狀煙草(N. otophora)、 N. paniculata、N. pauciflora、碧 冬煙草(N. petunioides)、N. plumbaginifolia、 N. quadrivalvis、N. raimondii、N. repanda、N. rosulata、N. rosulata subsp. ingulba、 N. rotundifolia、N. setchellii、N. simulans、N. solanifolia、N. spegazzinii、斯氏煙草 (N. stocktonii)、# 舌甘]0 胃(N. suaveolens) >(N. sylvestris)、N. thyrsi flora、
續(xù)毛煙草(N. tomentosa) > 擬鸞花煙草(N. tomentosiformis) > N. trigonophylla> N. umbratica、波葉煙草(N. undulata)、N. velutina、N. wigandioides 禾口 N. χ sanderae。 用于轉(zhuǎn)化的合適植物包括能夠通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知轉(zhuǎn)化植物的多種方法轉(zhuǎn)化的任何 植物組織，所述方法包括電穿孔、微粒轟擊和土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移， 如例如在下述中描述的公開了用包含Ti質(zhì)粒的土壤桿菌屬菌株用于轉(zhuǎn)化敏感植物包括 雙子葉植物的方法的美國專利號4，459，355 ；公開了用土壤桿菌屬載體轉(zhuǎn)化木本植物的美 國專利號4，795，855 ；公開了二元土壤桿菌屬載體的；美國專利號4，940，838，美國專利號 4，945，050 ；和美國專利號 5，015，580。多個實施方案涉及經(jīng)遺傳修飾以內(nèi)源表達(dá)編碼NtHMA RNAi多核苷酸的RNAi構(gòu)建 體的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述NtHMA RNAi多核苷酸促進(jìn)NtHMA RNA轉(zhuǎn)錄物的降解，并且隨后 減少可用于翻譯成NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目。多個實施方案涉及包括表達(dá)載體 的轉(zhuǎn)基因植物，所述表達(dá)載體使得根據(jù)所公開的方法產(chǎn)生的NtHMA多核苷酸的表達(dá)成為可 能。多個實施方案涉及衍生自根據(jù)所公開的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞系。多個實施方 案涉及衍生自根據(jù)所公開的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。多個實施方案涉及用于減少植物中的NtHMA基因表達(dá)水平的方法，所述方法包括 減少NtHMA基因的表達(dá)水平，這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來完成。作為例 子，本公開內(nèi)容描述了 (1)通過表達(dá)NtHMA RNAi多核苷酸，用于減少可用于翻譯的內(nèi)源 NtHMA RNA變體的穩(wěn)態(tài)水平的RNA干擾方法；(2)通過將作為轉(zhuǎn)基因的NtHMA cDNA或其片 段的多個拷貝整合到植物基因組內(nèi)，用于減少一種或多種NtHMA基因轉(zhuǎn)錄的共抑制方法; (3)通過表達(dá)反義多核苷酸用于減少NtHMA翻譯的反義方法，所述反義多核苷酸可以靶向 NtHMA RNA;和(4)用于誘導(dǎo)誘變的多種方法。
多個實施方案涉及這樣的轉(zhuǎn)基因煙草植物，其通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方 法進(jìn)行遺傳修飾以減少NtHMA基因表達(dá)水平，并且進(jìn)一步進(jìn)行修飾以減少第二種目的內(nèi)源 基因(即非NtHMA相關(guān)的)的表達(dá)，或增強目的外源基因(即非NtHMA相關(guān)的)的表達(dá)。 例如，編碼涉及生物堿生物合成的酶的第二種目的內(nèi)源基因的下調(diào)可能是希望的。在其他 情況下，編碼目的重組蛋白質(zhì)例如用于治療用途的人激素的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平中的增強可 能是希望的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，其可以進(jìn)行修飾例如以外源表達(dá) NtHMA RNAi多核苷酸和至少一種目的重組基因產(chǎn)物例如重組人生長因子，或可以靶向與 NtHMA家族不相關(guān)的第二種目的基因的RNAi多核苷酸。根據(jù)所公開的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物提供了許多優(yōu)點。