專利名稱：利用調(diào)控蛋白基因提高阿維菌素的產(chǎn)量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域以及微生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一類與阿維菌素產(chǎn)量相關(guān)
的基因以及操作該類基因提高阿維菌素產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
阿維菌素(Avermectins， AVM)是一類廣泛使用的農(nóng)用抗生素，它由除蟲鏈霉菌 (Str印tomyces avermitilis)產(chǎn)生，具有十六元大環(huán)內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其分子根據(jù)C_5、 C22-23, C26位置上的結(jié)構(gòu)差別可分為Ala、Alb、A2a、A2b、Bla、Blb、B2a、B2b八種組分。其 中Bla是最具活性的組分，被廣泛應(yīng)用于家畜寄生蟲的感染治療和農(nóng)業(yè)蟲害的防治，目前 已經(jīng)成為一種非常重要的生物農(nóng)藥。 從阿維菌素作為一種廣譜抗生素應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)以來，以提高菌種發(fā)酵產(chǎn)量的研 究工作一直未曾停止，其中使用最為頻繁的是常規(guī)的誘變育種，但是這種方法有相當(dāng)大的 隨機(jī)性，而且菌種經(jīng)長期使用誘變劑處理后，其生存能力會(huì)慢慢下降。通過對(duì)阿維菌素生物 合成的研究，可以發(fā)現(xiàn)其生物合成途徑受特異的調(diào)控基因調(diào)控，而這些調(diào)控基因有可能存 在于阿維菌素生物合成基因簇之內(nèi)，也有可能存在于生物合成基因簇之外。這些廣泛存在 的全局性調(diào)控基因、各種調(diào)控因子與其調(diào)控蛋白以及與特異的調(diào)控基因相互影響，形成了 一個(gè)大型的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控阿維菌素的產(chǎn)量。 目前，國際上對(duì)調(diào)控系統(tǒng)的研究主要集中在天藍(lán)色鏈霉菌基因序列，而對(duì)除蟲鏈 霉菌中調(diào)控基因調(diào)控抗生素的生產(chǎn)研究不多，因此發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控阿維菌素生產(chǎn)的基因，通 過消除負(fù)調(diào)控基因，過量表達(dá)正調(diào)控基因，對(duì)提高阿維菌素的產(chǎn)量有著十分重要的應(yīng)用意 義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供若干提高阿維菌素生產(chǎn)的基因及調(diào)控方法。 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供兩種位于阿維菌素生物合成基因簇序列以外的調(diào)控蛋
白基因序列，通過在除蟲鏈霉菌中敲除這兩種調(diào)控蛋白基因可以提高阿維菌素的產(chǎn)量，所
述的調(diào)控蛋白基因選自avaL2基因(核苷酸序列表序列1)和avaRl基因(核苷酸序列表
序列2)，并且所述的基因來自除蟲鏈霉菌基因組。 在另一優(yōu)選例中，提供一種位于阿維菌素生物合成基因簇序列以外的調(diào)控蛋白基
因序列，通過在除蟲鏈霉菌中敲除該基因可以使得阿維菌素的產(chǎn)量降低，所述的調(diào)控蛋白
基因選自avaR2基因，并且所述的調(diào)控蛋白基因選自除蟲鏈霉菌基因組。 本發(fā)明的第二方面，提供一種提高除蟲鏈霉菌中阿維菌素產(chǎn)量的方法，包括以下
步驟在除蟲鏈霉菌基因組中敲除調(diào)控蛋白基因，并且訴述的調(diào)控蛋白基因選自avaL2基
因或avaRl基因。 本發(fā)明中所述的將目的調(diào)控蛋白基因在除蟲鏈霉菌基因組中敲除包括以下步驟
(a)構(gòu)建含有目標(biāo)基因5'和3'旁側(cè)序列和紅霉素抗性基因的敲除載體。
(b)將含有基因取代載體的宿主菌株作為供體菌株，通過供體菌株-鏈霉菌接合
轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入到除蟲鏈霉菌中，得到含有基因取代載體的除蟲鏈霉菌轉(zhuǎn)化子。
