一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥1號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究主要采用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，研究發(fā)現(xiàn)不同的植物應(yīng)用此種方法獲得的轉(zhuǎn)化效率差異也很大。雙子葉植物是農(nóng)桿菌的天然宿主，1983年Zambryski等應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將T?DNA轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞，獲得第一株轉(zhuǎn)基因植物。在雙子葉植物上取得了巨大成功，研究者們繼續(xù)探索單子葉植物的轉(zhuǎn)化。直到20世界90年代才取得了一系列進(jìn)展。水稻是最早應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的禾本科植物，1994年Hiei等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將GUS基因?qū)胨净蚪M中，轉(zhuǎn)化率高達(dá)28.6%，其研究成果突破了農(nóng)桿菌不能轉(zhuǎn)化單子葉植物的禁區(qū)。Ishida等以玉米未成熟的胚為轉(zhuǎn)化受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化率為5?30%。Tingay等利用農(nóng)桿菌侵染大麥，獲得轉(zhuǎn)化率為4.2%。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法在小麥上的應(yīng)用，直到1997年才取得成功，Cheng等用農(nóng)桿菌侵染小麥幼胚，成功得到轉(zhuǎn)基因小麥植株。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法具有可插入大片度DNA、插入基因拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)化頻率高、表達(dá)效果好、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的植物轉(zhuǎn)化的方法。
[0003]雙子葉植物富含酚類物質(zhì)能夠作為誘導(dǎo)信號(hào)，對(duì)農(nóng)桿菌較為敏感，如番茄、馬鈴薯和胡蘿卜等。而禾本科作物中缺少這類物質(zhì)，即使產(chǎn)生了其含量也不高。因此，在國(guó)際權(quán)威雜志上，瑞士科學(xué)家Potrykus發(fā)表了悲觀的論點(diǎn)包括:1、大多數(shù)單子葉植物上不包含農(nóng)桿菌附著位點(diǎn)；2、大多數(shù)單子葉植物損傷部位的細(xì)胞容易造成木質(zhì)化或最終導(dǎo)致死亡；3、大多數(shù)單子葉植物缺少與Vir區(qū)基因活化誘導(dǎo)相關(guān)的因子。因此認(rèn)為單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物幾乎不能實(shí)現(xiàn)。由于小麥的基因組龐大，遺傳背景復(fù)雜且轉(zhuǎn)基因起步較晚等因素，因此農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在小麥的遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用進(jìn)展緩慢。
[0004]1988年Woolston等用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥細(xì)胞，但一直沒有得到轉(zhuǎn)基因植株。最終在1997年Cheng等以剛剝離的小麥幼胚為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法第一次成功獲得了轉(zhuǎn)基因的小麥植株。1999年夏光敏等應(yīng)用攜帶nptll基因的農(nóng)桿菌Agll轉(zhuǎn)化7種小麥品種，經(jīng)過再生植株分子鑒定，證明再生植株為轉(zhuǎn)基因的小麥植株。Wu等人應(yīng)用AGLl菌株轉(zhuǎn)化小麥幼胚，獲得了能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率高達(dá)3.3%。此后，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥的方法日趨完善。
[0005]而東農(nóng)冬麥I號(hào)是目前黑龍江省高寒地區(qū)唯一可以安全越冬的冬小麥品種，可耐受?30°C低溫，返青率在85%左右，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)小麥進(jìn)行遺傳改良具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提出了一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的方法，以東農(nóng)冬麥I號(hào)的成熟胚為試驗(yàn)材料，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，從而建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體，為其抗性和品質(zhì)等基因工程改良奠定研究基礎(chǔ)。
[0007]本發(fā)明提出的一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟:
51、挑選當(dāng)年籽粒飽滿的東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟種子，消毒，滅菌，清洗后，置于黑暗培養(yǎng)箱的無(wú)菌水中過夜；然后在無(wú)菌狀態(tài)下，將過夜后的種子無(wú)菌干燥后，采用胚切傷略帶胚乳法進(jìn)行取胚，將胚的盾片朝上接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到胚性愈傷組織；再將胚性愈傷組織置于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)得到預(yù)培養(yǎng)愈傷組織；
52、取農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)；接著挑取培養(yǎng)得到的農(nóng)桿菌單菌落接種在液體YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心得到菌液；將菌液加入侵染培養(yǎng)基中重懸得到混合物料；
