專利名稱：：過量表達(dá)mtp基因的植物內(nèi)的產(chǎn)量增加的制作方法過量表達(dá)MTP基因的植物內(nèi)的產(chǎn)量增加交叉參考相關(guān)申請本申請要求2005年7月19日提交的美國臨時申請系列號60/700,562的優(yōu)先權(quán)，該文獻(xiàn)的完整內(nèi)容在本文中引用作為參考。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體涉及編碼與根發(fā)育有關(guān)的多肽的核酸序列，其中所述的核酸序列助于植物生長并且最終影響在非生物性脅迫條件或非脅迫條件下的植物生產(chǎn)(即產(chǎn)量)。尤其，本發(fā)明涉及編碼多肽的分離的核酸序列，其中所述多肽賦予植物增加的根生長、增加的產(chǎn)量和/或增加的耐干旱性、耐寒性和/或耐鹽性，并涉及此類分離的核酸的用途。技術(shù)背景作物植物的產(chǎn)量對人類福利是重要的并且受物理環(huán)境下植物的生長直接影響。非生物性環(huán)境脅迫如干旱脅迫、鹽度脅迫、熱脅迫和冷脅迫是植物生長及生產(chǎn)力的主要限制性因素。由這些脅迫所引起的主要作物如大豆、稻、玉米(corn)和小麥(wheat)的作物損失和作物產(chǎn)量損失代表重要的經(jīng)濟(jì)因素和政治因素，并且是許多欠發(fā)達(dá)國家中食品短缺的原因。植物生物量對飼料作物如苜蓿(alfalfa)、青貯玉米(silagecorn)和干草而言是全部產(chǎn)量。眾多對于產(chǎn)量的代表物已經(jīng)用于谷物作物內(nèi)。這些代表物中的主要代表是對植物尺度的評估。根據(jù)物種和發(fā)育期，植物尺度可以以多種方式進(jìn)行測量，但是包括植物總干重、地上部分干重、地上部分鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、葉叢直徑、葉長度、根長度、根質(zhì)量、分蘗數(shù)和葉數(shù)目。眾多物種在給定發(fā)育期內(nèi)維持植物不同部分之間的恒定比率。使用這些異速生長關(guān)系來從尺度的這些量值中的一種量值外推到另一種量值。發(fā)育早期內(nèi)的植物尺度一般與發(fā)育晚期中的植物尺度相關(guān)。具有較廣的葉面積的較大植物一般可以比較小的植物吸收更多光線和二氧化碳，并且因此將有可能在相同時間內(nèi)獲得更大的重量。除了微環(huán)境優(yōu)勢或遺傳優(yōu)勢的有效延續(xù)以外，這是植物最初不得不實現(xiàn)較大尺度的原因所在。對于植物尺度和生長速率而言，存在強(qiáng)烈的遺傳因素，并且對一系列多樣的基因型而言，情況也是如此。在一種環(huán)境條件下的植物尺度有可能與另一種環(huán)境條件下的尺度相關(guān)。以這種方式，將標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境用作為對田間作物在不同位置和不同時間上遭遇到的多樣及動態(tài)性環(huán)境的代表。收獲指數(shù)(種子產(chǎn)量與地上部分干重的比率)在眾多環(huán)境條件下是相對穩(wěn)定的，并且因此可以經(jīng)常得到植物尺度與谷物產(chǎn)量之間的密切聯(lián)系。這些過程本身是關(guān)聯(lián)的，因為主要的谷物生物量取決于植物的葉和莖擁有的現(xiàn)有或儲備的光合作用生產(chǎn)力。因此，對植物尺度的選擇(甚至在發(fā)育早期)已經(jīng)用來作為未來生產(chǎn)潛力的指示物。當(dāng)測試遺傳差異對脅迫耐受性的影響時，與田野相比，將土壤特性、溫度、水及營養(yǎng)素的可獲性和光密度標(biāo)準(zhǔn)化的能力是溫室環(huán)境或植物生長室環(huán)境的固有優(yōu)勢。然而，因缺少風(fēng)或昆蟲引起的不良授粉或成熟根或冠的生長空間不充足而導(dǎo)致對產(chǎn)量的人為限制可能制約這些受控環(huán)境測試產(chǎn)量差異的用途。因此，在生長室或溫室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)化條件下，測量發(fā)育早期內(nèi)的植物尺度是提供潛在的遺傳性產(chǎn)量優(yōu)勢指示的標(biāo)準(zhǔn)慣例。在生活周期中，植物通常暴露于環(huán)境含水量降低的環(huán)境。大多數(shù)植物已經(jīng)進(jìn)化出對這些脫水條件的自我保護(hù)策略。然而，當(dāng)千旱條件過于嚴(yán)重并且持續(xù)時間過長，則對多數(shù)作物植物的發(fā)育、生長、植物尺度和產(chǎn)量的影響是嚴(yán)重的。持續(xù)暴露于干旱引起在植物代謝方面最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡并且因此導(dǎo)致產(chǎn)量損失的重大改變。開發(fā)脅迫耐受性植物因此是有可能解決或至少促進(jìn)解決這些問題中某些問題的策略。然而，開發(fā)對這類脅迫表現(xiàn)抗性和/或耐受性的植物新品系的常規(guī)植物育種策略*相對緩慢并且需要特定抗性品系以便與所需要的品系雜交。有限的脅迫耐受性種質(zhì)資源和親緣較遠(yuǎn)的植物物種間雜交的不兼容性是常規(guī)育種中遭遇的嚴(yán)重問題。此外，在耐干旱、耐寒和耐鹽的模式植物內(nèi)引起耐干旱性、耐寒性和耐鹽性的細(xì)胞過程在本質(zhì)上是復(fù)雜的，并涉及細(xì)胞多種適應(yīng)機(jī)制及眾多代謝途徑。脅迫耐受性的這種多因素性質(zhì)不僅造成對耐受性的育種基本上不成功，而且還限制利用生物技術(shù)方法從遺傳上設(shè)計脅迫耐受性植物的能力。因此，需要鑒定引起生長增加和/或脅迫耐受性增加的這些多因子過程中所涉及的基因和蛋白質(zhì)。闡明在脅迫耐受性植物內(nèi)表達(dá)的基因的功能不僅推動我們理解植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)及耐受，還提供用于設(shè)計作物改良新策略的重要信息。根是高等植物的重要器官。植物根系統(tǒng)對所有陸生植物物種的正常生長和發(fā)育是重要的。除攝取水及營養(yǎng)素并且提供物理支持之外，根介導(dǎo)土壤孩史生物與其它植物之間復(fù)雜且知之甚少的通訊交流。在農(nóng)學(xué)系統(tǒng)中，生產(chǎn)受土壤內(nèi)水及營養(yǎng)素的可獲得性的影響根生長對地上器官的生長和產(chǎn)量具有直接或間接影響，尤其在營養(yǎng)限制條件下。根還與植物次級產(chǎn)物如防御化合物和植物激素的產(chǎn)生有關(guān)。建立正確的根構(gòu)型對植物有效利用環(huán)境中的可用水及營養(yǎng)素以使植物生長及生產(chǎn)最大化而言有重要影響。此外，在干旱條件下，根可以適應(yīng)于繼續(xù)生長而與此同時產(chǎn)生并向莖干發(fā)送抑制地上部分植物生長的早期警告信號。此外，作物植物改良的根生長還增強(qiáng)與雜草植物的竟?fàn)幜Σ⑼ㄟ^增加水的獲得性和攝取而改善在貧瘠地帶內(nèi)的生長。改良的根生長還與生態(tài)目的有關(guān)，如生物修復(fù)和預(yù)防/制止土壤侵蝕。較長的根不但可以減輕來自土壤的7jc耗竭效應(yīng)，還可以改善植物的固定和支持能力，因而減少倒伏。另夕卜，較長的根具有覆蓋較大體積的土壤的能力并改善營養(yǎng)素攝取。因此,改變根的生物量并且尤其增加根長度將改善植物生長以及增加作物產(chǎn)量。根還是眾多重要的主要作物例如甜菜(sugarbeet)、馬鈴薯(potato)、樹薯(manioc)(木薯(cassava))、山藥(yam)和甜薯(sweetpotate，batate)中的貯藏器官。根還是眾多蔬菜(胡蘿卜(carrot)、蘿卜(radish))、草藥(姜(ginger)、番紅花(kukuma))和藥用植物(人參(ginseng))中用于消費的相關(guān)器官。此外，存在于根內(nèi)的某些植物次級產(chǎn)物對化學(xué)工業(yè)和制藥工業(yè)有重要經(jīng)濟(jì)意義，例如用于合成類固醇激素的基礎(chǔ)分子存在于山藥內(nèi)，并且紫草(丄/幼05/7e/7MW附的根產(chǎn)生因其具有抗炎特性、抗腫瘤特性和傷口愈合特性而得以廣泛應(yīng)用的紫草素。根構(gòu)型是經(jīng)典育種學(xué)中基本上仍未研究的領(lǐng)域，原因是在田間難以評估這種性狀。因此，生物技術(shù)可以明顯影響對這種性狀的改良。根系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)因先天遺傳和物理環(huán)境綜合作用而產(chǎn)生。數(shù)個根突變體已經(jīng)從模式植物鼠耳芥(」m^/o/w/5幼"/,Vwi")和對根生長及發(fā)育已積累了某些認(rèn)識的數(shù)個作物物種中得以分離。在篩選具有對重力的變異應(yīng)答的植物中鑒定了擬南芥(^n^iVto/w/力的flgW突變體。該突變體對植物生長激素乙烯和內(nèi)源性生長素不敏感，表明AtAGRl參與生長素轉(zhuǎn)運(Bell和Maher，1990，Mol.Gen.Genet.220:289-293)。五ZW、w<iv6和/;Z"2是對agr/等位的突變。在通過定位性克隆分離AtAGRl后，確定AtAGRl僅表達(dá)于根內(nèi)并且是與細(xì)菌膜轉(zhuǎn)運蛋白相似的植物基因家族的一個成員(Luschnig，1998，Genes&Deveplopment12:2175-2187)。還確定AtAGRl編碼生長素向基性外流載體(Chen等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:15112-15117)。此外，原位(Z"-W")雜交證實AtAGRl表達(dá)于根尖的遠(yuǎn)端伸長區(qū)和中央伸長區(qū)內(nèi)(Muller等，1998，TheEMBOJournal17:6903-6911)。雖然已經(jīng)表征了參與植物內(nèi)脅迫應(yīng)答的一些基因，但是對賦予脅迫耐受性的植物基因的表征和克隆大多仍是不完整和零散的。例如，某些研究已經(jīng)表明干旱脅迫和鹽脅迫在一些植物內(nèi)可以歸咎于基因疊加效應(yīng)，相反，其它研究表明特定基因在滲透脅迫條件下在植物營養(yǎng)組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄性地受到激活。雖然通常假定脅迫誘導(dǎo)性蛋白質(zhì)在耐受性中有作用，然而直接證據(jù)依然缺乏，并且眾多脅迫應(yīng)答性基因的功能是未知的。因此，需要鑒定在脅迫耐受性植物內(nèi)表達(dá)的額外基因，其中所述的基因具有賦予其宿主植物及其它植物物種增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或脅迫耐受性的能力。新產(chǎn)生的脅迫耐受性植物將具有眾多優(yōu)勢，例如通過降低植物物種的水需要而增加可以栽培作物植物的范圍。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及編碼多肽的分離的核酸，其中與植物的野生型品種相比，所述的多肽能夠調(diào)節(jié)在正常條件或脅迫條件下的#>生長和/或植物生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性。尤其，本發(fā)明涉及分離的核酸的用途，其中所述的核酸編碼對調(diào)節(jié)植物的根生長、產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫應(yīng)答重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白樣多肽(MTP)。更具體地，這些編碼MTP的核酸在作物植物內(nèi)的過量表達(dá)引起增加的根生長和/或正常條件或脅迫條件下增加的產(chǎn)量，和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性。因此，在第一實施方案內(nèi)，本發(fā)明涉及用分離的核酸所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中核酸包含選自如下的多核苷酸a)多核苷酸，其具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述的序列；b)多核苷酸，其編碼具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多肽；c)多核苷酸，其與具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性；d)編碼多肽的多核苷酸，其中所述的多肽與具有如在表l第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多肽具有至少70%序列同一性；和e)與以上a)至d)的任意多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因作物植物表達(dá)此類分離的核酸，以至于相對于非轉(zhuǎn)化的野生型植物，優(yōu)選改變植物的表型。尤其與植物的野生型品種相比，轉(zhuǎn)基因作物植物將表現(xiàn)在正常條件或脅迫條件下受到調(diào)節(jié)的根生長(優(yōu)選增加的根生長)和/或植物生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性。優(yōu)選地，MTP來自鼠耳芥、卡i若4立油菜(canola)、大豆(soybean)、稻(rice)、向曰葵(sunflower)、大麥(barley)、小麥(wheat)、亞麻(linseed)或玉米(maize)。也就是說，本文中所述的是鼠耳芥AtAGRl基因(AtAGRl、AtAGRl-2、AtAGRl-3、AtAGRl-4和AtAGRl-5)及其在卡諾拉油菜、大豆、稻、向日葵、大麥、小麥、亞麻和玉米內(nèi)的同系物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及這樣的轉(zhuǎn)基因作物植物，其過量表達(dá)編碼MTP的核酸并與植物的野生型品種相比，在正常條件或脅迫條件下表現(xiàn)根生長的增加并更優(yōu)選地表現(xiàn)根長度的增加。在又一個實施方案中，與植物的野生型品種相比，編碼MTP的核酸在作物植物內(nèi)的過量表M現(xiàn)增加的環(huán)境脅迫耐受性。在又一個實施方案中，與植物的野生型品種相比，編碼MTP的核酸在作物植物內(nèi)的過量表達(dá)表現(xiàn)增加的產(chǎn)量。還提供環(huán)境脅迫可以是鹽度脅迫、干旱脅迫、溫度脅迫、金屬脅迫、化學(xué)品脅迫、病原體和氧化脅迫或其組合。優(yōu)選地，環(huán)境脅迫是干旱脅迫。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及由編碼MTP的核酸所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因作物植物產(chǎn)生的種子，其中與植物的野生型品種相比，植物對增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性是不分離的。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及在農(nóng)業(yè)地點內(nèi)培育作物植物的方法，其中該方法包括得到前述轉(zhuǎn)基因作物植物并在農(nóng)業(yè)地點內(nèi)培育該植物。仍在又一個方面，本發(fā)明涉及通過或從轉(zhuǎn)基因作物植物、其植物部分或其種子中產(chǎn)生的產(chǎn)物，如食物、祠料、食物補(bǔ)充物、伺料補(bǔ)充物、化妝品或藥物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及在正常條件或脅迫條件下，與植物的野生型品種相比，增加作物植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或增加對環(huán)境脅迫的脅迫耐受性的方法，其中該方法包括得到前述轉(zhuǎn)基因作物植物并且在表達(dá)分離的核酸的條件下培育該植物。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生前述轉(zhuǎn)基因作物植物的方法，其中該方法包括(a)用包含編碼MTP的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和(b)從植物細(xì)胞生成表達(dá)所編碼多肽的轉(zhuǎn)基因作物植物。優(yōu)選地，多核苷酸與一種或多種調(diào)節(jié)序列有效連接，并且與植物的野生型品種相比，該多核苷酸在植物內(nèi)的表達(dá)引起在正常條件或脅迫條件下增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性。優(yōu)選地，一種或多種調(diào)節(jié)序列包括啟動子。更優(yōu)選地，該啟動子是組織特異性或發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動子。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及鑒定新MTP的方法，包括(a)產(chǎn)生如下文所述的應(yīng)答于MTP的特異性抗體或其片段；(b)用抗體篩選推定的MTP物質(zhì)，其中抗體對物質(zhì)的特異性結(jié)合表明存在潛在的新MTP;和(c)與已知的MTP比較，從已結(jié)合的物質(zhì)內(nèi)鑒定新MTP。或者，與如下文所述核酸探針的雜交可以用來鑒定新MTP核酸。在又一個實施方案中，本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性的方法，包括調(diào)節(jié)編碼MTP的核酸在植物內(nèi)的表達(dá)。優(yōu)選地，與植物的野生型品種相比，此類修飾引起增加或減少的才艮生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性。優(yōu)選地，根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性因增加編碼MTP的核酸在植物內(nèi)的表達(dá)而得到增加。附圖簡述圖1顯示長度是1941bp的用于擬南芥轉(zhuǎn)化的AtAGRl基因(SEQIDNO:l;At4g37580)的核苷酸序列。圖2顯示用于擬南芥轉(zhuǎn)化的AtAGRl基因的647個氨基紗列(SEQIDNO:2)。圖3顯示用來轉(zhuǎn)化AtAGRl(SEQIDNO:l)基因的雙元載體T-DNA的示意圖。LB，左邊界；pAHAS，擬南芥AHAS啟動子；3，AHAS，AHAS終止信號；SP，超級啟動子；AtAGRl，AtAGRl的cDNA;3，NOS，終止信號；RB，右邊界。圖4A和4B顯示擬南芥AtAGRl(SEQIDNO:l)轉(zhuǎn)基因植物的平板分析。4A表明全部株系均顯示增加的根長度表型。與野生型對照相比，林系5、7、9、10和11顯示更明顯的根長度增加。