(c)轉(zhuǎn)化子經(jīng)高溫誘導(dǎo)得到單交換突變株，再將單交換突變株傳代后獲得發(fā)生了
同源雙交換的重組除蟲鏈霉菌突變株。 (d)所述敲除載體中調(diào)控基因的5'端旁側(cè)序列、紅霉素抗性基因3' -5'序列和調(diào) 控基因3'端旁側(cè)序列按上述順序且按上述方向順次連接。 用于構(gòu)建敲除載體的出發(fā)載體為任意一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體，如 pKC1139， pKC505， pIJ653， pIJ8154，優(yōu)選為pKC1139。 以pKC1139為出發(fā)載體構(gòu)建的基因取代載體為pWJb309、pWJb360。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選例中，訴述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。 本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一種調(diào)控蛋白調(diào)控阿維菌素產(chǎn)量的基因和降低阿維 菌素產(chǎn)量的方法，包括以下步驟在除蟲鏈霉菌中敲除調(diào)控蛋白基因，并且所述基因選自 avaR2基因(核苷酸序列表序列3)。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的將目的調(diào)控基因在除蟲鏈霉菌基因組上敲除包 括以下步驟 (e)構(gòu)建含有目標(biāo)基因5'和3'旁側(cè)序列和紅霉素抗性基因的敲除載體。
(f)將含有基因取代載體的宿主菌株作為供體菌株，通過供體菌株_鏈霉菌接合
轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入到除蟲鏈霉菌中，得到含有基因取代載體的除蟲鏈霉菌轉(zhuǎn)化子。
(g)轉(zhuǎn)化子經(jīng)高溫誘導(dǎo)得到單交換突變株，再將單交換突變株傳代后獲得發(fā)生了
同源雙交換的重組除蟲鏈霉菌突變株。 (h)所述敲除載體中調(diào)控基因的5'端旁側(cè)序列、紅霉素抗性基因3' -5'序列和調(diào) 控基因3'端旁側(cè)序列按上述順序且按上述方向順次連接。 用于構(gòu)建敲除載體的出發(fā)載體為任意一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體，如
pKC1139， pKC505， pIJ653， pIJ8154，優(yōu)選為pKC1139。 以pKC1139為出發(fā)載體構(gòu)建的基因取代載體為pWJb374。 本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。 本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)阿維菌素的方法，包括下面步驟 (1):發(fā)酵本發(fā)明上述的敲除目的調(diào)控基因(包括負(fù)調(diào)控基因和正調(diào)控基因)的除
蟲鏈霉菌； (2):從發(fā)酵產(chǎn)物中分離阿維菌素。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的調(diào)控蛋白基因均位于除蟲鏈霉菌基因組中，且 只有一個(gè)拷貝，位于阿維菌素生物合成基因簇序列之外。 在本方明的第五個(gè)方面，提供所述的敲除調(diào)控蛋白基因的除蟲鏈霉菌的用途，其 特征在于用于生產(chǎn)阿維菌素。 本發(fā)明的其它方面由于本發(fā)明的公開內(nèi)容，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易 見的。


圖1 :敲除avaL2基因置換質(zhì)粒pWJb360的構(gòu)建過程。
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圖2 :avaL2基因置換突變菌株的基因型及Southern驗(yàn)證。經(jīng)PvuII酶切后雙交 換的突變株在1. lkb和1. 4kb區(qū)域顯示信號(hào)。 圖3 :avaL2基因置換突變菌株與野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分析對(duì)比。Bla代表阿維 菌素Bla組分。(A)HPLC圖譜；(B)柱狀對(duì)比圖，1代表野生型，2代表avaL2基因置換突變 株。 圖4 :敲除avaRl基因置換質(zhì)粒pWJb309的構(gòu)建過程。 