專利名稱：用于生物制品生產(chǎn)的人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是利用基因重組技術(shù)構(gòu)建用以生產(chǎn)病毒、疫苗及 重組多肽藥物等生物制品的細胞系，以及該細胞系在病毒等生物制品制備過程中的用途。
背景技術(shù)：
某一特定病毒的生產(chǎn)需要特定的宿主細胞系，通常，病毒與其宿主細胞之間存在 著相互適應(yīng)的關(guān)系。例如，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病、惡性腫瘤的治療以及新型基因工 程疫苗等領(lǐng)域的研究腺病毒載體，在體外培養(yǎng)腺病毒過程中最為廣泛的宿主細胞是HEK293 細胞。近年來，隨著腺病毒載體的應(yīng)用日益廣泛，特別是隨著腺病毒載體大量、深入的應(yīng)用 為各種疾病的臨床試驗，人們發(fā)現(xiàn)利用HEK293細胞培養(yǎng)第一代腺病毒載體(El區(qū)或/和E3 區(qū)缺失)時，整合于HEK293細胞基因組中的腺病毒序列(包括4. 3kb長度的腺病毒DNA片 段，該段DNA含有完整的腺病毒Ela和Elb序列及Ela啟動子區(qū)域)可以和第一代腺病毒 載體發(fā)生重組，從而產(chǎn)生回復(fù)突變野生腺病毒。這種現(xiàn)象對于腺病毒載體的臨床應(yīng)用是一 個重大的安全隱患。針對HEK293細胞的這一缺陷，荷蘭Crucell公司發(fā)展了一種新的細胞系PER. C6， 該細胞株來源于腺病毒Ela/Elb基因轉(zhuǎn)化的人胚成視網(wǎng)膜細胞(retinoblasts)，在大規(guī)模 生產(chǎn)腺病毒載體的過程中應(yīng)用PER. C6細胞作為宿主細胞可以大大減少或杜絕回復(fù)突變野 生腺病毒的產(chǎn)生。隨后的研究及應(yīng)用擴大了該細胞株的使用范圍，目前將該細胞株應(yīng)用于 抗體生產(chǎn)以及流感疫苗的生產(chǎn)中也取得了很好的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種改進的人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞系SL-2，該細胞系具有優(yōu)于 HEK293細胞的特點。本發(fā)明的另一目的是提供利用SL-2細胞系生產(chǎn)腺病毒、流感病毒、單 純皰疹病毒、麻疹病毒和輪狀病毒等病毒、疫苗及重組多肽的用途。人胚成視網(wǎng)膜細胞適合于構(gòu)建生產(chǎn)病毒制品、疫苗及重組多肽類生物制品的細胞 株，而為了將其應(yīng)用于大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)，需要建成可以穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)化細胞系。本發(fā) 明采用不同與Per. C6細胞構(gòu)建的方法，利用合適的腺病毒基因片段轉(zhuǎn)化人胚視網(wǎng)膜細胞， 構(gòu)建成功了人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞系SL-2。在本發(fā)明中，我們首先構(gòu)建了質(zhì)粒pSL28，該質(zhì)粒缺失了腺病毒左側(cè)100個堿基長 度的基因片段，保留了腺病毒啟動子和Ela/Elb基因。隨后我們將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人胚視網(wǎng)膜 細胞，獲得了轉(zhuǎn)化細胞系SL-2。我們對該細胞系的特性進行了測試和評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該 細胞系具有良好的生長特性，其生長密度是HEK293細胞的2. 7倍，單個細胞的病毒產(chǎn)量與 HEK293細胞相當(dāng)(11000—15000病毒顆粒/每細胞)，病毒總產(chǎn)率是HEK293細胞的2_3倍， 而回復(fù)突變野生腺病毒的產(chǎn)生幾率是HEK293細胞的1/1000以下。綜上結(jié)果，人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞系SL-2具有良好的特性，可以應(yīng)用于病毒制品、 疫苗及多肽藥物等生物制品的生產(chǎn)。


圖1.轉(zhuǎn)化細胞用質(zhì)粒pSL28的結(jié)構(gòu)圖譜圖2. SL-2細胞和HEK293細胞Ela基因的表達，圖中可見SL_2細胞的E1 a表達水 平高于HEK293細胞。
具體實施例方式實施例lpSU8質(zhì)粒的構(gòu)建pXCl質(zhì)粒含有人腺病毒基因序列，從bp22到bp5790 (McKinnon et. al. Gene. 1982，19，33-42)。我們首先刪除了 pXCl質(zhì)粒中的Bsa BI片段，得到質(zhì)粒pSL26。利 用PCR方法擴增出腺病毒左側(cè)bplOO到xbal(bpl339)片段，擴增引物是正義鏈引物5，-AGAATT CCC CTT CCA GCT CTC TGC CCC-3，反義鏈引物5，-ACAGCT ATC CGT ACT ACT AT-3，將擴增出的片段克隆入T載體pCST，由此可得質(zhì)粒pSL27。將pSL27質(zhì)粒中的EcoRI-XbaI片段置換pXCl質(zhì)粒中的EcoRI-XbaI片段，得到質(zhì) 粒pSL28。