4B顯示AtAGRl轉(zhuǎn)基因植物的基因水平分析，證實AtAGRl植物表現(xiàn)增加的根長度表型?；谠摲治?，AGR1轉(zhuǎn)基因植物顯示根長度增加29%。在4A和4B內(nèi)，附表顯示用來生成柱狀圖的實際平均值。圖5顯示AtAGRl(SEQIDNO:l)植物在土壤內(nèi)的根分析，其中測量了AtAGRl擬南芥林系的根長度。圖6顯示AtAGRl(SEQIDNO:l)轉(zhuǎn)基因植物的基因水平ANOVA分析。匯總?cè)哭D(zhuǎn)基因林系的分析數(shù)據(jù)以確定全部基因的整體表現(xiàn)。圖7顯示AtAGRl(SEQIDNO:l)轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的葉叢干重的基因水平ANOVA分析。發(fā)明詳述本發(fā)明可以通過參考如下對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案及本文中所包括實施例的詳細(xì)描述而更容易地得到理解。然而，在公開并描述本發(fā)明化合物、組合物和方法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于具體的核酸、具體的多肽、具體的細(xì)胞類型、具體的宿主細(xì)胞、具體的條件或具體的方法等，并且本文中眾多的修改和變例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。還應(yīng)當(dāng)理解本文中所用術(shù)語的目的僅在于描述具體的實施方案并且不意圖是限制性的。尤其，將氨基^列命名為多肽"膜轉(zhuǎn)運蛋白樣多肽"(MTP)無論如何不限制這些序列的功能性。本發(fā)明涉及在增加植物的根生長和/或產(chǎn)量中和/或?qū)φ{(diào)節(jié)植物對環(huán)境脅迫應(yīng)答是重要的MTP和編碼MTP的核酸。更具體地，這些編碼MTP的核酸在植物內(nèi)的過量表達(dá)引起調(diào)節(jié)(增加或減少，優(yōu)選增加)根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性。MTP類的代表成員是從鼠耳芥中分離的AtAGRl、AtAGRl陽2、AtAGRl-3、AtAGRl-4、AtAGRl-5以及從卡諾拉油菜、大豆、向日葵、玉米、稻、亞麻和大麥中分離的全長同系物。在優(yōu)選的實施方案中，該類屬的全部成員是生物活性膜轉(zhuǎn)運蛋白。因此，本發(fā)明包含MTP多核苷酸和多肽序列的轉(zhuǎn)基因作物植物及產(chǎn)生此類轉(zhuǎn)基因作物植物的方法，其中MTP多肽在植物內(nèi)的表達(dá)引起增加的根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性。在一個實施方案中，MTP序列來自植物、優(yōu)選是擬南芥植物、卡諾拉油菜植物、大豆植物、稻植物、向曰葵植物、大麥才直物、亞麻植物或玉米植物。在另一個實施方案中。MTP序列是如表1內(nèi)匯總的基因。優(yōu)選地，已公開的MTP序列與已知的膜轉(zhuǎn)運蛋白具有顯著的同一性百分?jǐn)?shù)。表1.MTP基因、其來源、核苷酸序列和對應(yīng)氨基酸序列，以及與AtAGRl(SEQIDNO:2)在氨基酸水平上共有的同一性百分?jǐn)?shù)(用于全體序列比對的Needleman-Wunsch算法，J.Mol.Biol.48(3):443-53;矩陣:Blosum62;空位開口罰分10.0;空位延伸罰分2.0)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本發(fā)明提供由編碼MTP的核酸所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中與植物的野生型品種相比，核^列在作物植物內(nèi)的表達(dá)引起增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性。尤其，增加的根生長是增加根長度。如本文中所用的術(shù)語"植物"可以根據(jù)上下文理解為意指完整的植物、植物細(xì)胞和植物部分(包括種子)。詞語"植物"還指任何植物，特別指種子植物，并且可以包括，但不限于作物植物。植物部分包括，但不限于莖、根、胚珠、雄蕊、葉、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、配子體、孢子體、花粉、小孢子等。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是雄性不育的。還提供由編碼MTP的核酸所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的植物種子，其中種子含有編碼MTP的核酸，并且其中與植物的野生型品種相比，所述植物對增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性是不分離的。本發(fā)明還提供由表達(dá)MTP的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中種子含有MTP，并且其中與植物的野生型品種相比，所述植物對增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性是不分離的。本發(fā)明還提供通過或從表達(dá)編碼MTP的核酸的轉(zhuǎn)基因植物、其植物部分或其種子中產(chǎn)生的產(chǎn)品。產(chǎn)品可以使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的多種方法得到。如本文中所用的，詞語"產(chǎn)品"包括，但不限于食物、飼料、食物補(bǔ)充物、飼料補(bǔ)充物、化妝品或藥物。將食物視為用于營養(yǎng)目的的組合物。這些組合物還包括用于補(bǔ)充營養(yǎng)的組合物。尤其將動物飼料和動物飼料補(bǔ)充物視作食物。本發(fā)明還提供由轉(zhuǎn)基因植物、植物部分和植物種子中任意一種所產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)產(chǎn)品。農(nóng)業(yè)產(chǎn)品包括，但不限于植物提取物、蛋白質(zhì)、氣基酸、糖類、脂肪、油、聚合物、維生素等。如本文中所用，術(shù)語"品種"指物種內(nèi)的一組植物，其中所述的植物共有使它們與該物種內(nèi)的典型形式及與其它可能品種相區(qū)別的穩(wěn)定特征。在擁有至少一種明顯性狀的同時，一個品種的特征還在于品種內(nèi)個體之間的某些變異，這主要基于性狀在后續(xù)世代的子代之間的孟德爾分離作用所致。如果一個品種對特定性狀達(dá)到遺傳上如此程度的純合以至于當(dāng)不分離的品種自我授粉時，，見察不到子代之間明顯量的性狀獨立分離，則認(rèn)為此品種對該性狀是"不分離的"。在本發(fā)明中，性狀因?qū)胫参锲贩N的一種或多種DNA序列的轉(zhuǎn)基因性表達(dá)而產(chǎn)生。將本發(fā)明的作物植物理解為包括雙子葉作物植物，例如來自豆科(Leguminosae)如物種豌豆(pea)、苜蓿和大豆；傘形科(Umbelliferae)，特別是胡蘿卜屬(Daucus)(更特別是物種胡蘿卜(carota)(胡蘿卜))和芽屬(Apium)(更特別是物種旱芽(graveolensvar.dulce(celery)))及其它眾多物種；茄科(Solanaceae)，特別是番茄屬(Lycopersicon)，更特別是物種番茄(Lycopersiconesculentum)(番蕩)和癡屬(Solan腿)，更特別是物種馬鈴薯(Solanumtuberosum)(馬鈴薯)和癡子(Solanummelongena)(aubergine)、煙草(tobacco)及其它眾多物種；和辣椒屬(Capsicum)、更特別是物種辣椒(Capsicumannum(pepper))物種及其它眾多物種；豆科(Leguminosae)，特別是大豆屬(Glycine)，更特別是物種大豆(Glycinemax)(大豆)及其它眾多物種；和十字花科(Cruciferae),特別是蕓苔屬(Brassica)，更特別是物種歐洲油菜(Brassicanapus)(歐洲油菜)、蕓苔(Brassicacampestris(beet))、甘藍(lán)(BrassicaoleraceacvTastie(巻心菜))、花椰菜(BrassicaoleraceacvSnowballY(花椰菜))和花莖甘藍(lán)(oleraceacvEmperor(broccoli));和擬南芥屬，更特別是物種鼠耳芥及其它眾多物種；菊科(Compositae)，特別是萵苣屬(Lactuca)，更特別是物種萵苣(Lactucasativa(lettuce))及其它眾多物種；和錦葵科(Malvaceae),特別是棉屬(Gossypium),更特別是稱作為棉花的物種；和豆科(Fabaceae)，特別是落花生屬(Arachis)、更特別是物種花生(Arachishypogaea(peanut))。本發(fā)明的作物植物還包括單子葉作物植物，如例如谷物如小麥、大麥、高粱(sorghum)和黍(millet)、黑麥(rye)、黑小麥(triticale)、玉米、稻或燕麥(oat)和甘蔗(sugarcane).還優(yōu)選樹，如蘋果樹、桃樹、柑桔樹(quince)、李樹(plum)、櫻桃樹(cherry)、梨樹(peach)、油桃樹(nectarine)、杏樹(apricot)、木瓜(papaya)、芒果(mango)和其它木本物種，包括針葉樹和落葉樹，如楊樹(poplar)、松(pine)、紅杉(sequoia)、雪松(cedar)、櫟樹(oak)等。尤其優(yōu)選鼠耳芥、煙草(Mcotianatabacum)、歐洲油菜、大豆、玉米、小麥、亞麻、馬鈴薯和萬壽菊(tagetes)。本發(fā)明首次描述MTP用于增加作物植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性。如本文中所用，術(shù)語"多肽"指由肽鍵連接的至少4個氨基酸的鏈。該鏈可以是直鏈的、支鏈的、環(huán)狀的或其組合。因此，本發(fā)明提供從如表1第2列內(nèi)提供的任意生物中選擇的已分離MTP及其同系物在作物植物內(nèi)的用途。在優(yōu)選的實施方案中，MTP選自l)如在表l第4列中提供的任意MTP多肽；和2)其同系物及直向同系物。M酸序列的同系物和直向同系物如下定義。本發(fā)明的MTP優(yōu)選地通過重組DNA^支術(shù)產(chǎn)生。例如，將編碼該多肽的核酸分子克隆至表達(dá)載體(如下文所述)，將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞(如下文所述)并在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)MTP。MTP隨后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的多肽純化技術(shù)，通過適宜的純化方案從細(xì)胞中分離。為本發(fā)明的目的，術(shù)語"重組多核苷酸，，指已經(jīng)通過遺傳設(shè)計加以改變、重排或修飾的多核苷酸。實例包括任何已克隆的多核苷酸,和與異源序列連接或接合的多核苷酸。術(shù)語"重組的"不涉及因天然存在事件(如自發(fā)突變)所致的多核苷酸改變。作為對重組表達(dá)的替代，MTP或其肽可以使用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)化學(xué)地合成。此外，天然的MTP可以從細(xì)月包(例如鼠耳芥細(xì)胞)分離，例如4吏用抗MTP抗體，其中該抗體可以利用MTP或其片段通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。如本文中所用，術(shù)語"環(huán)境脅迫"指與鹽度脅迫、干旱脅迫、溫度脅迫、金屬脅迫、化學(xué)品脅迫、病原體脅迫和氧化脅迫或其組合有關(guān)的次優(yōu)條件。在優(yōu)選的實施方案中，環(huán)境脅迫可以選自鹽度、干旱或溫度中的一個或多個，或其組合，并且尤其可以選自高鹽度、低水含量(干旱)或低溫中的一個或多個。在更優(yōu)選的實施方案，環(huán)境脅迫是干旱脅迫。還如本文中所用，術(shù)語"水利用效率"指植物所產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)的量除以植物在產(chǎn)生該量有機(jī)物質(zhì)時所用水的量，即相對于植物的水利用量的植物干重。如本文中所用，術(shù)語"干重"指植物內(nèi)除水之外的任意物質(zhì)，并包括例如糖類、蛋白質(zhì)、油和礦質(zhì)營養(yǎng)素。還應(yīng)當(dāng)理解如在說明書和權(quán)利要求書中所用，"一，，可以意指一個或多個，取決于所使用的上下文。因此，例如，對"一種細(xì)胞"的稱謂可以意指至少一種可能加以利用的細(xì)胞。還如本文中所用，術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"指呈直鏈或支鏈的、單鏈或雙鏈的RNA或DNA,或其雜交體。該術(shù)語還包括RNA/DNA雜交體。這些術(shù)語還包括位于基因的編碼區(qū)3'端和5'端的非翻譯序列基因編碼區(qū)5，端上游的至少約1000個核苷酸的序列和基因編碼區(qū)3'端下游的至少約200個核苷酸的序列。較不常見的堿基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤和其它堿基也可以用于反義配對、dsRNA配對和核酶配對。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔類似物的多核苷酸已經(jīng)證實以高親和力結(jié)合RNA并且AJ^因表達(dá)的有效反義抑制物。還可以作出其它修飾，如對磷酸二酯主鏈或RNA的核糖基團(tuán)內(nèi)2，-羥基的修飾。反義多核苷酸和核酶可以完全由核糖核苷酸組成，或可以混合含有核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸，本發(fā)明的多核苷酸可以通過任意方法產(chǎn)生，包括基因組制備、cDNA制備、體外(/wv^o)合成、RT-PCR和體外或體內(nèi)(iwWiv)轉(zhuǎn)錄。"分離的"核酸分子是基本上與其它核酸分子(即編碼其它多肽的序列)分開的核酸分子，其中所述的其它核酸分子存在于該核酸的天然來源內(nèi)。優(yōu)選地，"分離的，，核酸不含在該核酸的天然存在的復(fù)制子內(nèi)天然分布于此核酸兩側(cè)的某些序列(即位于該核酸的5'端和3'端處的序列)。例如，將克隆的核酸^f見為分離的核酸。在多種實施方案種，分離的MTP核酸分子可以含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列天然分布于細(xì)胞(例如鼠耳芥細(xì)胞)的基因組DNA內(nèi)的MTP核酸分子側(cè)翼，其中從所述的細(xì)胞內(nèi)衍生分離的MTP核酸分子。如果核酸已經(jīng)因人工干預(yù)受到改變，或位于不是該核酸天然位點的基因座或位置內(nèi)，或當(dāng)它通過農(nóng)桿菌感染得以導(dǎo)入細(xì)胞時，則也將該核酸視為分離的核酸。此外，"分離的"核酸分子如cDNA分子，在通過重組技術(shù)產(chǎn)生時，可以不含與其天然地結(jié)合的某些其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時，不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。具體從"分離的"核酸的定義中排除作為體外核酸制備物或作為轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞制備物而存在的天然存在的染色體(如染色體擴(kuò)展物(chromosomespreads))、人工染色體文庫、基因組文庫和cDNA文庫，其中宿主細(xì)胞是體外異質(zhì)性制備物或鋪板為單菌落的異質(zhì)群體。還具體排除其中所述的核酸占載體分子內(nèi)核酸插入物的數(shù)目小于5%的以上所述文庫。進(jìn)一步具體排除的是完整細(xì)胞基因組DNA制備物或完整細(xì)胞RNA制備物(包括經(jīng)機(jī)械剪切或酶消化的完整細(xì)胞制備物)。更進(jìn)一步具體排除的是通過電泳分離的作為體外制備物或作為異質(zhì)混合物存在的完整細(xì)胞制備物，其中本發(fā)明的核酸沒有在電泳介質(zhì)內(nèi)進(jìn)一步從異源核酸中得以分離(例如通過從瓊脂糖凝膠或尼龍膜印跡物中的異質(zhì)性條帶群體內(nèi)裁下單個條帶而進(jìn)一步得以分離)。本發(fā)明的核酸分子(例如具有如在表l第3列中提供的任意SEQIDNO和本文中提供的序列信息加以分離。例如，MTPcDNA可以使用如表l第3列中提供的任意SEQIDNO的全部或部分從任何作物文庫中分離。此外，包含如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的全部或部分的核酸分子可以使用基于這種序列所設(shè)計的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)加以分離。例如，mRNA可以從才直物細(xì)胞中分離(例如通過Chirgwin等，1979，Biochemistry18:5294-5299的異硫氰酸胍提取法)，并且cDNA可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶(例如MoloneyMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，可從Gibco/BRL,Bethesda，MD獲得；或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,可從SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL獲得)制備。用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的合成性寡核苷酸引物可以基于如在表l第3列中顯示的任意序列內(nèi)所述的核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計。本發(fā)明的核酸分子可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，使用cDNA或備選地使用基因組DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增。如此擴(kuò)增的核酸分子可以克隆至適宜的載體并通過DNA測序分析進(jìn)行表征。此外，與編碼MTP的核苷酸序列對應(yīng)的寡核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)制備，例如使用自動化DNA合成儀。在一個實施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子包含如在表l第3列中顯示的任意序列內(nèi)所述的核苷酸序列。