轉(zhuǎn)基因植物包括轉(zhuǎn)基因煙草 植物可以在包含可變Cd濃度的土壤中或在包含小于所需Cd濃度的土壤中生長。這些轉(zhuǎn)基 因植物和衍生種子可以提供用于在更廣泛范圍的土壤環(huán)境中培養(yǎng)它們的更多選擇，這可以 增加從業(yè)者(例如農(nóng)民)可獲得的可培養(yǎng)土壤量。此外，與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物相比較，顯示 減少的Cd含量的這些轉(zhuǎn)基因植物可以直接作為可食用產(chǎn)物而消費。與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物的 消費相比較，這些轉(zhuǎn)基因植物的可食用部分的消費可以是更健康的選擇?？梢愿鶕?jù)所公開 的方法遺傳修飾的合適植物包括可用于農(nóng)業(yè)用途培養(yǎng)的植物，包括水稻、玉米、南瓜、大豆、 萵苣、馬鈴薯、beats、藥草、小麥、大麥、胡蘿卜等。當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物相比較時，這些轉(zhuǎn) 基因植物包括葉片部分中的Cd減少％可以是大約至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%, 98%和99%。這些轉(zhuǎn)基因植物包括葉片部分中的Cd含量是來自下述范圍的值約0. 01至 約 0. 05ppm、約 0. 01 至約 0. IppmJ^] 0. 01 至約 0. 5ppm、約 0. 01 至約 1. Oppm、和約 0. 01 至 約 δρρ οIV.并入經(jīng)遺傳修飾以包含減少的Cd含量的煙草葉的消費品多個實施方案提供了轉(zhuǎn)基因植物，其中NtHMA基因家族成員的表達(dá)水平基本上減 少，以減少或阻礙Cd轉(zhuǎn)移到葉片內(nèi)。衍生自根據(jù)所公開的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉 片可以并入包含Cd的多種消費品內(nèi)，所述Cd處于基本上低于通過將衍生自相同基因型的 植物的煙草葉制備的消費品的那種的水平，所述衍生自相同基因型的植物在相同條件下生 長，但未就NtHMA基因家族成員的表達(dá)水平減少而言進(jìn)行遺傳修飾(“非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物”)。在某些實施方案中，與非基因組對應(yīng)物相比較顯示減少的Cd含量的這些轉(zhuǎn)基因 植物可以并入消費品內(nèi)，包括各種可抽吸物品例如雪茄煙、香煙和無煙煙草產(chǎn)品(即不可 燃的)。與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物相比較，通過并入衍生自煙草植物的煙草葉產(chǎn)生的可抽吸物品和 無煙煙草產(chǎn)品可以提供更健康的選擇，所述煙草植物根據(jù)所公開的方法進(jìn)行遺傳修飾以包 含減少的Cd水平。并入根據(jù)所公開的方法進(jìn)行遺傳修飾的煙草植物的無煙煙草產(chǎn)品可以以適合于 消費者的口腔舒適的任何形式制造。無煙煙草產(chǎn)品包含以任何形式的煙草，包括作為沉積、 混合、圍繞或以其他方式與以任何形式(例如薄片、薄膜、片劑、泡沫或珠)的其他成分相組 合的干燥顆粒、碎屑、粒劑、粉劑或漿(即煙草提取物)。無煙煙草產(chǎn)品可以用材料進(jìn)行包 裝，所述材料可以是可食用(即，經(jīng)口崩解的)或不可食用的。無煙煙草產(chǎn)品的液體內(nèi)含物 可以以例如珠的形式封裝，以排除與水溶性包裝物的相互作用。包裝物可以作為小袋成形， 以部分或完全封裝并入煙草的組合物，或充當(dāng)粘合劑以使煙草的多個片劑、珠或薄片保持在一起。包裝物也可以封裝可塑煙草組合物，其適應(yīng)消費者的口的形狀。經(jīng)口崩解的包裝 物可以封裝無煙煙草，例如作為干鼻煙或可溶煙草，并且可以在連續(xù)熱壓成形或水平形式/ 填充/密封設(shè)備或使用可食用薄膜(其可以包含或不包含煙草)的其他合適的包裝設(shè)備上 成型。用于構(gòu)建包裝物的示例性材料包括薄膜組合物，包括HPMC、CMC、果膠、海藻酸鹽、支 鏈淀粉和其他商購可得的可食用薄膜成型聚合物。其他包裝材料可以包括由明膠、HPMC^g 粉/角叉菜膠或其他商購可得材料產(chǎn)生的預(yù)成型的膠囊。此類包裝材料可以包括煙草作為 成分。無法經(jīng)口崩解的包裝物可以由針織或非針織編織物(nonwoven fabrics)、涂層或無 涂層紙、或穿孔或其他多孔塑料薄膜組成。包裝物可以并入調(diào)味劑和/或著色劑。無煙產(chǎn) 品可以利用商業(yè)包裝領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法與包裝物裝配在一起，包括諸如泡罩包 裝和stik-包裝方法，其中小包裝可以通過垂直形式/填充/密封包裝機器成型。