53、將預(yù)培養(yǎng)愈傷組織浸入混合物料中侵染，吸取多余菌液，無(wú)菌干燥，然后置于含有兩層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng)3?5d ;再置于恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)2周；接著置于分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選4周得到再生植株，其中每隔2周更換I次分化篩選培養(yǎng)基；
54、將再生植株置于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)18?22d后，打開瓶口煉苗2?4d，然后將植株移栽到花盆中培養(yǎng)。
[0008]優(yōu)選地，SI中，黑暗培養(yǎng)箱中溫度為25± 1°C。
[0009]優(yōu)選地，SI中，無(wú)菌干燥的具體操作為將浸泡過夜后的種子置于無(wú)菌濾紙上以吸干過夜后的種子表面水分。
[0010]優(yōu)選地，SI中，取胚的過程中在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
[0011]優(yōu)選地，SI中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、450?550mg/L酪蛋白、80?120mg/L谷氨酰胺、0.05 ?0.15mg/L ΝΑΑ、0.2 ?0.4g/L 肌醇、0.8 ?1.2g/L 脯氨酸、0.4 ?0.6mg/L ΑΒΑ,0.9 ?1.lmg/L 2，4_D、28 ?32g/L 蔗糖和 7 ?9g/L 瓊脂。
[0012]優(yōu)選地，SI中，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、450?550mg/L酪蛋白、80?120mg/L谷氨酰胺、0.05 ?0.15mg/L ΝΑΑ、0.2 ?0.4g/L肌醇、0.8 ?1.2g/L脯氨酸、0.4 ?0.6mg/L ΑΒΑ、1.9 ?2.lmg/L 2，4_D、28 ?32g/L 蔗糖和 7 ?9g/L 瓊脂。
[0013]優(yōu)選地，SI中，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.5?6。
[0014]優(yōu)選地，SI中，預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間為6?18d，優(yōu)選為18d。
[0015]優(yōu)選地，S2中，液體YEB培養(yǎng)基包括:4?6g/L蛋白胨、0.8?1.2g/L酵母提取物、4 ?6g/L 牛肉膏、0.3 ?0.7g/L MgSO4*7H20、45 ?55mg/L 利福平、45 ?55mg/L 卡那霉素、45?55mg/L鏈霉素、4?6g/L蔗糖、12?18g/L瓊脂。
[0016]優(yōu)選地，S2中，液體YEB培養(yǎng)基pH值為6.5?7.5。
[0017]優(yōu)選地，S2中，菌液濃度為OD6tm=0.5?1.0，優(yōu)選為OD6tw=0.8。
[0018]優(yōu)選地，S2中，侵染培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、180?220 ymol/L AS、1.9?2.0g/L MES, 28 ?32g/L 蔗糖。
[0019]優(yōu)選地，S2中，侵染培養(yǎng)基的pH值為5?5.5。
[0020]優(yōu)選地，S3中，侵染的時(shí)間為I?5h，優(yōu)選為3h。
[0021]優(yōu)選地，S3中，共培養(yǎng)的時(shí)間為5d。
[0022]優(yōu)選地，S3中，恢復(fù)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、450?550mg/L酪蛋白、80?120mg/L谷氨酰胺、0.05 ?0.15mg/L ΝΑΑ、0.2 ?0.4g/L 肌醇、0.8 ?1.2g/L 脯氨酸、0.4 ?0.6mg/L ABA、1.9 ?2.lmg/L 2，4_D、240 ?260mg/L 頭孢霉素、230 ?270mg/L 羧芐青霉素、28 ?32g/L蔗糖和7?9g/L瓊脂。
[0023]優(yōu)選地，S3中，恢復(fù)培養(yǎng)基的pH值為5?5.5。
[0024]優(yōu)選地，S3中，分化篩選培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、0.05?(λ 15mg/L ΝΑΑ,Ο.12?0.138/1肌醇、0.9?1.lg/L 脯氨酸、3 ?5mg/L 6_BA、230 ?270mg/L 頭孢霉素、240 ?260mg/L羧芐青霉素、28?32mg/L潮霉素、28?32g/L蔗糖和7?9g/L瓊脂。
[0025]優(yōu)選地，S3中，分化篩選培養(yǎng)的pH值為5.5?6。
[0026]優(yōu)選地，S4中，生根培養(yǎng)基包括:1/2 MS培養(yǎng)基、0.3?0.5mg/L NAA、230?270mg/L頭孢霉素、240?260mg/L羧芐青霉素、28?32g/L蔗糖和7?9g/L瓊脂。
[0027]優(yōu)選地，S4中，生根培養(yǎng)基的pH值為5.5?6。
[0028]上述SI中，“胚切傷略帶胚乳法”具體操作為:在胚部橫縱各切幾刀，切傷胚再取出，取胚時(shí)略帶一部分胚乳。
[0029]上述“NAA”，為萘乙酸的簡(jiǎn)稱，是一種植物激素生長(zhǎng)素，常用于商用的發(fā)根粉或發(fā)根劑中，在植物使用扦插法繁殖時(shí)使用。它也可用于植物組織培養(yǎng)。上述“ΑΒΑ”為脫落酸，又稱為脫落素或休眠素，是一種抑制生長(zhǎng)的植物激素，因能促使葉子脫落而得名?？赡軓V泛分布于高等植物。除促使葉子脫落外尚有其他作用，如使芽進(jìn)入休眠狀態(tài)、促使馬鈴薯形成塊莖等。對(duì)細(xì)胞的延長(zhǎng)也有抑制作用。上述“2，4-D”為2，4-二氯苯氧乙酸的簡(jiǎn)稱，是一種生長(zhǎng)素類似物。在普通的植物生長(zhǎng)素定量法中顯示有高的活性，但在采用植物生長(zhǎng)素標(biāo)準(zhǔn)定量法的燕麥伸長(zhǎng)試驗(yàn)中，其效頗低。上述“AS”為乙酰丁香酮的英文縮寫，可可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因活化，從而促進(jìn)外源基因的整合。上述“1^5”為2-0-嗎啉)乙磺酸一水合物的簡(jiǎn)稱，主要用于生物緩沖劑。上述“6-