這些cDNA可以包含編碼MTP的序列(即"編碼區(qū)")，以及5，非翻譯序列和3，非翻譯序列。備選地，本發(fā)明的核酸分子可以僅包含如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的編碼區(qū)，或可以含有從基因組DNA中分離的完整基因組片段。本發(fā)明還包括編碼如本文中所述MTP的MTP編碼性核酸。優(yōu)選編碼如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所示MTP的MTP編碼性核酸。此外，本發(fā)明的核酸分子可以包含如在表1第3列內(nèi)提供的任意序列的編碼區(qū)的部分，例如可以用作探針或引物的片段，或編碼MTP的有生物活性部分的片段。從對如表l內(nèi)所提供任意生物的MTP基因的克隆中測定的核苷酸序列允許產(chǎn)生這樣的探針和引物，其中設(shè)計所述探針和引物旨在鑒定和/或克隆其它細(xì)胞類型及生物內(nèi)的MTP同系物以及來自其它作物植物或相關(guān)物種內(nèi)的MTP同系物。編碼區(qū)的部分也可以編碼MTP的有生物活性的片段。如本文中所用，術(shù)語MTP的"生物活性部分"意圖包括MTP的如此部分(例如結(jié)構(gòu)域/基序)，其中該部分參與調(diào)節(jié)植物內(nèi)根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性，并且更有選地是干旱耐受性。為本發(fā)明的目的，調(diào)節(jié)根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性指與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏母L和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性相比，包含MTP表達(dá)盒(或表達(dá)載體)的轉(zhuǎn)基因植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性增加或減少至少10%。用于定量根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性的方法至少在下文實施例5、6和17-19中提供。在優(yōu)選的實施方案中，MTP的生物活性部分增加、優(yōu)選地通過增加根長度而增加植物的根生長。MTP的生物活性部分包括包含如此M酸序列的肽，其中所述的M餅列衍生自MTP的M餅列(例如如在表1第4歹'J中提供的任意SEQIDNO的M酸序列)或與MTP完全相同的如此多肽的M酸序列，其中并顯示MTP的至少一種活性。通常，生物活性部分(例如，具有例如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多個氨基酸長度的肽)包含具有MTP的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。此外，其中多肽的其它區(qū)域被缺失的有生物活性的其它部分可以通過重組技術(shù)進(jìn)行制備并評估在本文中所述的一種或多種活性。優(yōu)選地，MTP的生物活性部分包括一個或多個選擇的結(jié)構(gòu)域/基序或其具有膜轉(zhuǎn)運蛋白活性的部分。在一個實施方案中，MTP的生物活性部分包含如下保守基序的至少一種。第一基序是PLYVAMILAY(SEQIDNO:123)。第二基序是INRFVAXFAVPLLSFHFI(SEQIDNO:124)，其中X選自氨基酸殘基纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸。第三基序是FSLSTLPNTLVMGIPLL(SEQIDNO:125)。在另一個實施方案中，第一基序存在于多肽的M酸位置16與25之間的位置內(nèi)，第二基序存在于多肽的氨基酸位置42與59之間的位置內(nèi)并且第三基序存在于多肽的氬基酸位置105與121之間的位置內(nèi)。本發(fā)明還提供MTP嵌合多肽或融合多肽。如本文中所用，MTP"嵌合多肽"或"融合多肽"包含有效地與非MTP連接的MTP。MTP指具有與MTP對應(yīng)的氨基酸序列的多肽，而非MTP指具有與如此氨基酸序列對應(yīng)的多肽，其中所述的^J^,列基本上與MTP不相同，例如與MTP不同并衍生自相同生物或不同生物的多肽。就融合多肽而言，術(shù)語"有效連接的"意圖說曰/預(yù)期功能。非MTP可以融合至MTP的絲末端或g末端。例如，在一個實施方案中，融合多肽是其中MTP序列融合至GST序列羧基末端的GST-MTP融合多肽。此類融合多肽可以促進(jìn)重組MTP的純化。在另一個實施方案中，融合多肽是在其氨基末端含有異源信號序列的MTP。在某些宿主細(xì)胞(例如哺乳動物宿主細(xì)胞)中，MTP的表達(dá)和/或分泌可以通過使用異源信號序列得以增加。優(yōu)選地，本發(fā)明的MTP嵌合多肽或融合多肽通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，編碼不同多肽序列的DNA片段按照常規(guī)技術(shù)以符合可讀框方式得到連接，例如通過使用平末端或交錯末端以便連接、限制性酶消化以便提供適宜末端、根據(jù)需要補(bǔ)平粘末端、堿性磷酸酶處理以避免不想要的接合以及酶連接。在另一個實施方案中，融合基因可以通過常規(guī)技術(shù)合成，包括自動DNA合成儀。備選地，基因片段的PCR擴(kuò)增可以使用錨式引物實施，錨式引物在兩個連續(xù)基因片段間產(chǎn)生互補(bǔ)性突出端，突出端隨后可以復(fù)性并再擴(kuò)增以生成嵌合基因序列(見例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,編者Ausubel等JohnWiley&Sons:1992)。此外，可商業(yè)地獲得已經(jīng)編碼融合部分(例如，GST多肽)的眾多表達(dá)載體。編碼MTP的核酸可以克隆到此種表達(dá)載體內(nèi)以至于融合部分以符合可讀框方式與MTP連接。除本文中所述的MTP的片段和融合多肽之外，本發(fā)明包括植物中天然存在的MTP及MTP編碼性核酸的同系物和類似物。"同系物，，在本文中定義為分別具有相似或"相同，，的核苷酸序列或M酸序列的兩種核酸或多肽。同系物包括如本文以下定義的MTP的等位基因變體、直向同系物、旁向同系物、激動劑和拮抗物。術(shù)語"同系物"還包含這樣的核酸分子(及其部分)，其因遺傳密碼子的簡并性而不同于如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述的核苷*列并且因此編碼與由如在表1第3歹'J內(nèi)提供的SEQIDNO內(nèi)描述的對應(yīng)核苷酸序列所編碼的MTP相同的MTP。如本文中所用，"天然存在的"MTP指在自然界中存在的MTP氨基酸序列。優(yōu)選地，天然存在的MTP包含如在表1第4列內(nèi)提供的任意SEQIDNO的氨基酸序列。MTP的激動劑可以保留基本上相同或部分的MTP生物活性。MTP的拮抗物可以抑制天然存在形式的MTP的一種或多種活性。與MTPcDNA的天然等位基因變體和類似物、直向同系物和旁向同系物相對應(yīng)的核酸分子可以基于它們與本文中所述的MTP核酸的同一性，使用MTPcDNA或其部分作為雜交探針,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)在嚴(yán)格雜交條件下分離。在替代性的實施方案中，MTP的同系物可以通過對MTP的突變體(例如截短突變體)組合文庫篩選MTP激動劑活性或拮抗物活性得以鑒定。在一個實施方案中，MTP變體的混雜文庫通過在核酸水平上的組合性誘變作用而產(chǎn)生并且由混雜的基因文庫編碼?？梢匀绱水a(chǎn)生MTP變體的混雜文庫，例如，將合成性寡核苦酸的混合物用酶連接成基因序列，以至于一組簡并的有效MTP序列可表達(dá)為單個多肽或備選地，表達(dá)為含有本文中MTP序列組的一組較大融合多肽(例如用于噬菌體展示)。存在可以用來從簡并性寡核苷酸序列中產(chǎn)生有效MTP同系物文庫的多種方法。簡并性基因序列的化學(xué)合成可以在自動DNA合成儀上開展，并且隨后將合成性基因連接到適宜的表達(dá)載體內(nèi)。使用一套簡并性基因允許在一種混合物內(nèi)提供編碼所需的有效MTP序列組的全部序列。用于合成簡并性寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。此外，MTP編碼區(qū)的片段文庫可以用來產(chǎn)生MTP片段的混雜群體以篩選并隨后選擇MTP的同系物。在一個實施方案中，編碼性序列片段的文庫可以如此產(chǎn)生，即通過用核酸酶在每分子僅發(fā)生一次切割的條件下處理編碼MTP的序列的雙鏈PCR片段，使雙鏈DNA變性，使此DNA復(fù)性以形成可以包括來自不同已切割產(chǎn)物中的有義/反義配對的雙鏈DNA，通過用SI核酸酶處理而除去來自再形成的雙螺旋內(nèi)的單鏈部分，并且將得到的片段文庫連接到表達(dá)載體內(nèi)。通過該方法，可以衍生編碼MTP多種大小的氨基末端片段、羧基末端片段和內(nèi)部片段的表達(dá)文庫。性文庫內(nèi)的基因產(chǎn)物和用于對cDNA文庫篩選具有所選擇特性的基因產(chǎn)物。此類技術(shù)適應(yīng)于快速篩選通過MTP同系物的組合性誘變所產(chǎn)生的基因文庫。最廣泛用來篩選大型基因文庫的對高通量分析可操作的技術(shù)通常包括將基因文庫克隆至復(fù)制型表達(dá)載體內(nèi)、用得到的載體文庫轉(zhuǎn)化適宜的細(xì)胞并在如此條件下表達(dá)組合性基因，其中在該條件下所需活性的檢測有助于分離編碼了基因(基因產(chǎn)物被檢觀，J)的載體。遞歸總體誘變(REM)(—種提高文庫內(nèi)功能性突變體的頻率的技術(shù))可以與篩選鑒定法組合使用以鑒定MTP同系物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS89:7811-7815;Delgrave等，1993,PolypeptideEngineering6(3):327-331)。在另一個實施方案中，可以利用基于細(xì)胞的鑒定法來使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法分析混雜的MTP文庫。本發(fā)明還提供鑒定新MTP的方法，包括(a)產(chǎn)生如下文所述的應(yīng)答于MTP的特異性抗體或其片段；(b)用抗體篩選推定的MTP物質(zhì)，其中抗體對物質(zhì)的特異性結(jié)合表明存在潛在的新MTP;和(c)與已知MTP比較，分析已結(jié)合的物質(zhì)以確定其新穎性。如上所述，本發(fā)明涉及MTP及其同系物。為確定兩種M酸序列(例如如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列及其突變形式)的序列同一性百分?jǐn)?shù)，將序列為優(yōu)化比較目的進(jìn)行比對(例如，可以為與另一種多肽或核酸優(yōu)化比對的目的而向一種多肽的序列內(nèi)導(dǎo)入空位)。隨后比較在對應(yīng)氨基酸位置上的氨基酸殘基。當(dāng)在一個序列(如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列)內(nèi)的位置作為另一個序列(例如，如在表l第4列中提供的對應(yīng)SEQIDNO的突變形式的序列)內(nèi)的相應(yīng)位置由相同的氛基酸殘基占據(jù)時，則兩個分子在該位置上是相同的。相同類型的比較可以在兩種核酸序列之間進(jìn)行。兩種序列間的序列同一性百分?jǐn)?shù)是序列所共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即序列同一性百分?jǐn)?shù)=相同位置數(shù)/總位置數(shù)xl00)。優(yōu)選地，本發(fā)明內(nèi)所包含的分離的M酸同系物與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所示的整個M酸序列具有至少約50-60%、優(yōu)選至少約60-70%并且更優(yōu)選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%以及最優(yōu)選至少約96%、97%、98%、99%或更高同一性。在另一個實施方案中，本發(fā)明內(nèi)所包含的分離的氨基酸同系物與通過如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)顯示的核酸序列所編碼的整個氨基酸序列具有至少約50-60%、優(yōu)選至少約60-70%并且更優(yōu)選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%以及最優(yōu)選至少約96%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，分離的M酸同系物包含如下三種保守基序中的至少一種基序。第一基序是PLYVAMILAY(SEQIDNO:123)。第二基序是INRFVAXFAVPLLSFHFI(SEQIDNO:124),其中X選自氨基酸殘基纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸。第三基序是FSLSTLPNTLVMGIPLL(SEQIDNO:125)。在另一個實施方案中，第一基序存在于多肽的M酸位置16與25之間的位置內(nèi)，第二基序存在于多肽的氨基酸位置42與59之間的位置內(nèi)并且第三基序存在于多肽的氨基酸位置105與121之間的位置內(nèi)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明分離的核酸同系物包含這樣的核苷酸序列，其中該核苷酸序列與如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所示的核苷酸序列或與其包含至少60個連續(xù)核香酸的部分具有至少約40-60%、優(yōu)選至少約60-70%、更優(yōu)選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-卯％或卯-95%并且甚至更優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性。對核酸而言，序列比較的優(yōu)選長度是至少75個核苷酸，更優(yōu)選至少100個核苷酸并且最優(yōu)選是全長的編碼區(qū)。更優(yōu)選核酸同系物編碼與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO具有同源性的蛋白質(zhì)。還優(yōu)選本發(fā)明分離的核酸同系物編碼這樣的MTP或其部分，其與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的M酸序列具有至少約80%同一性，并且作為植物內(nèi)根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫應(yīng)答的調(diào)節(jié)物發(fā)揮作用。在更優(yōu)選的實施方案中，核酸同系物在植物內(nèi)的過量表達(dá)增加根生長和/或產(chǎn)量和/或植物對環(huán)境脅迫的耐受性。在又一個優(yōu)選的實施方案中，核酸同系物編碼作為膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用的MTP。為本發(fā)明的目的，兩種核酸序列或兩種多肽序列之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)使用在歐洲分子生物學(xué)開放軟件包(EuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(EMBOSS))內(nèi)執(zhí)行的Needleman-Wunsch全體比對算法(J.Mol.Biol.48(3):443-53)確定。為了多重比對目的(ClustalW算法)，空位開口罰分是10并且空位延伸罰分是0.05，具有blosum62矩陣。將理解的是為確定序列同一性的目的，當(dāng)DNA序列與RNA序列比較時，胸腺嘧啶核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。在另一個方面，本發(fā)明提供分離的核酸，該核酸包含與如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。更具體地，本發(fā)明分離的核酸分子是至少15個核苷酸長度并與包含如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的核苷酸序列的核酸分子在嚴(yán)格條件下雜交。在其它實施方案中，核酸是至少30、50、100、250個或更多個核苷酸長度。優(yōu)選地，本發(fā)明分離的核酸同系物包含這樣的核苷,列，該核苷酸序列與如在表l第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所示的核苷^列在高嚴(yán)格性條件下雜交并且作為植物內(nèi)根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性的調(diào)節(jié)物發(fā)揮作用。在又一個優(yōu)選實施方案中，分離的核酸同系物在植物內(nèi)的過量表達(dá)增加植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，分離的核酸同系物編碼作為膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用的MTP。如本文中就DNA與DNA印跡的雜交方面所用，術(shù)語"嚴(yán)格條件"指在60。C在10XDenhart's溶液、6xSSC、0.5。/。SDS和100fig/ml變性鮭精DNA內(nèi)雜交過夜。印跡物在62。C每次30分鐘依次在3xSSC/0.1。/。SDS、隨后在lxSSC/0.10/。SDS并且最后在0.1xSSC/0.1%SDS內(nèi)洗滌。在優(yōu)選的實施方案中，短語"嚴(yán)格條件"指在65°C在6xSSC溶液內(nèi)雜交。還如本文中所用，"高嚴(yán)格性條件，，指在65。C在10xDenhart，s溶液、6xSSC、0.5%SDS和100fig/ml變性鮭精DNA內(nèi)雜交過夜。印跡物在65°C每次30分鐘依次在3xSSC/0.1%SDS、隨后在lxSSC/0.1%SDS,并且最后在O.lxSSC/0.1%SDS內(nèi)洗滌。用于核酸雜交的方法在Mdnkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138:267-284;CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章,編者Ausubel等，GreenePublishingandWiley-lnterscience,NewYork,1995;和Tijssen,1993，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology:HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分，第2章,Elsevier,NewYork,1993內(nèi)描述。