圖5 :avaRl基因置換突變菌株的基因型及Southern驗(yàn)證。經(jīng)Ncol酶切后雙交換 的突變株在3. 8kb區(qū)域顯示信號(hào)。 圖6 :avaRl基因置換突變菌株與野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分析對(duì)比。Bla代表阿維 菌素Bla組分。(A)HPLC圖譜；(B)柱狀對(duì)比圖，1代表野生型，2代表avaRl基因置換突變 株。 圖7 :敲除avaR2基因置換質(zhì)粒pWJb374的構(gòu)建過程。 圖8 :avaR2基因置換突變菌株的基因型及Southern驗(yàn)證。經(jīng)Ncol酶切后雙交換 的突變株在9. 8kb區(qū)域顯示信號(hào)。 圖9 :avaR2基因置換突變菌株與野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分析對(duì)比。Bla代表阿維 菌素Bla組分。(A)HPLC圖譜；(B)柱狀對(duì)比圖，1代表野生型，2代表avaR2基因置換突變 株。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一類可調(diào)控除蟲鏈霉菌抗生素(阿維菌 素)生產(chǎn)的調(diào)控基因(包括正調(diào)控和負(fù)調(diào)控基因)，所述基因?yàn)閍vaL2基因和avaRl基因 (負(fù)調(diào)控基因)，以及avaR2基因(正調(diào)控基因)。將所述的負(fù)調(diào)控基因在除蟲鏈霉菌基因 組中進(jìn)行敲除，可大大提高阿維菌素的產(chǎn)量，而將所述正調(diào)控基因進(jìn)行敲除，可大大降低阿 維菌素的產(chǎn)量。基于以上完成了本發(fā)明。在所述的調(diào)控基因中，三個(gè)基因均來自除蟲鏈霉 菌(Str印tomyces avermitilis，簡稱S. avermitilis)本身的基因組中。如本發(fā)明所用到 的三個(gè)基因均編碼可能的屬于TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，均是可能的Y-丁酸內(nèi)酯依賴的 調(diào)控蛋白，因此也稱為調(diào)控蛋白基因。(Eriko Takano， g-Butyrolactones :Str印tomyces signallingmolecules regulating antibiotic production and differentiation. Current Opinion inMicrobiology 2006，9 :287_294) 在本發(fā)明中，所用的"調(diào)控基因"是指用于調(diào)節(jié)控制特定結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基 因。正調(diào)控指可以提高或者維持結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因，負(fù)調(diào)控則是可以降低結(jié)構(gòu)基因 表達(dá)的基因。在本發(fā)明中，從除蟲鏈霉菌基因組中獲得的所述avaL2基因(GenBank登 錄號(hào)為BAC69979. 1 ;從除蟲鏈霉菌基因組中獲得的所述avaRl基因(GenBank登錄號(hào)為 BAC71417. 1);從除蟲鏈霉菌中得到的avaR2基因(GenBank登錄號(hào)為BAC71414. l)，這些基 因均由外源導(dǎo)入敲除載體后被紅霉素抗性基因所替代，形成除蟲鏈霉菌突變株。
在本發(fā)明中，"除蟲鏈霉菌"(Str印tomyces avermitilis)是一種能夠產(chǎn)生阿維菌 素(avermectins AVM)的菌。 在本發(fā)明中，大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體是指一類能由大腸桿菌轉(zhuǎn)到鏈霉菌中的 質(zhì)粒，包括(但是不限于)pKC1139。
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在本發(fā)明中，"基因轉(zhuǎn)移"是指將外源的遺傳物質(zhì)由供體菌導(dǎo)入到受體菌內(nèi)的過 程，其可以通過轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合等手段來實(shí)現(xiàn)。"接合轉(zhuǎn)移"是指細(xì)菌通過性 菌毛相互連接溝通，將遺傳物質(zhì)(主要是質(zhì)粒DNA)從供體菌轉(zhuǎn)移給受體菌。