當(dāng)與衍生自非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物的消費品相比較時，通過并入衍生自經(jīng)遺傳修飾以包 含減少的Cd水平的煙草植物的煙草葉產(chǎn)生的、這些可抽吸物品和無煙產(chǎn)品中的Cd減少％ 是至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 和 100% 的值。在某些實施方案中，通 過并入衍生自經(jīng)遺傳修飾以包含減少的Cd水平的煙草植物的煙草葉產(chǎn)生的、這些可抽吸 物品和無煙產(chǎn)品中的Cd含量是來自下述范圍的值約0.01至約0. 05ppm、約0.01至約 0. IppmJ^] 0. 01 至約 0. 5ppm、約 0. 01 至約 1. Oppm、和約 0. 01 至約 5ppm。植物中的Cd累積程度可以依賴于歸于基因型復(fù)雜度和生長環(huán)境的幾種參數(shù)而基 本上不同。例如，田間生長的煙草葉中的Cd濃度可以依賴于諸如農(nóng)業(yè)氣候、土壤參數(shù)和栽 培變種的因素而極端不同。此外，在煙草植物的不同部分內(nèi)的相對Cd分布模式可以根據(jù)物 種、器官/組織和生長條件(即田間生長與水耕法生長比較)而改變。平均起來，在田間生 長的煙草葉(包括中脈和葉脈)中測量的Cd濃度可以在約0.5至5ppm(百萬分之，或ug/ g煙草干重)的范圍內(nèi)。然而，許多公開的Cd水平一般不限定煙草成熟階段、煙草變種或收 獲用于分析的特定葉部分(即從葉柄位置切除)。在某些變種中，較低的葉可能累積比中部 和較高的葉更高的Cd水平。在細(xì)胞內(nèi)水平上，Cd可以在植物細(xì)胞的各種細(xì)胞組分中發(fā)現(xiàn)， 包括細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、核和液泡。此外，在煙草葉中測量的Cd含量可以依賴于其中煙草植物所生長的土壤環(huán)境中 的Cd水平而基本上改變。與在非污染區(qū)中生長的遺傳上等同的對應(yīng)物的葉相比較(其可 以累積約0. 4至約Sppm的Cd)，在Cd污染區(qū)中生長的煙草的葉可以累積約35ppm或更高的 Cd。在Cd污染區(qū)中生長的植物的葉內(nèi)的液泡可以累積極高的Cd濃度。用于修飾所公開的 組合物以適合于給定目的植物物種的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
實施例實施例1全長煙草屬NtHMA基因組克隆的克隆和外顯子作圖獨立地鑒定了代表內(nèi)源NtHMA基因的不同部分的2個部分基因組克隆，稱為“CH0_ 0F96xf01. abl ”和“CH0_0F261XO09cl. abl”?；诘米圆糠只蚪M克隆的序列信息，隨后鑒 定了全長基因組克隆(_H0-18-2)和4個全長NtHMA cDNA，包括克隆P6663 (SEQ IDNO 3)和 克隆P6643(SEQ ID NO :47)。繪制了全長基因組克隆(_Η0_18_2) (17，921bp)的外顯子和內(nèi)含子亞區(qū)的圖。如圖1中所示，從煙草屬中克隆的全長內(nèi)源NtHMA基因包括由總共3392 個核苷酸組成的11個外顯子。實施例2編碼RNAi多核苷酸的NtHMA RNAi表達(dá)載體PBI121-NtHMA (660-915)的構(gòu)建表1提供了對經(jīng)分離的NtHMA基因組克隆(SEQ ID N0:1)內(nèi)的每個外顯子作圖的 核苷酸位置列表。表 權(quán)利要求
經(jīng)分離的多核苷酸，其選自包括這樣的序列或由這樣的序列組成且編碼具有P1B型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸，所述序列與SEQ ID NO1具有至少70％序列同一性；包括這樣的序列或由這樣的序列組成的多核苷酸，所述序列與SEQID NO3具有至少70％序列同一性；包括這樣的序列或由這樣的序列組成的多核苷酸，所述序列與SEQID NO47具有至少70％序列同一性；包括編碼這樣的多肽的序列或由編碼這樣的多肽的序列組成的多核苷酸，所述多肽與SEQ ID NO2具有至少70％序列同一性，其中所述多肽是具有P1B型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白；和包括編碼這樣的多肽的序列或由編碼這樣的多肽的序列組成的多核苷酸，所述多肽與SEQ ID NO49具有至少70％序列同一性，其中所述多肽是具有P1B型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白。
2.表達(dá)載體，其包括權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸。
3.通過這樣的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物，所述方法包括引入權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核 苷酸或權(quán)利要求2的表達(dá)載體。
4.通過這樣的方法制備的細(xì)胞系，所述方法包括引入權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸 或權(quán)利要求2的表達(dá)載體。