優(yōu)選地，與如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的序列在嚴(yán)格性條件或高嚴(yán)格性條件下雜交的本發(fā)明分離的核酸分子與天然存在的核酸分子對應(yīng)。如本文中所用，"天然存在的"核酸分子指具有在自然界中存在的核苷酸序列(例如編碼天然多肽)的RNA分子或DNA分子。在一個實施方案中，核酸編碼天然存在的MTP。使用以上所述的方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法，本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員可以分離包含如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所示的氨基^列的MTP同系物。這些同系物的一個亞類是等位基因變體。如本文中所用，術(shù)語"等位基因變體"指含有在MTP氨基酸序列內(nèi)造成改變并于天然群體(例如植物物種或品種)內(nèi)存在的多態(tài)性的核苷酸序列。此類天然的等位基因變異一般可以在MTP核酸內(nèi)引起1-5%差異。等位基因變體可以通過對多種不同植物內(nèi)的目的核#列測序進(jìn)行鑒定，其中所述的測序可以通過使用在這些植物內(nèi)鑒定相同MTP遺傳基因座的雜交探針而容易地實施。MTP內(nèi)作為天然等位基因變異結(jié)果并且不改變MTP的功能性活性的任何及全部的這類核酸變異以及所產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)性或變異將意圖處于本發(fā)明的范圍。此外，編碼來自相同物種或其它物種的MTP的核酸分子，如MTP類似物、直向同系物和旁向同系物將意圖處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中所用，術(shù)語"類似物"指具有相同或相似的功能而在不相關(guān)的生物內(nèi)獨立進(jìn)化的兩種核酸。如本文中所用，術(shù)語"直向同系物"指來自不同物種，但通過物種形成從共同先祖基因中進(jìn)化的兩種核酸。通常，直向同系物編碼具有相同功能或相似功能的蛋白質(zhì)。還如本文中所用，術(shù)語"旁向同系物，，指因在基因組因內(nèi)重復(fù)作用而相關(guān)的兩種核酸。旁向同系物通常具有不同的功能，不過這些功能可以是相關(guān)的(Tatusov，R丄.等，1997，Science278(5338):631-637)。天然存在的MTP的類似物、直向同系物和旁向同系物可以因翻譯后修飾、因氨基i^f列差異或因這兩種情況而不同于天然存在的MTP。翻譯后修飾包括多肽在體內(nèi)和體外的化學(xué)衍生作用，如乙?；饔?、羧化作用、磷酸化作用和糖基化作用，并且此類修飾可以在多肽合成及加工期間或在使用分離的修飾酶處理后發(fā)生。尤其，本發(fā)明的直向同系物通常對天然存在的MTP氨基酸序列的全部或部分表現(xiàn)至少80-85%、更優(yōu)選85-90%或90-95%并且最優(yōu)選95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性，或100%序列同一性，并且表現(xiàn)與MTP相似的功能。優(yōu)選地，本發(fā)明的MTP直向同系物作為植物內(nèi)根生長和/或環(huán)境脅迫應(yīng)答的調(diào)節(jié)物發(fā)揮作用和/或作為膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用。更優(yōu)選地，本發(fā)明的MTP直向同系物增加植物內(nèi)的根生長和/或脅迫耐受性。在一個實施方案種，MTP直向同系物作為膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用。此外，除可能存在于群體內(nèi)的MTP序列的天然存在變體之外，技術(shù)人員還認(rèn)識到可以通過在如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的核苷^列內(nèi)突變而導(dǎo)入變化，因而在所編碼的MTP的氨基酸序列內(nèi)引起變化，而不改變MTP的功能性活性。例如，可以在如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的序列內(nèi)開展在"非必需"氨基酸殘基處引起氨基酸置換的核苷酸置換。"非必需"氨基酸殘基是可以從一種MTP的野生型序列中加以變更而不改變所述MTP的活性的殘基，而"必需"氨基酸殘基對MTP的活性是必需的。然而，其它M酸殘基(例如在具有MTP活性的結(jié)構(gòu)域內(nèi)是非保守的或僅是半保守的那些氨基酸殘基)可能對活性不是是必需的，并且因此有可能可進(jìn)行操作改變，而不改變MTP活性。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及編碼在對MTP活性不是必需的氨基酸殘基內(nèi)含有變化的MTP的核酸分子。此類MTP在M酸序列上與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所含有的序列不同，然而仍保留本文中所述MTP活性中的至少一種活性。在一個實施方案中，分離的核酸分子包含編碼多肽的核苷^列，其中該多肽包含與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列至少約50-60%、更優(yōu)選地與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列至少約60-70%、甚至更優(yōu)選地與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%并且最優(yōu)選地與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列至少約96%、97%、98%或99。/。的^J^酸序列。本發(fā)明的優(yōu)選MTP同系物優(yōu)選地參與植物內(nèi)植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性應(yīng)答，或更具體地作為膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用?？梢匀绱水a(chǎn)生編碼與如在表1第4列中所提供任意SEQIDNO的多肽序列具有序列同一性的MTP的分離核酸分子，即通過分別將一個或多個核苷酸置換、添加或缺失導(dǎo)入如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的核苷酸序列，以至于將一個或多個氬基酸置換、添加或缺失導(dǎo)入所編碼的表1第3列中提供的任意SEQIDNO的序列。優(yōu)選地，在一個或多個預(yù)測為非必需的氨基酸殘基處開展保守性氨基酸置換。"保守性氨基酸置換"是其中將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的氨基酸置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已被定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、帶非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有卩分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此將MTP中預(yù)測的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地替換為來自相同側(cè)鏈家族的另一種基酸殘基。備選地，在另一個實施方案中，突變可以沿著全部或部分的MTP編碼序列隨機(jī)導(dǎo)入，例如通過飽和誘變，并且可以對得到的突變體篩選如本文中所述的MTP活性以鑒定保留MTP活性的突變體。對如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的序列誘變后，編碼的多肽可以進(jìn)行重組性表達(dá)，并且多肽的活性可以如至少在實施例5、6和17-19內(nèi)所述通過分析表達(dá)多肽的植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性得以測定。此外，可以產(chǎn)生優(yōu)化的MTP核酸。優(yōu)選地，優(yōu)化的MTP核酸編碼當(dāng)在植物內(nèi)過量表達(dá)時調(diào)節(jié)植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性，并且更優(yōu)選增加植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性的MTP。如本文中所用，"優(yōu)化的，，指經(jīng)基因工程化以增加在給定植物或給定動物內(nèi)的表達(dá)的核酸。為向植物提供優(yōu)化的MTP核酸，該基因的DNA序列可以被修飾以l)包含由高度表達(dá)的植物基因所偏好的密碼子；2)在核苷酸堿基組成上包含與植物內(nèi)大量存在A+T含量相等的A+T含量；3)形成植物起始序列；或以4)消除這樣的序列，其中所述序列導(dǎo)致RNA不穩(wěn)定化、不適宜地聚腺苷酸化、降解和終止，或形成次級發(fā)夾結(jié)構(gòu)或RNA剪接點。MTP核酸在植物內(nèi)增加的表達(dá)可以通過利用在常見植物或在特定植物內(nèi)的密碼子使用分布頻率而實現(xiàn)。用于優(yōu)化植物內(nèi)核酸表達(dá)的方法可以在EPA0359472;EPA0385962;PCT申請?zhí)朩O91/16432;美國專利號5,380,831;美國專利號5,436,391;Perlack等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324-3328和Murray等，1989，NucleicAcidsRes.17:477-498內(nèi)找到。如本文中所用，"優(yōu)選的密碼子使用頻率"指由特定宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子以指示給定氨基酸方面所表現(xiàn)出的偏好性。為測定特定密碼子在基因內(nèi)的使用頻率，將該密碼子在基因內(nèi)的出現(xiàn)次數(shù)除以基因內(nèi)指示相同氨基酸的全部密碼子的總出現(xiàn)次數(shù)。類似地，由該宿主細(xì)胞所表現(xiàn)的優(yōu)選的密碼子使用頻率可以通過將在宿主細(xì)胞所表達(dá)的多種基因內(nèi)的優(yōu)選密碼子使用頻率平均化而計算。優(yōu)選該分析應(yīng)當(dāng)限于宿主細(xì)胞高度表達(dá)的基因。用于合成性基因的優(yōu)選密碼子使用頻率距離宿主細(xì)胞所用的優(yōu)選密碼子使用頻率的偏離百分?jǐn)?shù)首先通過確定單個密碼子使用頻率距離宿主細(xì)胞的單個密碼子使用頻率的偏離百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計算，隨后得到在全部密碼子范圍內(nèi)的平均偏離。如本文中定義，該計算包括獨特密碼子(即ATG和TGG)。通常而言，使用等式lA=n=lZxn-Ynxn乘以100Z而計算優(yōu)化基因的密碼子使用頻率距離宿主細(xì)胞的密碼子使用頻率的整體平均偏離，其中Xn=對于宿主細(xì)胞內(nèi)密碼子n的使用頻率；Yn^成性基因內(nèi)對密碼子n的使用頻率；n代表指示氨基酸的單個密碼子；并且密碼子的總次數(shù)是Z。對全部氨基酸而言，密碼子使用頻率的整體偏離A優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)小于約25%并且更優(yōu)選小于約10%。因此，MTP核酸可以受到優(yōu)化以至它的密碼子分布頻率偏離于高度表達(dá)的植物基因的密碼子分布頻率優(yōu)選地不超過25%，并且更優(yōu)選地不超過約10%。此外，考慮了簡并性第三減基的G+C百分含量(單子葉植物基因似乎在該位置上偏好G+C,而雙子葉植物基因則不是這樣)。還認(rèn)識到XCG(其中X是A、T、C或G)核苷酸是雙子葉植物中偏好性最低的密碼子，而XTA密碼子在單子葉植物和雙子葉植物中均應(yīng)當(dāng)避免。本發(fā)明優(yōu)化的MTP核酸還優(yōu)選地具有這樣的CG及TA雙聯(lián)體避開指數(shù)(avoidanceindex),其中所述的CG及TA雙聯(lián)體避開指數(shù)與所選擇宿主植物(例如鼠耳芥、稻等)的CG及TA雙聯(lián)體避開指數(shù)非常接近。更優(yōu)選地，這些指數(shù)偏離于宿主指數(shù)不超過約10-15%。此外，除以上所述的編碼MTP的核酸分子之外，本發(fā)明的另一方面涉及對所述核酸分子為反義的分離的核酸分子。據(jù)信反義多核苷酸通過特異性地結(jié)合多核苷酸靶并且干擾該多核苷酸靼的轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運、翻譯和/或穩(wěn)定性而抑制此多核苷酸靼的基因表達(dá)。在現(xiàn)有
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)描述了用于佳Jl義多核苷酸靶向至染色體DNA、至初級RNA轉(zhuǎn)錄物或至已加工的mRNA的方法。優(yōu)選地，靼區(qū)域包括剪接位點、翻譯起始密碼子、翻譯終止密碼子和可讀框內(nèi)的其它序列。為本發(fā)明的目的，術(shù)語"反義"指這樣的核酸，其中該核酸包含充分地與基因、初級轉(zhuǎn)錄物或已加工mRNA的全部或部分互補(bǔ)以至干擾內(nèi)源性基因表達(dá)的多核苷酸。"互補(bǔ)性"多核苷酸是能夠根據(jù)Watson-Crick互補(bǔ)原則發(fā)生堿基配對的那些多核苷酸。具體而言，噤呤將與嘧咬堿基配對，以形啶配對(A:T)的組合，或在RNA的例子內(nèi)腺嘌呤與尿嘧啶配對(A:U)的組合。應(yīng)當(dāng)理解兩種多核苷酸可以相互雜交，即便它們彼此不是完全互補(bǔ)，只要每種多核苷酸具有基本上與另一種多核苷酸互補(bǔ)的至少一個區(qū)域即可。術(shù)語"反義核酸"包括可以被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生反義RNA的單鏈RNA表達(dá)盒和雙鏈DNA表達(dá)盒。"活性"反義核酸是能夠選擇性地與編碼如此多肽的初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA雜交的反義RNA分子，其中所述多肽與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的多肽具有至少80%序列同一性。反義核酸可以與完整的MTP編碼鏈互補(bǔ)或僅與其部分互補(bǔ)。在一個實施方案中，反義核酸分子對編碼MTP的核苷酸序列的編碼鏈的"編碼區(qū)"M義的。術(shù)語"編碼區(qū)"指核苷酸序列中包含翻譯成氨基酸殘基的密碼子的區(qū)域。在另一個實施方案中，反義核酸分子對編碼MTP的核苷酸序列的編碼鏈的"非編碼區(qū)"是反義的。術(shù)語"非編碼區(qū)"指分布在編碼區(qū)側(cè)翼的未翻譯成氨基酸的5'序列和3'序列(即也稱作5'非翻譯區(qū)和3'非翻譯區(qū))。反義核酸分子可以與MTPmRNA的整個編碼區(qū)互補(bǔ)，不過更優(yōu)選地是僅對MTPmRNA內(nèi)編碼區(qū)或非編碼區(qū)的部分為反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可以與MTPmRNA的翻譯起點周圍的區(qū)域互補(bǔ)。反義寡核苷酸可以是例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸長度。通常，本發(fā)明的反義分子包含這樣的RNA，其中所述的RNA與如表l第3列中提供的任意SEQIDNO的至少14個連續(xù)核苷酸或編碼如表1第4列內(nèi)所提供任意SEQIDNO的多肽的多核苷酸具有60-100%序列同一性。優(yōu)選地，序列同一性是至少70%,更優(yōu)選是至少75%、80%、85%、90%、95%、98%并且最優(yōu)選是99%。本發(fā)明的反義核酸可以使用本領(lǐng)域已知的方法，利用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)加以構(gòu)建。例如，反義核酸(例如反義寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多種修飾的核苷酸進(jìn)行化學(xué)地合成，其中設(shè)計修飾的核苷酸旨在增加分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或旨在增加反義核酸與有義核酸間所形成雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核苷酸?？捎脕懋a(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧-定、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏ぁ?-(羧基羥甲基)尿嘧咬、5-羧曱基氨曱基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨曱基尿嘧啶、二氬尿嗜咬、卩-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺噤呤、1-甲基鳥噪呤、1-甲基次黃嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-曱基腺嘌呤、2-甲基鳥噤呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-曱基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、p-D-mannosylqueosine、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧咬、2-甲硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嗜啶、2-硫代尿嘧咬、4-硫代尿嗜咬、5-甲基尿嘧啶、尿嗜咬-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-]\-2-羧丙基)尿嘧咬、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。備選地，反義核酸可以使用表達(dá)載體以生物方式產(chǎn)生，其中核酸已經(jīng)以反義方向亞克隆至所述的載體內(nèi)(即從所插入核酸中轉(zhuǎn)錄的RNA與目的靶核酸處在反義方向上，在如下部分中進(jìn)一步描述)。