本發(fā)明敲除的負(fù)調(diào)控基因avaL2 (核苷酸序列表序列1)，具有以下的核苷酸序列 在本發(fā)明所述的avaRl (核苷酸序列表序列2)，具有以下的核苷酸序列
CGGACGTTGGAGTGA 本發(fā)明所述的avaR2 (核苷酸序列表序列3)，具有以下的核苷酸序列
GCGGAGACGCGGACCCCGGCGACCACCGCCGGATGA 如本發(fā)明所用，敲除上述基因包括對(duì)上述基因進(jìn)行替換、關(guān)鍵殘基點(diǎn)突、同框敲除 等對(duì)目標(biāo)基因失活的手段。 本發(fā)明提供的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，系由載體和在多克隆位點(diǎn)上加入敲除的目的基因旁側(cè)序列和紅霉素抗性基因序列組成，載體為大腸桿菌和鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，可以為 pKC1139、p0J260、pWHM3等及其類似的載體。
進(jìn)一步的描述如下 本發(fā)明的負(fù)調(diào)控基因能夠負(fù)向調(diào)控阿維菌素的生物合成，當(dāng)將該類基因敲除后， 可以提高阿維菌素的產(chǎn)量。并且本發(fā)明人選擇了合適的接合轉(zhuǎn)移載體，即帶有溫敏型復(fù)制 子的質(zhì)粒pKC1139，利用同源重組技術(shù)，得到了穩(wěn)定的基因突變株。 在檢測阿維菌素產(chǎn)量時(shí)，可通過測量出發(fā)菌株和改良菌株產(chǎn)生的有效組分 Bla (avermectin Bla，中文全名2， 6_雙脫氧-4-0- (2， 6_雙脫氧3-0-甲基-a-L-阿拉伯糖 基_吡喃己基)-3-0-甲基-a-L-阿拉伯糖基-吡喃己基[氧化]-3' ， 4' ， 6， 6'7， 10， 14， 15， 17&，20，20&，2013-十四氫-20，2013-雙羥-5'，6，8，19-四甲基-6' -(l-甲丙基)螺旋[11， 15-甲撐-2H，13H，17H-呋喃]4，3，2-pq，2，6，[苯丙雙氧環(huán)八癸炔]_吡喃-17-酮)的含 量為標(biāo)準(zhǔn)，檢測阿維菌素的產(chǎn)量是否提高。 本發(fā)明中所用于實(shí)施例或其他內(nèi)容所顯示的成分用量、反應(yīng)條件等數(shù)字均為大約 數(shù)值。因此除非文中特別注明，本說明書的上述數(shù)字參數(shù)均為近似值，其可根據(jù)所需得到的 本發(fā)明的結(jié)果而加以變化。 除特別說明外。文中所用到的專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。 此外，任何與所記載內(nèi)容相似或者均等的方法及材料均可應(yīng)用于本發(fā)明的方法之中。實(shí) 驗(yàn)中未注明的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述條件或者按照制造廠商所建 議的條件。 本發(fā)明的主要特點(diǎn)在于 (1)發(fā)現(xiàn)了一類與除蟲鏈霉菌的阿維菌素產(chǎn)量密切相關(guān)的幾個(gè)調(diào)控基因。
(2)發(fā)明敲除其中的負(fù)調(diào)控基因avaL2基因和avaRl基因可以大大提高除蟲鏈霉 菌的阿維菌素的產(chǎn)量，敲除其中的證調(diào)控基因avaR2可以大大降低除蟲鏈霉菌的阿維菌素 的產(chǎn)量。 (3)本發(fā)明采用接合轉(zhuǎn)移的手段將中斷質(zhì)粒導(dǎo)入到受體菌中，誘導(dǎo)發(fā)生雙交換，得 到了穩(wěn)定的基因型突變株。 下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，所用實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例中所用培養(yǎng)基，除特殊說明外，液體均用YEME培養(yǎng)基，固體均用MS培養(yǎng)基。
實(shí)施例一 敲除avaL2基因?qū)Π⒕S菌素(avermectin)產(chǎn)量的影響