5.可消費煙草產(chǎn)品，其并入從權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因植物中收獲的葉。
6.能夠抑制它與之相對應(yīng)的NtHMA信使RNA表達(dá)的NtHMARNAi構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包 括下述或由下述組成與SEQ ID NO 3或47的部分具有至少70%序列同一性的第一序列；第二序列；和以與所述第一序列相同的定向放置、具有所述第一序列的反向互補序列的第三序列，其中所述第二序列放置在所述第一序列和所述第三序列之間，并且所述第二序列與所 述第一序列和所述第三序列可操作地連接。
7.權(quán)利要求6的NtHMARNAi構(gòu)建體，其中(a)所述第一序列與選自下述一個或多個的序列具有至少95%序列同一性外顯子 KSEQ ID NO :5)、外顯子 1(SEQ ID NO 5)的片段、外顯子 2 (SEQ ID NO :7)、外顯子 2 (SEQ ID NO 7)的片段、外顯子3 (SEQ ID NO :9)、外顯子3 (SEQ ID NO 9)的片段、外顯子4 (SEQ ID NO: 11)、外顯子 4 (SEQ ID NO: 11)的片段、外顯子 5 (SEQ ID NO 13)、外顯子 5 (SEQ ID NO: 13)的片段、外顯子6 (SEQ ID NO 15)、外顯子6 (SEQ ID NO: 15)的片段、外顯子7 (SEQ ID NO 17)、外顯子 7 (SEQ ID NO: 17)的片段、外顯子 8 (SEQ ID NO 19)、外顯子 8 (SEQ ID NO: 19)的片段、外顯子9 (SEQ ID NO :21)、外顯子9 (SEQ ID NO 21)的片段、外顯子10 (SEQ ID NO :23)、外顯子 10 (SEQ ID NO :23)的片段、外顯子 11 (SEQ ID NO :25)、和外顯子 11 (SEQ ID NO 25)的片段；(b)所述第二序列與選自下述一個或多個的序列具有至少95%序列同一性內(nèi)含子 KSEQ ID NO :4)、內(nèi)含子 1(SEQ ID NO 4)的片段、內(nèi)含子 2 (SEQ ID NO :6)、內(nèi)含子 2 (SEQ ID NO 6)的片段、內(nèi)含子3 (SEQ ID NO :8)、內(nèi)含子3 (SEQ ID NO 8)的片段、內(nèi)含子4 (SEQID NO: 10)、內(nèi)含子 4 (SEQ ID NO: 10)的片段、內(nèi)含子 5 (SEQ ID NO 12)、內(nèi)含子 5 (SEQ ID NO: 12)的片段、內(nèi)含子6 (SEQ ID NO 14)、內(nèi)含子6 (SEQ ID NO: 14)的片段、內(nèi)含子7 (SEQ ID NO 16)、內(nèi)含子 7 (SEQ ID NO: 16)的片段、內(nèi)含子 8 (SEQ ID NO 18)、內(nèi)含子 8 (SEQ ID NO: 18)的片段、內(nèi)含子9 (SEQ ID NO 20)、內(nèi)含子9 (SEQ ID NO 20)的片段、內(nèi)含子10 (SEQ ID NO :22)、內(nèi)含子 10 (SEQ ID NO 22)的片段、內(nèi)含子 11 (SEQ ID NO :24)、內(nèi)含子 11 (SEQ ID NO 24)的片段、內(nèi)含子12 (SEQ ID NO :26)、和內(nèi)含子12 (SEQ ID NO 26)的片段；(c)所述第三序列與選自下述一個或多個的序列具有至少95%序列同一性SEQID NO :27、SEQ ID NO 27 的片段、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 28 的片段、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 29 的片段、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 30 的片段、SEQ ID NO :31、SEQID NO 31 的 片段、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 32 的片段、SEQ IDNO :33、SEQ ID NO 33 的片段、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO 34 的片段、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 35 的片段、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO 36 的片段、SEQ ID NO :37、禾口 SEQ ID NO 37 的片段；(d)所述第一序列包括SEQID NO :38，所述第二序列包括SEQID N0:39，并且所述第三 序列包括SEQ ID NO 40 ；(e)所述第一序列包括SEQID NO :42，所述第二序列包括SEQID N0:43，并且所述第三 序列包括SEQ ID NO 44 ；或(f)(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的一個或兩個或三個。