在又一個實施方案。本發(fā)明的反義核酸分子是a-異頭核酸分子。a-異頭核酸分子與互補(bǔ)性RNA形成特異的雙鏈雜交體，在所述的互補(bǔ)性RNA中與常見的p亞基相反，鏈彼此呈反平行分布(Gaultier等，1987，NeuleicAcids.Res.15:6625-6641)。反義核酸分子也可以包含2，-0-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，NucleicacidsRes.15:6131畫6148)或嵌合性RNA-DNA類似物(Inoue等，1987，F(xiàn)EBSLett.215:327-330)。本發(fā)明的反義核酸分子通常施用至細(xì)胞或在原位(/"'似)產(chǎn)生，以至它們與編碼MTP的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合以便因而抑制MTP多肽的表達(dá)(例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)。雜交可以因形成穩(wěn)定雙鏈體的核苷酸常規(guī)互補(bǔ)性，或例如在與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸分子例子中通過在雙螺旋大溝內(nèi)的特異性相互作用而發(fā)生。反義分子可以受到修飾以至它特異性地與已表達(dá)于所選細(xì)胞表面上的受體或抗原結(jié)合，例如通過將反義核酸分子連接到與細(xì)胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體上。反義核酸分子也可以使用本文中所述的載體被送遞至細(xì)胞內(nèi)。為實現(xiàn)反義分子的足夠細(xì)胞內(nèi)濃度，優(yōu)選其中反義核酸分子受原核生物強(qiáng)啟動子、病毒強(qiáng)啟動子或真核生物(包括植物)強(qiáng)啟動子控制的載體。作為反義多核苷酸的替代，核酶、有義多核苷酸或雙鏈RNA(dsRNA)可以用來減少MTP多肽的表達(dá)。如本文中所用，術(shù)語"核酶"意指基于催化性RNA的具有核糖核酸酶活性的能夠切割單鏈核酸(如mRNA)的酶，其中所述的單鏈核酸與核酶具有互補(bǔ)性區(qū)域。核酶(例如在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature334:585-591內(nèi)所述的錘頭核酶)可以用來催化性地切割MTPmRNA轉(zhuǎn)錄物以便因此抑制MTPmRNA的翻譯。對編碼MTP的核酸具有專一性的核酶可以基于如本文中所公開的MTPcDNA的核苷酸序歹'J(即如表1第3列中提供的任意SEQIDNO)或基于根據(jù)本發(fā)明中所教授的方法而待分離的異源序列加以設(shè)計。例如，可以構(gòu)建四膜蟲(7Wm^v附ewfl)L-19IVSRNA的衍生物，其中活性部位的核苷酸序列與編碼MTP的mRNA內(nèi)待切割的核苷酸序列是互補(bǔ)的。例如見授予Cech等的美國專利號4,987,071和5,116,742。備選地，MTPmRNA可以用來從RNA分子庫內(nèi)選擇具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。見例如Bartel，D.和Szostak,J.W.,1993，Science261:1411-1418。在優(yōu)選的實施方案中，核酶將含有具有至少7、8、9、10、12、14、16、18或20個核苷酸并且更優(yōu)選是7或8個核苷酸的如此部分，其中該部分對靶RNA的部分具有100%互補(bǔ)性。用于產(chǎn)生核酶的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如見美國專利號6,025,167;5,773,260和5,496,698。如本文中所用的術(shù)語"dsRNA"指包含兩條RNA鏈的RNA雜交體。dsRNA可以在結(jié)構(gòu)上是直鏈的或環(huán)狀的。在優(yōu)選的實施方案中，dsRNA對這樣的多核苷酸是特異性的，其中此多核苷酸編碼如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的多肽或編碼與如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。雜交性RNA可以是基本上互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的。"基本上互補(bǔ)，，意指當(dāng)兩種雜交性RNA使用如上所述的BLAST程序進(jìn)行優(yōu)化比對時，雜交部分至少95%互補(bǔ)。優(yōu)選地，dsRNA是至少100個堿基對長度。通常，雜交性RNA具有相同長度，沒有突出的5'端或3'端和空位。然而，在本發(fā)明方法中可以使用具有多達(dá)100個核苷酸的5'突出端或3'突出端的dsRNA。dsRNA可以包含核糖核苷酸或核糖核苷酸類似物如2'-0-甲基核糖基殘基或其組合。例如，見美國專利號4,130,641和4,024,222。在美國專利4,283,393中描述了dsRNA聚核糖次黃苷酸:聚核糖胞苷酸。用于產(chǎn)生并使用dsRNA的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。一種方法包括在體內(nèi)或在單個體外反應(yīng)混合物內(nèi)同時轉(zhuǎn)錄兩條互補(bǔ)性DNA鏈。例如，見美國專利號5,795,715。在一個實施方案中，dsRNA可以通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)直接導(dǎo)入植物或植物細(xì)胞內(nèi)?；蛘?，dsRNA可以通過轉(zhuǎn)錄兩種互補(bǔ)性RNA在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。用于抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的其它方法，如三重螺旋形成法(Moser等，1987，Science238:645-650和Cooney等，1988，Science241:456-459)和共抑制法(Napoli等，19卯，ThePlantCell2:279-289)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。部分長度和全長度cDNA已經(jīng)用于內(nèi)源性植物基因的共抑制。例如，見美國專利號4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184;VanderKroll等，1990,ThePlantCell2:291-299;Smith等，1990,Mol.Gen.Genetics224:477-481和Napoli等，19卯，ThePlantCell2:279-289。對于有義抑制，據(jù)信有義多核苷酸的導(dǎo)入阻斷相應(yīng)單巴基因的轉(zhuǎn)錄。有義多核苷酸具有與植物靼基因或靶RNA至少65%的序列同一性。優(yōu)選地，同一性百分?jǐn)?shù)是至少80%、卯％、95%或更高。導(dǎo)入的有義多核苷酸不需要相對靼基因或轉(zhuǎn)錄物而言是全長的。優(yōu)選地，有義多核苷酸與如表l第3列中提供的任意SEQIDNO的至少100個連續(xù)核苷酸具有至少65%序列同一性。同一性區(qū)域可以包含內(nèi)含子和/或外顯子和非翻譯區(qū)，導(dǎo)入的有義多核苷酸可以短暫地存在于植物細(xì)胞內(nèi)，或可以穩(wěn)定地整合至植物染色體或染色體外復(fù)制子內(nèi)。備選地，MTP基因表達(dá)可以通過耙向與MTP核苷酸序列的調(diào)節(jié)區(qū)(例如MTP啟動子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核苷酸序列，以形成阻止靶細(xì)胞內(nèi)MTP基因轉(zhuǎn)錄的三重螺旋結(jié)構(gòu)而受到抑制。通常，見Helene,C，1991，AnticancerDrugDes.6(6):569-84;Helene，C.等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36和Maher，LJ"1992，Bioassays14(12):807-15。此夕卜，除以上所述的MTP核酸和多肽之夕卜，本發(fā)明包含與部分(moiety)連接的那些核酸和多肽。這些部分包括，但不限于檢測部分、雜交部分、純化部分、送遞部分、反應(yīng)部分、結(jié)合部分等。具有連接的部分的常見核酸類型是探針和引物。探針和引物通常包含基本上分離的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含這樣的核苷酸序列區(qū)域，其中所述的核苷酸序列區(qū)域與如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的有義鏈的至少約12個、優(yōu)選約25個、更優(yōu)選約40、50或75個連續(xù)核苷酸；與如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的反義序列；或其天然存在的突變體在嚴(yán)格條件下雜交。以如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的核苷酸序列為基礎(chǔ)的引物可以用在克隆MTP同系物的PCR反應(yīng)內(nèi)?；贛TP或基因組序列。在優(yōu)選的實施方案中，探針還包含與該探針連接的標(biāo)記基團(tuán)，例如標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔助因子。此類探針可以作為基因組標(biāo)記檢測試劑盒的部分，用于細(xì)胞樣品內(nèi)鑒定表達(dá)MTP的細(xì)胞，如通過測量編碼MTP的核酸的水平，例如檢測MTPmRNA水平或確定基因組MTP基因是否已經(jīng)被突變或缺失。尤其，旨在確定基因轉(zhuǎn)錄水平(可用于翻譯成基因產(chǎn)物的mRNA量的指示)的有用方法是開展RNA印跡(參考文獻(xiàn)見例如，Ausubel等，1988,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)。來自RNA印跡的信息至少部分地展示已轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)錄的程度。細(xì)胞總RNA可以通過本領(lǐng)域內(nèi)均眾所周知的數(shù)種方法，如在Bormann,E.R.等，1992Mol.Microbiol.6:317-326中描述的方法，從細(xì)胞、組織或器官中制備。為評估從這種mRNA中所翻譯蛋白質(zhì)的存在或相對量，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如蛋白質(zhì)印跡。這些技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員眾所周知的(例如見Ausubel等,1988CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)。本發(fā)明還提供包含MTP核酸的分離的重組表達(dá)載體，其中與宿主細(xì)胞的野生型品種相比，該載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致增加的根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性。如本文中所用，術(shù)語"載體"指這樣的核酸分子，其中該核酸分子能夠轉(zhuǎn)運已經(jīng)與其連接的另一種核酸分子。一種類型的載體是"質(zhì)粒"，指額外的DNA節(jié)段可以連接到其內(nèi)的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒栽體，其中額外的DNA節(jié)段可以連接到病毒基因組內(nèi)。某些載體能夠在導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加體性哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加體性哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時整合至宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且因此隨宿主基因組一起被復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與載體有效連接的基因的表達(dá)。此類載體在本文中稱為"表達(dá)載體"。通常，在DNA重組技術(shù)中使用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"栽體"可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用形式的載體。然而，本發(fā)明意圖包含具有等效功能的其它形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含處在適合于核酸在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的形式下的本發(fā)明核酸，這意指重組表達(dá)載體包括基于待用來表達(dá)的宿主細(xì)胞而選擇的一種或多種調(diào)節(jié)序列，其中所述的調(diào)節(jié)序列與待表達(dá)的核酸序列有效連接。如本文中就重組表達(dá)載體而言所用，"有效地連接"意圖表明目的核苷酸序列以(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)內(nèi)或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時在宿主細(xì)胞內(nèi))允許核苷酸序列表達(dá)的方式與調(diào)節(jié)序列連接。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意圖包括啟動子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。此類調(diào)節(jié)序歹'J例如在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)以及Gruber和Crosby在MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,編者Glick和Thompson,第7章，89-108,CRCPress:BocaRaton,Florida(包括其中參考文獻(xiàn))內(nèi)描述。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)核苷酸序列在眾多類型宿主細(xì)胞內(nèi)的組成型表達(dá)的那些調(diào)節(jié)序列和指導(dǎo)核苷酸序列僅在某些宿主細(xì)胞內(nèi)或在某些條件下表達(dá)的那些調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解表達(dá)載體的設(shè)計取決于此類因素，如選擇待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、所需要多肽的表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以便因而產(chǎn)生通過如本文中所述核酸編碼的多肽或肽，包括融合多肽或融合肽(例如MTP、MTP的突變形式、融合多肽等)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以設(shè)計用于在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)MTP。例如，MTP基因可以在細(xì)菌細(xì)胞如谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或其它真菌細(xì)胞(Romanos,M.A.等,1992,Foreigngeneexpressioninyeast:areview,Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M.J.J.等，1991，Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi在MoreGeneManipulationsinFungi,編者J.W.Bennet和L丄.Lasure，第396-428頁AcademicPress:SanDiego以及vandenHondel，C.A,M.J.J.和Punt,P.J.，1991，GeneTransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi在AppliedMolecularGeneticsofFungi,編者Peberdy，J.F.等，第1-28，CambridgeUniversityPress:Cambridge)、藻類(Falciatore等，1999，MarineBiotechnology1(3):239-251)、如下類型的纖毛蟲全毛亞綱(Holotrichia)、緣毛亞綱(Peritrichia)、旋毛亞綱(Spirotrichia)、吸管亞綱(Suctoria)、四膜蟲、草履蟲屬(Paramecium)、豆形蟲屬(Colpidium)、瞬目蟲屬(Glaucoma)、匙口蟲屬(Platyophrya)、Potomacus、偽康纖蟲屬(Pseudocohnilembus)、游仆蟲屬(Euplotes)、Engelmaniella、尾棘蟲屬(Stylonychia)，其中尤其用載體按照如PCT申請?zhí)朩O98/01572中所述的轉(zhuǎn)化方法在浮萍棘尾蟲(Stylonychialemnae)內(nèi)，以及在多細(xì)胞植物的細(xì)胞(見Schmidt,R.和Willmitzer，L.,1988，Highefficiency々/Y^a"m.w附mediatedtransformationofJ/Yi嵐o/wis幼a/Z"waleafandcotyledonexplants，PlantCellRep.583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton,Florida，第6/7章，S.71-119(1993);F.F.White,B,Jenes等，TechniquesforGeneTransfer，在TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,編者Kung和R.Wu，128-43，AcademicPress:1993;Potrykus,1991，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42:205-225及其中引用的參考文獻(xiàn))或哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(19卯)內(nèi)進(jìn)一步討論。