1 :左右交換同源臂的獲得 以S. avermitilis的基因組為模板，采用引物5'-ATT AAG CTT CGA CCGGAT CAT CGC GGT GAA C-3'和引物TTA CTC GAG GGC GGG GAC CGA AGC ATA AAAG克隆得到左臂約 2kb的PCR產(chǎn)物，利用酶切位點(diǎn)連入pGEM-7zf中，再用引物5' -AAT TCT AGA GGC CGG CCA CGG CCC GGT GAG—3'禾卩引凈勿5' _AAT GAT ATCACG GTC ACC CGC TCC CGC CTG—3' f尋至U右臂 約2kb的PCR產(chǎn)物，利用酶切位點(diǎn)連入pSP72中。
2 :抗性基因片段的獲得 紅霉素抗性基因是通過利用酶切位點(diǎn)Xhol和Xbal從質(zhì)粒pAGE_l中酶切所得，長約1. 8kb。 3 :重組質(zhì)粒pWJb360的獲得 將左臂從載體中用核酸內(nèi)切酶Hindi 11和Xhol切出來，將右臂用核酸內(nèi)切酶Xbal 和EcoRV切出來，與獲得的抗性片段一起連入用HindIII和EcoRV切好的pKC1139中，具體 構(gòu)建可見附圖1。 4 :敲除avaL2基因突變株的獲得和生物效價(jià)的評(píng)定將用于基因置換的重組質(zhì)粒pWJb360轉(zhuǎn)入到大腸桿菌ET12567中，通過大腸桿菌
和鏈霉菌之間的屬間接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到鏈霉菌中，37t:整合后松弛誘導(dǎo)發(fā)生雙交
換，篩選獲得紅霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的雙交換突變株。該突變菌株的基因型利用標(biāo) 記的紅霉素抗性基因的探針進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證，基因型驗(yàn)證結(jié)果見圖2。得到突變株。
在相同發(fā)酵條件下對(duì)比出發(fā)菌株和突變后的菌株產(chǎn)阿維菌素Bla的量分析。
將保存好的孢子解凍后，涂于平板培養(yǎng)基上，平板培養(yǎng)基配方為葡萄糖(國藥集 團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)1. 5%、天門冬酰氨(華美生物工程公司)0. 05%、進(jìn)口牛肉浸膏(中 國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司)0.3%、磷酸二氫鉀(天津市化學(xué)試劑六廠)O. 05%、瓊 脂1.8%。 3(TC培養(yǎng)五天后，用打孔器取一小塊放到種瓶內(nèi)。 種子培養(yǎng)基配方為玉米淀粉3%、豆粕粉0.8%、花生餅粉1%、酵母浸提物 0.4%、氯化鈷(中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，l^的溶液)0.3^、淀粉酶4ii/g淀粉。 配制時(shí)先將玉米淀粉糊化(玉米淀粉用少量水溶解，加入淀粉酶，攪拌均勻，倒入 約1/2總量的沸水中，煮沸)，加入其他原料(也用冷水調(diào)勻)，定容后調(diào)pH值6. 8 7，分 裝40ml/250ml三角瓶，121。C滅菌25min。 28°C ， 200rpm培養(yǎng)兩天后，吸取1. 5ml到搖瓶中。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米淀粉14%、豆粕粉2.8%、酵母粉1 %、鉬酸鈉 (1% )2. 2%。、硫酸錳(0. 1% )2. 3%。、硫酸銨(5% )5%。、氯化鈷(1% )2%。。
配制時(shí)先將玉米淀粉用冷水溶解調(diào)勻，加入淀粉酶(1. 5 2單位沒克淀粉)，水浴 加熱，變稀后計(jì)時(shí)保溫12min(在升溫過程中，料液會(huì)由乳白色變?yōu)榘胪该鳚{糊狀，此時(shí)開 始計(jì)時(shí))，取出，加入其它原料(先用冷水調(diào)勻)，定容，調(diào)pH，起始pH值約6. 3，調(diào)至7. 5，然 后加入碳酸鈣0. 8%。，攪拌均勻，邊攪拌邊分裝30ml/250ml三角瓶，12rC滅菌25min。
搖瓶在28°C，200rpm的條件下培養(yǎng)十天，取lml菌液，加4ml甲醇，超聲10min，離 心取上清，HPLC檢測。 檢測條件為檢測波長UV = 245咖；柱子VARIAN 250/4. 6 SN 282566MICR0S0RB-MV 100-5 C18 R008620005 ;流動(dòng)相條件v = lmL/min ;A溶液=H20 ;B溶液=CH30H ;洗脫條件為 85% B， 15% A，洗脫時(shí)間為20min。 分析HPLC結(jié)果可以看出，原始出發(fā)菌株阿維菌素的產(chǎn)量約為1321yg/ml，突變株 的產(chǎn)量為1550iig/ml，增產(chǎn)為17%。具體的HPLC圖譜以及產(chǎn)量對(duì)比柱形圖見附圖3。