8.權(quán)利要求6的NtHMARNAi構(gòu)建體，其中所述第一個和第二序列各自具有選自下述 的長度20-30個核苷酸、30-50個核苷酸、50-100個核苷酸、100-150個核苷酸、150-200 個核苷酸、200-300個核苷酸、300-400個核苷酸、400-500個核苷酸、500-600個核苷酸、和 600-700個核苷酸。
9.包括權(quán)利要求6-8中任一項的RNAi的轉(zhuǎn)基因植物，與非轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物中的部分相比 較，所述轉(zhuǎn)基因植物在植物的至少部分中具有減少的Cd水平。
10.可消費煙草產(chǎn)品，其并入從權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物中收獲的葉。
11.權(quán)利要求10的產(chǎn)品，其中Cd減少％是至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%, 98%或99%的值。
12.權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的產(chǎn)品，其中所述Cd含量是約0.01至約0. 05ppm、約 0. 01 至約 0. IppmJ^] 0. 01 至約 0. 5ppm、約 0. 01 至約 1. Oppm、或約 0. 01 至約 5ppm 的值。
13.用于減少植物的至少部分中的Cd水平的方法，其包括通過引起RNAi構(gòu)建體的表達(dá)減少所述植物中的NtHMA mRNA水平。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述RNAi構(gòu)建體包括與SEQ ID NO 3或47的部分具有至少90%序列同一性的第一序列；第二序列；和以與所述第一序列相同的定向放置、具有所述第一序列的反向互補序列的第三序列，其中所述第二序列放置在所述第一序列和所述第三序列之間，并且所述第二序列與所 述第一序列和所述第三序列可操作地連接。
15.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的方法，其中在所述RNAi構(gòu)建體表達(dá)后，所述植物的 部分具有減少至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的 Cd 含量。
16.權(quán)利要求13至15中任一項的方法，其中在所述RNAi構(gòu)建體表達(dá)后，所述植物的 部分具有約0. 01至約0. 05ppm、約0. 01至約0. lppm、約0. 01至約0. 5ppm、約0. 01至約 1. Oppm、或約0. 01至約5ppm的Cd含量。
17.基本上純化的多肽，其與SEQID NO :2或49具有至少70%序列同一性或至少95% 序列同一性，其中所述多肽是具有PlB型ATP酶活性的NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白。
18.抗體，其與如權(quán)利要求17中限定的多肽特異性結(jié)合，例如包括SEQID NO 2或49 或由SEQ ID NO 2或49組成的多肽。
全文摘要
本發(fā)明部分涉及轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因煙草植物和衍生種子，其進(jìn)行遺傳修飾以通過減少HMA相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)水平，阻礙從轉(zhuǎn)基因植物的根系到氣生部分的鎘(Cd)轉(zhuǎn)運。本發(fā)明包括經(jīng)遺傳修飾以穩(wěn)定表達(dá)編碼RNAi多核苷酸的RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述RNAi多核苷酸使得內(nèi)源NtHMA RNA變體的降解成為可能。在轉(zhuǎn)基因植物中NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的減少導(dǎo)致葉片中基本上減少的鎘(Cd)含量。通過并入衍生自轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉可以產(chǎn)生基本上不含或在Cd含量中基本上減少的各種消費品，所述轉(zhuǎn)基因煙草植物進(jìn)行修飾以減少NtHMA轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)。
文檔編號C12N15/82GK101952442SQ200880125345
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者A·哈耶斯, C·庫蒂斯普迪, R·范德霍文 申請人:菲利普莫里斯生產(chǎn)公司