備選地，重組表達(dá)載體可以在體外被轉(zhuǎn)錄并翻譯，例如使用T7-啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。在原核生物中多肽的表達(dá)最經(jīng)常用含有指導(dǎo)融合多肽或非融合多肽表達(dá)的組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子的載體實施。融合載體將多個氨基酸添加至編碼于該載體內(nèi)的多肽中，通常添加至重組多肽的氨基末端，也可添加至其M末端，或融合于多肽中的合適區(qū)域內(nèi)。此類融合載體通常達(dá)到三種目的l)旨在增加重組多肽的表達(dá)；2)旨在增加重組多肽的可溶性并且3)旨在通過起到親和純化中的配體作用而輔助重組多肽的純化。經(jīng)常在融合表達(dá)載體中將蛋白酶剪切位點導(dǎo)入至融合部分與重組多肽的接合處，以便在融合多肽的純化后，能夠使重組多肽與融合部分分開。此類酶以及它們的天然識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。常見的融合表達(dá)載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.，1988，Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合多肽或多肽A與靶重組多肽融合。在一個實施方案中，將MTP的編碼序列克隆至pGEX表達(dá)載體以產(chǎn)生編碼融合多肽的載體，其中所述的融合多肽從氨基末端至羧基末端包含GST-凝血酶切割位點-X多肽。融合多肽可以使用谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂通過親和層析法純化。不與GST融合的重組MTP可以通過用凝血酶切割融合多肽而加以回收。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實例是pTrc[Amann等，(1988)Gene69:301-315]和pETlld(Studier等，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(1990)60-89)。來自pTrc載體的靼基因表達(dá)依賴于從雜合trp-lac融合啟動子內(nèi)的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。來自pETlld載體的耙基因表達(dá)依賴于通過共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)，從T7gnl0-lac融合啟動子的轉(zhuǎn)錄。這種病毒聚合酶由宿主菌林BL21(DE3)或HMS174(DE3)從定居原噬菌體中提供，其中所述的定居原噬菌體攜帶在lacUV5啟動子的轉(zhuǎn)錄性控制下的T7gnl基因。一種旨在使重組多肽表達(dá)最大化的策略是4吏多肽在如此的宿主細(xì)菌內(nèi)表達(dá)，其中該宿主細(xì)菌的蛋白水解性切割重組多肽的能力受損(Gottesman，S.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(19卯)119-128)。另一種策略是改變待插入表達(dá)栽體內(nèi)的核酸序列以至用于每個氬基酸的單個密碼子均是在選擇用來表達(dá)的細(xì)菌如谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)得以偏好性利用的那些密碼子(Wada等，1992,NucleicacidsRes.20:2111-2118)。本發(fā)明核酸序列的這種改變可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)實施。在另一個實施方案中，MTP表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。用于在釀酒酵母(S.ce"v/wV^)內(nèi)表達(dá)的載體的實例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(SchuItz等，(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego，CA)。用于構(gòu)建適用于其它真菌(如絲狀真菌)內(nèi)的載體和方法包括在vandenHondel，C.A.M.J.J.和Punt,P.J.(1991)"GeneTransfersystemandvectordevelopmentforfilamentousfungi，，在AppliedMolecularGeneticsofFungi,編者J.F.Peberdy等，第1-28頁，CambridgeUniversityPress:Cambridge內(nèi)詳述的那些載體和方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，MTP在植物和植物細(xì)胞如單細(xì)胞植物的細(xì)胞(例如藻類)(見Fakiatore等,1999,MarineBiotechnology1(3):239-251及其中參考文獻(xiàn))和來自高等植物的植物細(xì)胞(例如種子植物，如作物植物)內(nèi)表達(dá)。MTP可以通過任何方法"導(dǎo)入，，植物細(xì)胞內(nèi)，其中所述的方法包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔、粒子轟擊、農(nóng)桿菌感染法等。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的一種轉(zhuǎn)化方法是將正在開花的植物浸入農(nóng)桿菌溶液，其中農(nóng)桿菌含有MTP核酸，隨后對轉(zhuǎn)化的配子育種。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(包括植物細(xì)胞)的其它合適方法可以在Sambrook,等，MolecularCloning:ALaboratoryManual.第二版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989和其它實驗手冊如MethodsinMolecularBiology,1995，Gartland和Davey編輯的第44巻，々尸o6a"m.M附Protocols,HumanaPress,Totowa，NewJersey中找到。由于增力口的生長和/或生物性脅迫耐受性及非生物性脅迫耐受性是希望被遺傳到多種植物如玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉花、歐洲油菜和卡諾拉油菜、木薯(manihot)、辣椒(pepper)、向日葵和萬壽菊、茄科植物如馬鈴薯、煙草、茄子(eggplant)和番茄(tomato)、野豌豆屬(Vicia)物種、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡(coffee)、可可(cacao)、茶(tea))、柳屬(Salix)物種、樹(油棕櫚(oilpalm)、椰子(coconut))、多年生禾草和伺料作物內(nèi)的常見性狀，因此這些作物植物也是作為本發(fā)明又一個實施方案的優(yōu)選用于遺傳工程的靶植物。飼料作物包括但不限于小麥草(Wheat-grass)、篛草(Canarygrass)、雀麥草(Bromegrass)、披堿草(WildryeGrass)、早熟禾(Bluegrass)、鴨茅(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百脈根(BirdsfootTrefoil)、雜三葉(Alsikeclover)、紅三葉(redclover)和草木樨(Sweetclover)。在本發(fā)明的一個實施方案中，MTP至植物內(nèi)的轉(zhuǎn)染通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)性基因轉(zhuǎn)移得以實現(xiàn)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)性植物轉(zhuǎn)化可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383畫396)或LBA4404(Clontech)才艮瘤農(nóng)桿菌(^4gn^flf"n7iiw似附e/"de朋)菌林。轉(zhuǎn)化可以通過標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化及再生技術(shù)開展(Deblaere等，1994，Nucl.Acids.Res.13:4777-4788;Gelvin,StantonB.和Schilperoort，RobertA,PlantMolecularBiologyManual,第二版-Dordrecht:KluwerAcademicPubl"1995.—在部分RingbucZentraleSignatur:BT11-PISBN0-7923-2731-4;Glick,BernardR.;Thompson,JohnE.，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,BocaRaton:CRCPress,1993360S.，ISBN0-8493-5164-2)。例如，歐洲油菜可以通過子葉或下胚軸轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Moloney等，1989，PlantcellReport8:238-242;DeBlock等，1989，PlantPhysiol.91:694-701)。用于農(nóng)桿菌和植物選擇的抗生素取決于用于轉(zhuǎn)化的二元載體和農(nóng)桿菌。歐洲油菜的選擇通常使用卡那霉素作為可選擇的植物標(biāo)志而開展。農(nóng)桿菌介導(dǎo)至亞麻(flax)內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移可以使用例如由Mlynarova等，1994，PlantCellReport13:282-285描述的技術(shù)開展。此外，大豆的轉(zhuǎn)化可以使用如歐洲專利號0424047、美國專利號5,322,783、歐洲專利號0397687、美國專利號5,376,543或美國專利號5,169,770中所述的技術(shù)實施。玉米的轉(zhuǎn)化可以通過粒子轟擊、聚乙二醇介導(dǎo)的DNA攝取或通過碳化珪纖維法技術(shù)(見，例如Freeling和Walbot"Themaizehandbook"SpringerVerlag:NewYork(1993)ISBN3-540-97826-7)完成。玉米轉(zhuǎn)化的具體實例存在于美國專利號5,990,387內(nèi)，并且小麥轉(zhuǎn)化的具體實例可以在PCT申請?zhí)朩O93/07256內(nèi)找到。根據(jù)本發(fā)明，導(dǎo)入的MTP如果并入非染色體性自主復(fù)制子內(nèi)或整合至植物染色體內(nèi)，則可以在植物細(xì)胞內(nèi)得以穩(wěn)定維持?；蛘?，導(dǎo)入的MTP可以存在于染色體外的非復(fù)制型載體內(nèi)并且可以得到瞬時表達(dá)或具有瞬時活性。在一個實施方案中，可以產(chǎn)生其中MTP整合至染色體內(nèi)的同源重組微生物，制備了含有MTP基因的至少部分的載體，其中向所述的部分中已經(jīng)導(dǎo)入缺失、添加或置換以便因而改變(例如功能性地破壞)MTP基因。優(yōu)選地，MTP基因是如表1內(nèi)所提供的任意MTP基因，但是它可以是來自相關(guān)植物或酵母的同系物，或甚至是來自哺乳動物或昆蟲來源的同系物。在一個實施方案中，設(shè)計了載體以至在同源重組時，內(nèi)源性MTP基因被功能性地破壞(即不再編碼功能性多肽；也稱作敲除載體)。或者，可以設(shè)計載體以至于在同源重組時，內(nèi)源性MTP基因受到突變或改變，但仍編碼功能性多肽(如上游調(diào)節(jié)區(qū)可以受到改變，因而改變內(nèi)源性MTP的表達(dá))。為了通過同源重組產(chǎn)生點突變，可以在稱作嵌合修復(fù)法的技術(shù)中使用DNA誦RNA雜交體(Cole-Strauss等,1999，NucleicacidsResearch27(5):1323-1330和Kmiec，1999GenetherapyAmericanScientist.87(3):240-247)。例如，在鼠耳芥內(nèi)的同源重組方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的并且考慮用于本文中。當(dāng)位于同源重組載體內(nèi)時，MTP基因中改變的部分在其5'端和3'端側(cè)翼分布有MTP基因的額外核酸分子，以允許同源重組在孩支生物或植物內(nèi)在載體所攜帶的外源性MTP基因與內(nèi)源性MTP基因之間發(fā)生。這種側(cè)翼分布的額外MTP核酸分子具有足夠用于與內(nèi)源性基因發(fā)生同源重組的長度。一般，栽體內(nèi)包括(在5'端和3'端的)數(shù)百堿基對至多到數(shù)千堿基的側(cè)翼DNA(見例如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.，1987，Cell51:503對同源重組載體的描述)。載體導(dǎo)入微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞(例如通過聚乙二醇介導(dǎo)的DNA)，并且使用本領(lǐng)域已知技術(shù)選擇其中導(dǎo)入的MTP基因已經(jīng)與內(nèi)源性MTP基因發(fā)生同源重組的細(xì)胞。在另一個實施方案中，可以產(chǎn)生這樣的重組微生物，其中該重組微生物含有允許受調(diào)節(jié)地表達(dá)導(dǎo)入基因的系統(tǒng)。例如，在將MTP基因置于lac達(dá)。此類調(diào)節(jié)系統(tǒng)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。無論是在染色體外的非復(fù)制型載體內(nèi)或在整合至染色體內(nèi)的載體中存在，MTP多核苷酸優(yōu)選地位于植物表達(dá)盒內(nèi)。植物表達(dá)盒優(yōu)選地含有能夠驅(qū)動植物細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，其中所述的調(diào)節(jié)序列是有效連接的，以至于每一序列可以實現(xiàn)它的功能，如通過聚腺苷酸化信號終止轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選的聚腺苷酸化信號是源自根瘤農(nóng)桿菌t-DNA如Ti質(zhì)粒pTiACH5中作為章魚堿合酶的基因3(Gielen等，1984，EMBOJ.3:835)中那些聚腺苷酸化信號或其功能等效物，在植物內(nèi)有功能性活性的全部其它終止子也是適合的。由于植物基因表達(dá)很少受限于轉(zhuǎn)錄水平，因而植物表達(dá)盒優(yōu)選地包含其它有效連接的序列，如翻譯增強(qiáng)子，如含有來自煙草花葉病毒5，非翻譯前導(dǎo)序列的增強(qiáng)RNA與多肽比率的過量驅(qū)動序列(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。植物表達(dá)載體的實例包括那些在Becker,D.，Kemper，E。,Schell,J.和Masterson,R.1992，Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder,PlantMol.Biol.20:1195-1197和Bevan，M.W.，1984，BinaryXgro6acteW"附vectorsforplanttransformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants在TransgenicPlants,第一巻,EngineeringandUtilization,編者Kung和R.Wu，AcademicPress,1993,S.15-38中詳述的植物表達(dá)載體。植物基因表達(dá)應(yīng)當(dāng)有效地與以時間、細(xì)胞或組織特異性方式引^因表達(dá)的適宜啟動子連接。用于本發(fā)明表達(dá)盒內(nèi)的啟動子包括能夠在植物細(xì)胞內(nèi)啟動轉(zhuǎn)錄的任意啟動子。此類啟動子包括，但不限于可以從植物、植物病毒或含有在植物內(nèi)表達(dá)的基因的細(xì)菌(如農(nóng)桿菌和根瘤菌(及/^M/"m))中獲得的那些啟動子。啟動子可以是組成型、誘導(dǎo)型、發(fā)育期優(yōu)選性、細(xì)胞類型優(yōu)選性、組織優(yōu)選性、或器官優(yōu)選性啟動子。組成型啟動子在大部分條件下是活躍的。組成型啟動子的實例包括CaMV19S和35S啟動子(Oddl等，1985，Nature313:810-812)、sXCaMV35S啟動子(Kay等，1987，Science236:1299-1302)、Sepl啟動子、稻肌動蛋白啟動子(McElroy等，1990，PlantCell2:163-171)、擬南芥肌動蛋白啟動子、遍在蛋白啟動子(Christensen等，1989，PlantMolec.Biol.18:675-689)、pEmu(Last等，1991，Theor.Appl.Genet.81:581-588)、玄參(figwort)花葉病毒35S啟動子、Smas啟動子(Velten等，1984，EMBOJ3:2723-2730)、超級啟動子(美國專利號5,955,646)、GRP1-8啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利號5,683,439)、來自農(nóng)桿菌T-DNA內(nèi)如甘露氨酸合酶、胭脂堿合酶和章魚堿合酶的啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(ssuRUBISCO)啟動子等。誘導(dǎo)型啟動子在某些環(huán)境條件下(如營養(yǎng)素或代謝物的存在或缺乏、熱或寒冷、光、病原體侵襲、厭氧條件等)偏好性地具有活性。例如，來自蕓苔屬hsp80啟動子受熱休克誘導(dǎo)；PPDK啟動子受光誘導(dǎo)；來自煙草、擬南芥和玉米的PR-1啟動子受病原體感染誘導(dǎo)；并且Adhl啟動子受低氧脅迫和寒冷脅迫誘導(dǎo)。植物基因表達(dá)也可以通過誘導(dǎo)型啟動子促進(jìn)(綜述，見Gatz，1997,Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)。當(dāng)需要基因表達(dá)以時間特異性方式出現(xiàn)時，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子尤其適合。