實(shí)施例2 :敲除avaRl對(duì)阿維菌素(avermectins) Bla產(chǎn)量的影響
1 :左右交換同源臂的獲得 以S. avermitilis的基因組為模板，采用引物5 '-ATT AAG CTT ACC CCTTGG CGA CCG CCG TC-3'和引物5' -TTA TCT AGA CTC GAG TCG CTC CTG CCGCGC CAC AC-3'克隆得 到左臂約2kb的PCR產(chǎn)物，利用酶切位點(diǎn)連入pGEM-3zf中，再用引物5'-AAT TCT AGA GGCACG GAC GTT GGA GTG AC—3'和引物5' -TTA GAA TTC GTG CGG ATC GCG CGT TCC TG_3， 得到右臂約2kb的PCR產(chǎn)物，利用酶切位點(diǎn)連入pGEM-3zf中。
2:抗性基因片段的獲得 紅霉素抗性基因是通過利用酶切位點(diǎn)Xhol和Xbal從質(zhì)粒pAGE-1中酶切所得，長 約1. 8kb。 3 :重組質(zhì)粒pWJb309的獲得 將左臂從載體中用核酸內(nèi)切酶HindIII和XhoI切出，將右臂用核酸內(nèi)切酶XbaI 和EcoRI切出，與獲得的抗性片段一起連入用Hindi 11和EcoRI切好的pKC1139中，具體構(gòu) 建可見附圖4。 4 :敲除ava Rl基因突變株的獲得和生物效價(jià)的評(píng)定將用于中斷的重組質(zhì)粒pWJb309轉(zhuǎn)入到大腸桿菌ET12567中，通過大腸桿菌和鏈 霉菌之間的屬間接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到鏈霉菌中，37t:整合后松弛誘導(dǎo)發(fā)生雙交換， 篩選獲得紅霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的雙交換突變株。該突變菌株的基因型利用標(biāo)記的 紅霉素抗性基因的探針進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證，基因型驗(yàn)證結(jié)果見圖5。得到突變株。
發(fā)酵條件及HPLC檢測方法同實(shí)施例1。 分析HPLC結(jié)果可以看出，原始出發(fā)菌株阿維菌素的產(chǎn)量約為1321yg/ml，突變株 的產(chǎn)量為1756ii g/ml，增產(chǎn)為33%。具體的HPLC圖譜記柱形圖對(duì)比可見附圖6。
實(shí)施例3 :敲除avaR2對(duì)阿維菌素(avermectins)產(chǎn)量的影響
1 :左右交換同源臂的獲得 以S. avermitilis的基因組為模板，采用引物5 '-GAA AAG CTT GAC GCCCCC TTC ATA G-3'和引物5'-CAC CTC GAG CTT GCT CTC GAA GTG-3'克隆得到左臂約2kb的PCR產(chǎn) 物，利用酶切位點(diǎn)連入pGEM-7zf中，再用引物5'-AATTCT AGA GCC GTA CGG CAG CCG CTC-3' 和引物5'-TAA GAA TTC TGC CCC TACGCC CTG GAC-3'得到右臂約2kb的PCR產(chǎn)物，利用酶 切位點(diǎn)連入pGEM-3zf中。
2:抗性基因片段的獲得 紅霉素抗性基因是通過利用酶切位點(diǎn)Xhol和Xbal從質(zhì)粒pAGE-1中酶切所得，長 約1. 8kb。 3 :重組質(zhì)粒pWJb374的獲得 將左臂從載體中用核酸內(nèi)切酶HindIII和XhoI切出，將右臂用核酸內(nèi)切酶Xbal 和EcoRI切出，與獲得的抗性片段一起連入用Hindi 11和EcoRI切好的pKC1139中，具體構(gòu) 建可見附圖7。 4 :敲除avaR2基因突變株的獲得和生物效價(jià)的評(píng)定 將用于中斷的重組質(zhì)粒pWJb374轉(zhuǎn)入到大腸桿菌ET12567中，通過大腸桿菌和鏈
霉菌之間的屬間接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到鏈霉菌中，37t:整合后松弛誘導(dǎo)發(fā)生雙交換，
篩選獲得紅霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的雙交換突變株。該突變菌株的基因型利用標(biāo)記的 紅霉素抗性基因的探針進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證，基因型驗(yàn)證結(jié)果見圖8。得到突變株。