(pSU8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜見附圖1)實施例2應(yīng)用pSU8質(zhì)粒對人胚視網(wǎng)膜細胞的轉(zhuǎn)化制備PSU8質(zhì)粒，在添加hvitrogen公司轉(zhuǎn)化試劑Lipofectmine的情況下，利用 PSL28質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人胚視網(wǎng)膜細胞，得到人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞株。我們共得到9個轉(zhuǎn)化細胞克 隆，經(jīng)過對各個細胞克隆的Ela基因表達的檢測，挑取其中高效表達Ela基因的一株細胞克 隆，命名為SL-2細胞株。與HEK293細胞相比，SL-2細胞可以更高水平的表達Ela基因。檢 測結(jié)果見附圖2。圖中可見，平行重復(fù)三次檢測的試驗中，SL-2細胞的Ela基因表達水平高 于HEK293細胞。SL-2細胞是人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞系，該細胞系已經(jīng)保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心(地址中國武漢武漢大學(xué)430072，保藏日期2009年10月13日，保藏編 號CCTCC C200960，該生物材料的分類名稱人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞系(Transformed Human Embryo Retina Cell)。實施例3SL-2細胞株生產(chǎn)腺病毒特性檢測我們對SL-2細胞株生產(chǎn)病毒特性進行一系列檢測。在細胞株穩(wěn)定性檢測中，我 們將SL-2細胞株連續(xù)傳代40次，所有后代次的細胞均能夠穩(wěn)定表達Ela基因產(chǎn)物。利用 Ad5LacZ腺病毒載體(缺失El區(qū)基因)感染各個代次的SL-2細胞，Ad5LacZ腺病毒載體可 以在所有代次的SL-2細胞中順利生長，經(jīng)檢測，各個代次的SL-2細胞，經(jīng)Ad5LacZ腺病毒 載體感染，收獲子代病毒，平均每個細胞中可以產(chǎn)生11000-15000病毒顆粒。經(jīng)培養(yǎng)中對 單位培養(yǎng)面積內(nèi)細胞數(shù)量的計數(shù)，并與HEK293細胞比較，發(fā)現(xiàn)在單位培養(yǎng)面積內(nèi)，SL-2細 胞的數(shù)量是HEK293細胞數(shù)量的2. 5倍。對單位培養(yǎng)面積內(nèi)產(chǎn)生的病毒總數(shù)進行比較，發(fā)現(xiàn) SL-2細胞產(chǎn)生的病毒數(shù)量是HEK293細胞產(chǎn)生的病毒數(shù)量的2_3倍。對產(chǎn)生回復(fù)突變野生腺病毒水平的檢測利用經(jīng)過噬斑純化的Ad5LacZ腺病毒 載體分別培養(yǎng)在相同數(shù)量的SL-2細胞和HEK293細胞中，感染三天后，收獲細胞，采用超速 離心方法純化得到子代病毒，并檢測子代病毒中回復(fù)突變野生腺病毒的水平，結(jié)果顯示，經(jīng) HEK293細胞培養(yǎng)，子代Ad5LacZ腺病毒載體中回復(fù)突變野生腺病毒水平為1/106，經(jīng)SL-2細胞培養(yǎng)，子代Ad5LacZ腺病毒載體中回復(fù)突變野生腺病毒水平為1/109。由此可見，應(yīng)用 SL-2細胞株生產(chǎn)腺病毒，回復(fù)突變野生腺病毒的產(chǎn)生幾率是HEK293細胞的1/1000以下。本發(fā)明中的SL-2細胞株也適用于制備其它病毒及生物制品，如用作流感病毒、單 純皰疹病毒、麻疹病毒和輪狀病毒等病毒生產(chǎn)的宿主細胞，以及用作多肽藥物如抗體生產(chǎn) 中的工程細胞。盡管上文以實施例詳細描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解，可對本發(fā)明 進行任何改變而不偏離本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞，其特征在于利用了人腺病毒基因片段對人胚視網(wǎng)膜細胞 進行轉(zhuǎn)化，由此得到的人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞可以特異性表達腺病毒Ela基因。
2.權(quán)利要求1中所述的細胞系，為SL-2細胞系(保藏號CCTCC-C200960)。
3.權(quán)利要求1或2中所述的細胞系，其用作腺病毒制備過程中的宿主細胞的用途。
4.權(quán)利要求1或2中所述的細胞系，其用作流感病毒、單純皰疹病毒、麻疹病毒和輪狀 病毒等病毒制備過程中的宿主細胞的用途。
5.權(quán)利要求1或2中所述的細胞系，其用作多肽及其他生物制品制備過程中的宿主細 胞的用途。
全文摘要
本發(fā)明利用腺病毒基因片段轉(zhuǎn)化人胚視網(wǎng)膜細胞，構(gòu)建了一種人胚視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化細胞系SL-2，該細胞系可用于腺病毒等生物制品的生產(chǎn)，具有顯著的優(yōu)點。同時，該細胞系還可以用來生產(chǎn)流感病毒、單純皰疹病毒、麻疹病毒和輪狀病毒等病毒，以及多肽等生物制品。
文檔編號C12R1/91GK102041246SQ20091019725
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者梁旻, 石長信 申請人:梁旻, 石長信