此類啟動子的實例是水楊酸誘導(dǎo)型啟動子(PCT申請?zhí)朩O95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(Gatz等，1992，PlantJ.2:397-404)和乙醇誘導(dǎo)型啟動子(PCT申請?zhí)朩O93/21334)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子A^迫誘導(dǎo)型啟動子。為本發(fā)明的目的，脅迫誘導(dǎo)型啟動子在如下的一種或多種脅迫下偏好性地有活性與鹽度脅迫、干旱脅迫、溫度脅迫、金屬脅迫、化學(xué)品脅迫、病原體脅迫和氧化脅迫有關(guān)的次優(yōu)條件。脅迫誘導(dǎo)型啟動子包括，但不限Cor78(Chak等，2000，Planta210:875-883;Hovath等，1993，PlantPhysiol.103:1047-1053)、Corl5a(Artus等，1996，PNAS93(23):13404-09)、Rci2A(Medina等，2001，PlantPhysiol.125:1655-66;Nylander等，2001，PlantMol.Biol.45:341-52;Navarre和Goffeau，2000,EMBOJ.19:2515-24;Capel等，1997，PlantPhysiol.115:569-76)、Rd22(Xiong等，2001，PlantCell13:2063-83;Abe等，1997，PlantCell9:1859-68;Iwasaki等，1995，Mol.Gen.Genet.247:391-8)、cDet6(Lang和Palve,1992，PlantMol.Biol.20:951-62)、ADH1(Hoeren等，1998，Genetics149:479-90)、KATl(Nakamura等，1995，PlantPhysiol.109:371-4)、KSTl(Mtiller誦R6ber等，1995，EMBO14:2409-16)、Rhal(Terryn等，1993，PlantCell5:1761-9;Terryn等，1992，F(xiàn)EBSLett.299(3):287-卯)、ARSK1(Atkinson等，1997，GenBank登錄號L22302和PCT申請?zhí)朩O97/20057)、PtxA(Plesch等，GenBank登錄號X67427)、SbHRGP3(Ahn等，1996，PlantCell8:1477-卯)、GH3(Liu等，1994，PlantCell6:645-57)、病原體誘導(dǎo)型PRP1基因啟動子(Ward等，1993，Plant.Mol.Biol.22:361-366)、來自番癡的熱誘導(dǎo)型hsp80啟動子(美國專利號5187267)、來自馬鈴薯的寒冷誘導(dǎo)型a-淀粉酶啟動子(PCT申請?zhí)朩O96/12814)或傷口誘導(dǎo)型pinll啟動子(歐洲專利號375091)。對于干旱誘導(dǎo)型啟動子、寒冷誘導(dǎo)型啟動子和鹽誘導(dǎo)型啟動子的其它實例如RD29A啟動子，見Yamaguchi-Shinozalei等，1993，Mol.Gen.Genet.236:331-340。發(fā)育期優(yōu)選啟動子偏好性地在某些發(fā)育期內(nèi)表達(dá)。組織優(yōu)選啟動子和器官優(yōu)選啟動子包括偏好性在某些組織或器官如葉、根、種子或木質(zhì)部內(nèi)表達(dá)的那些啟動子。組織優(yōu)選性啟動子和器官優(yōu)選性啟動子的實例包括，但不限于果實優(yōu)選性啟動子、胚珠優(yōu)選性啟動子、雄性組織優(yōu)選性啟動子、種子優(yōu)選性啟動子、珠被優(yōu)選性啟動子、塊莖優(yōu)選性啟動子、柄優(yōu)選性啟動子、果皮優(yōu)選性和葉優(yōu)選性啟動子、柱頭優(yōu)選性啟動子、花粉優(yōu)選性啟動子、花藥優(yōu)選性啟動子、花瓣優(yōu)選性啟動子、萼片優(yōu)選性啟動子、花梗優(yōu)選性啟動子、長角果優(yōu)選性啟動子、莖優(yōu)選性啟動子、根優(yōu)選性啟動子等。種子優(yōu)選性啟動子偏好性地在種子發(fā)育或萌發(fā)期間表達(dá)。例如，種子優(yōu)選性啟動子可以是胚優(yōu)選性啟動子、胚乳優(yōu)選性啟動子和種皮優(yōu)選性啟動子。見Thompson等，1989,BioEssays10:108。種子優(yōu)選性啟動子的實例包括，但不限于纖維素合酶(ceIA)、Ciml、，玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19Bl)等。其它合適的組織優(yōu)選啟動子或器官優(yōu)選啟動子包括來自歐洲油菜的油菜籽蛋白基因啟動子(美國專利號5,608,152)、來自蠶豆(Viciafaba)的USP啟動子(Baeumlein等，1991，Mol.Gen.Genet.225(3):459-67)、來自擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動子(PCT申請?zhí)朩O98/45461)、菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白啟動子(美國專利號5，504，200)、來自蕓苔屬的Bce4啟動子(PCT申請?zhí)朩O91/13980)或豆科植物B4啟動子(LeB4;Baeumlein等，1992，PlantJournal，2(2):233-9)以及在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等內(nèi)賦予種子特異性表達(dá)的啟動子。待提到的合適啟動子是來自大麥的lpt2或lptl基因啟動子(PCT申請?zhí)朩O95/15389和PCT申請?zhí)朩O95/23230)或在PCT申請?zhí)朩O99/16890內(nèi)描述的那些啟動子(來自大麥的大麥醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麥的麥醇溶蛋白基因、小麥的谷蛋白基因、燕麥的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和黑麥的棵麥醇溶蛋白基因內(nèi)的啟動子)。用于本發(fā)明表達(dá)盒內(nèi)的其它啟動子包括，但不限于主要葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動子、組蛋白啟動子、Ap3啟動子、p-伴大豆球蛋白啟動子、油菜籽蛋白啟動子、大豆凝集素啟動子、玉米15kD玉米醇溶蛋白啟動子、22kD玉米醇溶蛋白啟動子、27kD玉米醇溶蛋白啟動子、^玉米醇溶蛋白啟動子、蠟質(zhì)、Shrunkenl、Shrunken2和bronze啟動子、Zml3啟動子(美國專利號5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶啟動子(PG)(美國專利號5,412,085和5，545，546)和SGB6啟動子(美國專利號5,470,359)以及合成性啟動子或其它的天然啟動子。植物內(nèi)控制異源性基因表達(dá)的額外靈活性可以通過使用來自異質(zhì)來源的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和應(yīng)答元件(即來自非植物來源的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)而得到。此種異源性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實例是LexADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Brent和Ptashne，1985，Cell43:729-736)。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的MTPDNA分子的重組表達(dá)載體，其中所述的MTPDNA分子以反義方向克隆至該表達(dá)載體內(nèi)。也就是說，該DNA分子以如此方式與調(diào)節(jié)序列有效連接，其中所述的方式允許(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)對MTPmRNA為反義的RNA分子表達(dá)。可以選擇與在反義方向上克隆的核酸分子有效連接的指導(dǎo)反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中持續(xù)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。例如，可以選擇指導(dǎo)反義RNA組成型表達(dá)、組織特異性表達(dá)或細(xì)胞類型特異性表達(dá)的病毒啟動子和/或增強(qiáng)子或調(diào)節(jié)序列。反義表達(dá)載體可以是其中在高效調(diào)節(jié)區(qū)域控制下產(chǎn)生反義核酸的重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒形式。調(diào)節(jié)區(qū)域的活性可以通過向其中導(dǎo)入載體的細(xì)胞類型加以測定。對于使用反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的討論，見Weintraub，H.等，1986，AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,Reviews畫TrendsinGenetics,第一巻(l)和Mol等，19卯,FEBSLetters268:427-430。本發(fā)明的另一方面涉及向其中已導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語"宿主細(xì)胞"和"重組的宿主細(xì)胞"在本文中可交換使用。應(yīng)當(dāng)理解此類術(shù)語不僅指特定的主題細(xì)胞，它們還適用于此類細(xì)胞的子代或有活力的子代。因為某些修飾可以在后續(xù)世代內(nèi)因突變或環(huán)境影響而出現(xiàn)，故此類子代實際上可能與親代細(xì)胞不完全相同，但是仍包含在如本文中所用的術(shù)語的范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可以是任何的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。例如，MTP可以在細(xì)菌細(xì)胞如谷氨酸棒狀桿菌、酵母、大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)、藻類、纖毛蟲、植物細(xì)胞、真菌或其它微生物如谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)表達(dá)。其它合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的宿主細(xì)胞如培養(yǎng)的原核宿主細(xì)胞或真核宿主細(xì)胞可以用來產(chǎn)生(即表達(dá))MTP。因此，本發(fā)明還提供用于使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生MTP的方法。在一個實施方案中，此方法包括在合適培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(已經(jīng)向其中導(dǎo)入編碼MTP的重組表達(dá)載體或其中基因組內(nèi)已經(jīng)導(dǎo)入編碼野生型MTP或變異MTP的基因)直至產(chǎn)生MTP。在另一個實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離MTP。本發(fā)明的另一方面涉及分離的MTP及其生物活性部分。"分離的"或"純化的"多肽或其生物活性部分在通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時，基本不含某些細(xì)胞性材料，或通過化學(xué)合成時，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。語詞"基本上不含細(xì)胞性材料"包括這樣的MTP制品，在該MTP制品中多肽與從其中天然或重組地產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞的某些細(xì)胞成分是分開的。在一個實施方案中，語詞"基本不含細(xì)胞材料"包括這樣的MTP制品，該MTP制品具有小于約30%(千重)的非MTP材料(本文中也稱作"雜質(zhì)多肽，，)、更優(yōu)選地小于約20%的非MTP材料、仍更優(yōu)選地小于約10%的非MTP材料并且最優(yōu)選地小于約5%的非MTP材料。本文中所述的核酸分子、多肽、多肽同系物、融合多肽、引物、載體和宿主細(xì)胞可以用在一種或多種如下方法中鑒定如表1第2列內(nèi)所提供的任意生物及相關(guān)生物；與如表1第2列內(nèi)所提供任意生物相關(guān)的生物的基因組作圖；鑒定和定位如表1第2列內(nèi)所提供的任意生物的目的序列；演化研究；確定功能所需要的MTP區(qū)域；調(diào)節(jié)MTP活性；調(diào)節(jié)一種或多種細(xì)胞功能的代謝；調(diào)節(jié)一種或多種化合物的跨膜轉(zhuǎn)運；調(diào)節(jié)脅迫抗性以及調(diào)節(jié)MTP核酸的表達(dá)。在這些方法的一個實施方案中，MTP作為膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用。本發(fā)明的MTP核酸分子具有多種用途。最重要的是本發(fā)明的核酸和M酸序列可以用來轉(zhuǎn)化植物，特別是作物植物，因而導(dǎo)入對脅迫如干旱、高鹽度和寒冷的耐受性。本發(fā)明因此提供由MTP核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其中與植物的野生類型品種相比，核酸序列在植物內(nèi)的表達(dá)引起增加的根生長和/或環(huán)境脅迫耐受性。轉(zhuǎn)基因植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物可以例如選自玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、黍、甘蔗、大豆、花生、棉花、歐洲油菜、卡諾拉油菜、木薯、辣椒、向日葵、萬壽菊、茄科植物、馬鈴薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬植物、油棕櫚、椰子、多年生禾草和飼料作物。尤其，本發(fā)明描述使用編碼MTP的核酸的表達(dá)以改造具有增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量或耐干旱、耐鹽和/或耐寒冷的植物。這種策略已經(jīng)使用AtAGRl(SEQIDNO:l)在鼠耳芥和玉米內(nèi)得到證實，但是該策略的應(yīng)用不限于該種基因或這些植物。因此，本發(fā)明提供含有如在表1第4列內(nèi)提供的任意SEQIDNO內(nèi)定義的MTP的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中植物具有增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性，其中所述的環(huán)境脅迫選自干旱、增加的鹽、減少或增加的溫度中的一種或多種。在優(yōu)選的實施方案中，環(huán)境脅迫是干旱，在其它的優(yōu)選實施方案中，增加的根生長是根長度的增加，優(yōu)選地是在水限制性條件下根長度的增加。本發(fā)明還提供產(chǎn)生含有編碼MTP的核酸的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中與植物的野生類型品種相比，核酸在植物內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性，所述方法包括(a)將包含MTP核酸的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，并(b)從該植物細(xì)胞中產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因植物，其與植物的野生類型品種相比，具有增加的才艮生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性。植物細(xì)胞包括，但不限于原生質(zhì)體、產(chǎn)生配子的細(xì)胞以及再生成完整植物的細(xì)胞。如本文中所用，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因的，，指含有至少一種重組多核苷酸的全部或部分的任意植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、植物組織或植物部分。在很多情況下，重組多核苷酸的全部或部分穩(wěn)定地整合到染色體內(nèi)或整合到穩(wěn)定的染色體外元件內(nèi)，以至于將它傳遞到后續(xù)世代內(nèi)。在優(yōu)選的實施方案中，MTP核酸編碼包含如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的多肽的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性的方法，包括調(diào)節(jié)編碼MTP的核酸在植物內(nèi)的表達(dá)。植物的根生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性可以如所實現(xiàn)的那樣，分別通過增加或減少MTP的表達(dá)而增加或減少。優(yōu)選地，；f艮生長和/或產(chǎn)量和/或環(huán)境脅迫耐受性因增加MTP的表達(dá)而增加。MTP的表達(dá)可以通過本領(lǐng)域^支術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行調(diào)節(jié)?？梢允褂迷黾覯TP表達(dá)的方法，其中植物是轉(zhuǎn)基因植物或非轉(zhuǎn)基因植物。在當(dāng)植物是轉(zhuǎn)基因植物時的情況下，植物例如可以用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中所述的載體含有任意如上所述的編碼MTP的核酸，或植物可以用啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中所述的啟動子指導(dǎo)天然MTP在植物內(nèi)的表達(dá)。本發(fā)明提供此種啟動子可以是組織優(yōu)選性啟動子、發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動子、脅迫誘導(dǎo)性啟動子或其組合?；蛘?，非轉(zhuǎn)基因植物可以具有通過誘導(dǎo)天然啟動子進(jìn)行調(diào)節(jié)的天然MTP表達(dá)。