發(fā)酵條件及HPLC檢測方法同實(shí)施例1 。 分析HPLC結(jié)果可以看出，原始出發(fā)菌株阿維菌素的產(chǎn)量約為1321yg/ml，突變株 的產(chǎn)量為27ii g/ml，產(chǎn)量降低明顯。具體的HPLC圖譜及柱形圖對(duì)比見附圖9。
核苷酸序列表 〈110〉中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所 〈120〉利用調(diào)控蛋白基因提高阿維菌素的產(chǎn)量 〈130〉說明書，權(quán)利要求書 〈160>3 〈170>PatentIn version 3.5 〈210>1 〈211>621 〈212>DNA 〈213>Streptomyces avermitilis 〈400〉 1gtggElgCCggc腿gg郷ggagcgtcatgccc朋gcaggcacgcgccctgcgtecctec60gaccgtgtactcgacgcggccgcctecgagttcgcccgatacggctecacg朋cgcg朋c120ctgcag朋catcgcggaccgcatcaggctgElCg朋gggElgcgctctecgggcatttcgcc180朋c朋ggaggaactggccgccgcgctggaccaccacctgtccgccacgctgggggtectg240ctcaccgaggcccggacatcgccccatccggcactgggccggctgcagtccctcgtcctc300ggtctgggccggctcttccggacggatctgcgggccctcgcggcgctgcggctcgcggcg360gagacggcccgttcgaccgcc朋gccgatecctctgctgacggagacgcacgacctcgtc420ctccagttggtgcgcgagac3C3gC3gg3ggggC3Ctgggacgcgtcgatctccaccagg■cctctggcggacctcatcgtggcggccctcttcggcacgttctggacggagaccgacacc540ggccacccagggtccgacgggaccgtcgacacgatgtgggaggccctggctcaggcgctc600ggcggcgccccggcccgctg621〈210>2〈211>705〈212>DNA〈213>Streptomyces avermitilis〈400>2gtggcgcggc3gg￡lgCg￡lgCcattcggacgcggcagacgattctggtcgccgcggccgag60gtgttcgacg3ggtggg3tecgaggcggcaaccatctccgacgtgctg朋gcgctcgggg120gtcacc朋gggggccctctecttccacttcacgtcg朋gcaggagctggcccaggccgtg180ctggccgagcaggtcgcctcccttccgcgcgtccccgagcaggagctg朋gctccagcag240tcgctggacgaggcgctgctgctcgcccatctgctcagggaaggcaccggcgatccgatc300gtccagggcagtgtgcggctgaccgtggaccagggctcgcCC3ggg3CC3tctcaaccgg360cgggtcccgatgcaggcctggaccgagcacacgcagtccctcttcgaagaggccagggcc420朋gggcg卿tcctgccccacgccgatgtggaagcgctcgccaagctgttcgtgggcgcg■ttcaccggcgtgcaggtcctctcgaggatcatgaccgggcgcgcggacctggcgg3gcgg540gtggccgacctcteccgccatctgatgccgtccttcgccatgccggggatcctggtccgc600ctggacttctccccggagcggggctcgcgggtgtecg朋gccgccatgaagC3gCggg3g660tcggcggcagcgagtecgacggacgcggcacggacgttgg3gtg3705
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〈210>3 〈211>657 〈212>DNA 〈213>Streptomyces avermitilis 〈400>3gtg3Cg朋3Caggaacgcgccgcccgcacccgccacgccctcatccgctccgccgcccac60gccttcgaacggcagggcteC3C3C3ggCgaggctggccgacatcagcgcctgcgccggt120gtcagccccggcgcactgcacttccacttcg卿gc朋ggc卿ggtggcc郷gcggtg180g郷cggcggCgggggtgElgcctgcgccgggcggcctggctggcccagccgccgggcacg240aacgcgctgc朋cggctgacg朋cacgtcgcacgccctggccgagcgactgCgCgggg3C300gtcgtcgcccgcgcgggcttccggctgaactgcg朋tcggcgggcggcggcgcgctgaat360ctgctccggg朋tggC3g3CctgcgtggagcagctgctcgcggaggccgcCg3gg3gggg420ctgctggcccggcgcctcgtccgcgccgacacggtcagcgcggtggtggccgcgaccacc■ggtttcgaactgctcggccgccgggaccccgagtggctctccggccagtcgctggccgcg540ttctggcgggtectgctgccgcgcgcggcc3CggCggCggccctgaccgcggtggacccg600gacgggacgtgccccagccgggcgg卿cgcggaccccggcgaccaccgcCgg3tg3657
1權(quán)利要求
一類除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitili)中A因子調(diào)控蛋白基因的用途，其特征在于對(duì)所述的基因的失活顯著改變除蟲鏈霉菌生產(chǎn)阿維菌素的能力；所述調(diào)控蛋白基因包括avaL2基因、avaR1基因或avaR2基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于將上市的avaL2基因或avaRl基因置換或中 斷失活。
3. 如權(quán)利要求1和2所述的avaL2基因具有如下核苷酸序列GTGGAGCCGGCAAAGGAGGG
4.如權(quán)利要求1和2所述的avaRl基因具有如下核苷酸序列GTGGCGCGGCAGGAGCGAGC
5.如權(quán)利要求1所述的avaR2基因具有如下核苷酸序列GTGACGAAACAGGAACGCGCCGCCCGACCACCGCCGGATGA。
6.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的avaL2基因或avaRl基因置換或中斷 失活包括如下步驟(1) :以Str印tomyces avermitilis的基因組為模板，采用PCR方法獲得avaL2或 avaRl基因置換所須的左臂序列，包括上游序列及部分相應(yīng)基因序列約2kb ;(2) :以Str印tomyces avermitilis的基因組為模板，采用PCR方法獲得avaL2或avaRl基因置換所須的右臂序列，包括下游序列及部分相應(yīng)基因序列約2kb ;(3) :將得到的左右臂序列和包含或不包含抗性基因片段通過相應(yīng)的酶切位點(diǎn)克隆入 pKC1139載體中構(gòu)建成基因置換重組質(zhì)粒；(4) :將(3)獲得的重組質(zhì)粒以接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入Str印tomyces avermitilis中，經(jīng) 整合、松弛培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)生雙交換及篩選鑒定后完成目標(biāo)基因失活。
7.如權(quán)利要求1，2，6所述的用途，其特征在于提高產(chǎn)生阿維菌素的能力。
全文摘要
本發(fā)明公開了除蟲鏈霉菌中一類調(diào)控蛋白基因的用途，對(duì)該類基因的失活可以顯著改變除蟲鏈霉菌生產(chǎn)阿維菌素的能力。所述調(diào)控蛋白基因包括avaL2基因、avaR1基因或avaR2基因，前二者的基因置換突變菌種可明顯提高阿維菌素的產(chǎn)生能力，而后者的基因置換突變菌種可顯著降低阿維菌素的產(chǎn)生能力。本發(fā)明還公開了利用這些基因構(gòu)建產(chǎn)量提高的除蟲鏈霉菌突變菌種的方法和應(yīng)用，相應(yīng)突變菌種發(fā)酵獲得的阿維菌素產(chǎn)量與未經(jīng)改造的菌株相比有大幅提高。
文檔編號(hào)C12P19/62GK101724646SQ20091019674
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者唐功利, 王健博 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所