如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所定義的MTP在靶植物內(nèi)的表達(dá)可以通過，但不限于如下實例之一得以實現(xiàn)(a)組成型啟動子、(b)脅迫誘導(dǎo)型啟動子、(c)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子和(d)工程化啟動子過量表達(dá)，例如用例如鋅指衍生性轉(zhuǎn)錄因子(Greisman和Pabo，1997，Science275:657)。在優(yōu)選的實施方案中，MTP的轉(zhuǎn)錄使用如Greisman和Pabo，1997，Science275:657內(nèi)所述并由SangamoBiosciences,Inc.制造的鋅指矛汙生't生轉(zhuǎn)錄因子(ZFP)進(jìn)行調(diào)節(jié)。這些ZFP包含DNA識別結(jié)構(gòu)域和引起單巴核酸如MTP核酸激活或阻遏的功能性結(jié)構(gòu)域。因此，可以產(chǎn)生這樣的激活性ZFP及阻遏性ZFP,其中所述的ZFP特異性地識別以上所述的MTP啟動子并且用來增加或減少植物內(nèi)的MTP表達(dá)，因而調(diào)節(jié)植物的產(chǎn)量和/或脅迫耐受性。本發(fā)明還包括鑒定靼植物內(nèi)如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所定義的編碼MTP的核酸的同系物，以及此同系物的啟動子。本發(fā)明還提供與宿主細(xì)胞的野生型品種相比，增加目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，其中目的基因應(yīng)答于MTP而被轉(zhuǎn)錄，所述方法包括(a)以包含編碼MTP的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，(b)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)MTP，因而與宿主細(xì)胞的野生型品種相比，增加應(yīng)答于MTP而轉(zhuǎn)錄的基因的表達(dá)。除導(dǎo)入MTP核^列至轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)之外，這些序列還可以用來鑒定生物，如表l第2列內(nèi)提供的任意生物，或其近親。此外，這些序列可以用來鑒定如表l第2列內(nèi)提供的任意生物或其親屬在生物混合群體內(nèi)的存在。本發(fā)明涉及來自如表1第2列內(nèi)提供的任意生物中的眾多基因的核酸序列；通過以如此探針在嚴(yán)格條件下探測單一生物群體或混合生物群體的培養(yǎng)物的提取的基因組DNA，可以確定該種生物是否存在，其中所述的探針覆蓋對表l的相應(yīng)生物而言為獨特的特定基因的區(qū)域。此外，本發(fā)明的核酸分子和多肽分子可以充當(dāng)對基因組特定區(qū)域的標(biāo)記。這不僅用于基因組作圖，而且也用于此基因組所編碼的多肽的功能性研究中。例如為鑒定基因組內(nèi)與特定生物的DNA結(jié)合性多肽結(jié)合的區(qū)域，生物的基因組被消化，并且將片段與這種DNA結(jié)合性多肽溫育。結(jié)合該外地檢測。這種核酸分子對基因組片段的結(jié)合能夠使該片段定位于此種生物的基因組圖內(nèi)，并且當(dāng)用不同酶多次實施時，有助于迅速確定結(jié)合該多肽的核酸序列。此外，本發(fā)明的核酸分子可以與相關(guān)物種的序列充分相同，以至于這些核酸分子可以充當(dāng)標(biāo)記用于在相關(guān)植物內(nèi)構(gòu)建基因組圖。本發(fā)明的MTP核酸分子還用于進(jìn)化研究和多肽結(jié)構(gòu)研究。其中涉及本發(fā)明分子的膜轉(zhuǎn)運過程可以由類型廣泛的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞利用；通序列，可以評估生物的進(jìn)化相關(guān)性。類似地，此種比較允許評估序列的哪些區(qū)域保守和哪些區(qū)域不保守，這可能有助于確定多肽內(nèi)對酶功能是必需的那些區(qū)域。這種類型的確定對于多肽工程研究是極有價值的，并且可以提供多肽可以耐受何種誘變而不喪失功能的線索。操作本發(fā)明的MTP核酸分子可以導(dǎo)致產(chǎn)生具有不同于野生型MTP的功能性差異的MTP。這些多肽可以在效率或活性方面得到改良，可以在細(xì)胞中以高于細(xì)胞內(nèi)通常具有的量存在，或可以在效率或活性方面降低。存在借此對本發(fā)明MTP的改變可以直接影響根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫應(yīng)答和/或脅迫耐受性的眾多機(jī)制。在表達(dá)MTP如AGR1的植物的例子中，AGR1除了在根伸長區(qū)的皮層細(xì)胞和表皮細(xì)胞中作為生長素外流載體蛋白發(fā)揮作用之外，還在其它細(xì)胞內(nèi)作為生長素外流載體蛋白發(fā)揮作用，因而尤其改善根內(nèi)的生長素運輸效率，引起根長度的增加和植物改善的水利用效率。植物、谷氨酸棒狀桿菌、真菌、藻類或纖毛蟲內(nèi)的遺傳修飾對根生長和/或脅迫耐受性的影響可以通過在劣于適宜的環(huán)境下培育改良的微生物或植物并隨后分析植物的生長特征和/或代謝而進(jìn)行評估。此類分析技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并包括干重、濕重、多肽合成、糖類合成、脂類合成、蒸發(fā)蒸騰速率、總體植物和/或作物產(chǎn)量、開花、繁殖、結(jié)種、根生長、呼吸速率、光合作用速率等(ApplicationsofHPLCinBiochemistryin:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,第17巻；Rehm等，1993Biotechnology,第3巻，第三章Productrecoveryandpurification,第469-714頁，VCH:Weinheim;Belter,P.A.等，1988，Bioseparations:downstreamprocessingforbiotechnology,JohnWileyandSons;Kennedy,J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，Recoveryprocessesforbiologicalmaterials,JohnWileyandSons;Shaeiwitz,J.A.和Henry,J.D.,1988,Biochemsicalseparations,在Ulmann'sEncyclopediaofIndustrialChemistry中，第B3巻，第11章，第1-27頁，VCH:Weinheim;和Dechow，F(xiàn).J.,1989，Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology,NoyesPublications)。例如，包含本文中公開的核酸或其片段的酵母表達(dá)載體可以加以構(gòu)建并使用標(biāo)準(zhǔn)方案轉(zhuǎn)化至釀酒酵母內(nèi)。得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞隨后可以就喪失或改變其增加的生長及對干旱脅迫、鹽脅迫和溫度脅迫增加的耐受性進(jìn)行分析。類似地，包含本文中公開的核酸或其片段的植物表達(dá)載體可以加以構(gòu)建并使用標(biāo)準(zhǔn)方案轉(zhuǎn)化至適宜的植物細(xì)胞，如擬南芥、大豆、油菜、玉米、小麥、蒺藜苜蓿等。得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和/或衍生自其中的植物隨后可以就喪失或改變其增加的生長及對干旱脅迫、鹽脅迫和溫度脅迫增加的耐受性進(jìn)行分析。此外，本文中公開的序列或其片段可以用來在多種生物如細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞的基因組內(nèi)產(chǎn)生敲除突變(Girke，T.，1998，ThePlantJournal15:39-48)。得到的敲除細(xì)胞隨后可以就其耐受多種脅迫條件的能力或潛能、它們對多種脅迫條件的應(yīng)答以及突變對表型和/或基因型的影響進(jìn)行評估。用于基因失活的其它方法，見美國專利號6,004,804"Non國ChimericMutationalVectors"和Puttaraju等，1999，Spliceosome-mediatedRNAtrans-splicingasatoolforgenetherapy,NatureBiotechnology17:246-252。前述對于MTP所提及增加的根生長和/或產(chǎn)量和/或脅迫耐受性的誘變策略不意圖是限制性的；本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地明白這些策略的變例。利用此類策略并包括本文中所公開的機(jī)制，本發(fā)明的核酸和多肽分子可以用來產(chǎn)生表達(dá)突變的MTP核酸和多肽分子的藻類、纖毛蟲、植物、真菌或其它微生物如谷氨酸棒狀桿菌，以至于根生長和/或脅迫耐受性得到改善。本發(fā)明還提供與如本文中描述的核酸所編碼的MTP或其部分特異性結(jié)合的抗體?？贵w可以通過眾多眾所周知的方法(見例如Harlow和Lane,"Antibodies;ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork，(1988))產(chǎn)生。簡而言之，純化的抗原可以以足夠激發(fā)免疫應(yīng)答的量及間隔期注射至動物?？梢灾苯蛹兓贵w，或可以從動物中獲得脾臟細(xì)胞。該細(xì)胞隨后可以與永生細(xì)胞系融合并對抗體分泌進(jìn)行篩選?？贵w可用來篩選核酸克隆文庫以獲得分泌抗原的細(xì)胞。那些陽性克隆隨后可以進(jìn)行測序(見例如，Kelly等，1992，Bio/Technology10:163-167;Bebbington等，1992，Bio/Technology10:169-175)。短語與多肽的"選擇性結(jié)合"和"特異性結(jié)合"指在多肽的異質(zhì)群體和其它生物內(nèi)決定該多肽存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫測定條件下，與特定多肽結(jié)合的指定抗體不以明顯的量與存在于樣品內(nèi)的其它多肽結(jié)合。抗體在如此條件下的選擇性結(jié)合可能需要因其對特定多肽的特異性而被選擇的抗體。多種免疫測定模式可以用來選擇與特定多肽選擇性結(jié)合的抗體。例如固相ELISA免疫測定常規(guī)地用來選擇與多肽發(fā)生選擇性免疫反應(yīng)的抗體。見Harlow和Lane,"Antibodies,ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborPublications,NewYork，(1988)對可以用來確定選擇性結(jié)合的免疫測定模式和條件的描述。在某些情況下，需要制備來自多種宿主的單克隆抗體。對制備此類單克隆抗體的技術(shù)的描述可以在Stites等編輯，"Basic和ClinicalImmunology，"(LangeMedicalPublications,LosAltos,Calif"第五版和及其中引用的參考文獻(xiàn))及在Harlow和Lane,"Antibodies,ALaboratoryManual,，，ColdSpringHarborPublications,NewYork，(1988)中找到。在本申請通篇范圍內(nèi)，參考了多種公開文獻(xiàn)。所有這些公開文獻(xiàn)和這些公開文獻(xiàn)內(nèi)所引用的參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容完整地在本文中通過參考引用至本申請內(nèi)，旨在充分描述本發(fā)明所涉及的當(dāng)前技術(shù)水平。還應(yīng)當(dāng)理解前述內(nèi)容涉及本發(fā)明的優(yōu)選實施方案并且可以在其中作出多種改變和變化而不脫離本發(fā)明的范圍。本發(fā)明通過如下實施例得以進(jìn)一步說明，這些實施例無論如何不得解釋為限制本發(fā)明的范圍。相反，應(yīng)當(dāng)清楚地理解在閱讀本文中的描述后，其它多種實施方案、修改及其等效物對本領(lǐng)域技術(shù)人員可以是顯而易見的，而不脫離本發(fā)明精神和/或后續(xù)權(quán)利要求書的范圍。實施例實施例1從植物材料中分離總DNA用于總DNA分離的細(xì)節(jié)涉及l(fā)g鮮重的植物材料。所用的材料包括如下緩沖液CTAB緩沖液2%(w/v)N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化銨(CTAB);lOOmMTrisHClpH8.0;1.4MNaCl;20mMEDTA;N-月桂基肌氨酸緩沖液10%(w/v)N-月桂基肌氨酸；lOOmMTrisHClpH8.0和20mMEDTA。將植物材料在液氮下在研缽內(nèi)研碎以產(chǎn)生精細(xì)粉末并轉(zhuǎn)移到2mlEppendorf容器內(nèi)。凍結(jié)的植物材料隨后用一層lml分解緩沖液(lmlCTAB緩沖液、100^1的N-月桂基肌氨酸緩沖液、20jil卩-巰基乙醇和lOjil的10mg/ml蛋白酶K溶液)覆蓋并在60。C溫育1小時，連續(xù)振搖。將獲得的勻漿分配至2只Eppendorf容器(2ml)內(nèi)并通過與等體積氯仿/異戊醇(M:l)一起振搖而提取兩次。對于相分離，在每一情況下在8000xg并在室溫實施離心15分鐘。DNA隨后使用冰冷的異丙醇在-70'C淀析30分鐘。淀析的DNA在4。C和10，000xg沉淀30分鐘并重懸于180jil的TE緩沖液內(nèi)(Sambrook等，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)。為進(jìn)一步純化，DNA用NaCl(1.2M終濃度)處理并使用2倍體積無水乙醇在-70。C再次淀析30分鐘。在用70%乙醇的洗滌步驟后，將DNA干燥并隨后溶解于50nl的H20+RNA酶(50mg/ml終濃度)內(nèi)。DNA在4。C溶解過夜并且隨后在37°C實施RNA酶消化1小時。DNA在4°C貯藏。實施例2從擬南芥植物材料中分離總RNA和cDNAAtAGRl使用RNA微量分離試劑盒(Qiagenkit),按照制造商推薦，通過從擬南芥葉中制備RNA而得以分離。如下文所述實施cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和擴(kuò)增。1.在10jilDNA酶反應(yīng)物內(nèi)使用2nl的RNA(0,5-2.0ng)制備物，將管轉(zhuǎn)移到37°C持續(xù)15分鐘，添加lpl25mMEDTA并隨后將反應(yīng)物加熱至65。C持續(xù)15分鐘。a.緩沖液(10X:200mMTris，500mMKCl，20mMMgCl2)—ljilb.RNA-2plc.DNA酶(10U/nl)-lnld.H20-6pl2.在室溫反應(yīng)中使用1^1上述的反應(yīng)物，并加熱至65°C持續(xù)5分鐘。a.DNA酶消化的RNA(0.025-0.1fig，取決于初始量)-lnlb.lOmMdNTP-lplc.引物(10jiM)-lnld.H20-直至lOjil3.在單獨的管內(nèi)用這些試劑制備反應(yīng)混合物a.SuperscriptIIRT緩沖液(10X)-2jdb.25mMMgCl2—4jilc.DTT(0.1M)-2fild.無RNA酶的RNA酶抑制劑(40U/fil)-lnl4.添加9jil反應(yīng)混合物至變性的RNA溶液，并在42°C維持2分鐘。5.添加1nlSuperScriptIIRT(50U/jil)，并在42。C溫育50分鐘。6.在70°C終止反應(yīng)15分鐘。7.任選添加ljilRNA酶H至反應(yīng)物內(nèi)以除去RNA。8.根據(jù)需要使用1-2fil新鮮cDNA開展PCR。收獲組織、分離RNA和構(gòu)建cDNA文庫在多種條件和處理下培育作物植物，并且在多種發(fā)育期中收獲不同的組織。植物生長和收獲以策略性方式進(jìn)行，以至使在至少一個或多個產(chǎn)生的文庫內(nèi)收獲全部的可表達(dá)基因的可能性最大化。如上所述從收集的每種樣品中分離mRNA并構(gòu)建cDNA文庫。在文庫產(chǎn)生過程中不使用擴(kuò)增步驟，旨在使樣品內(nèi)基因的冗余度最小化并保留表達(dá)信息。全部文庫從在寡聚dT柱上純化的mRNA中以3，方式生成。隨機(jī)從轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的cDNA文庫內(nèi)杏lL取菌落并將菌落置于孩i量滴定平板內(nèi)。cDNA插入物的PCR擴(kuò)增和點樣PCR擴(kuò)增來自微量滴定平板內(nèi)每個克隆的cDNA插入物。質(zhì)粒DNA分離自大腸桿菌菌落并隨后點樣于尼龍膜上。在樣品點樣至尼龍膜之前，無需純化步驟。實施例3AtAGRl的克隆使用如實施例2中描述的分離的cDNA以通過RT-PCR克隆AtAGRl基因。使用如下引物正向引物是5，國GGGGTCGACCAAAATGATCACCGGCAAAGAC-3，(SEQIDNO:126)。反向引物是5，-GGGTTAATTAACTTAAAGCCCCAAAAGAACGTA畫3'(SEQIDNO:127)。用于擴(kuò)增的PCR反應(yīng)包括1xPCR緩沖液、0.2mMdNTP、100ng鼠耳芥DNA、25pmo1反向引物、2.5單位Pfu或HerculaseDNAPCR根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件并根據(jù)制造商手冊(Sambrook等，1989，Molecularcloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，BiometraT3Thermocycler)開展。用于反應(yīng)的參數(shù)是在94。C上3分鐘，l個循環(huán)；隨后是在94°C上30秒、在55°C上30秒和在72°C上1.5分鐘，25個循環(huán)。將擴(kuò)增的片段隨后用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中提取出來并按照制造商說明，連接至TOPOpCR2.1載體(Invitrogen)。重組載體使用標(biāo)準(zhǔn)條件((Sambrook等1989.Molecularcloning,ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))轉(zhuǎn)化至Topl0細(xì)胞(Invitrogen)。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在含有100ftg/ml羧千西林、0.8mgX-gal(5-溴-4-氯-3-P引咮基-P-D-半乳糖苷)和0.8mgIPTG(異丙基琉代-p-D-半乳糖苷)的LB瓊脂上在37。C過夜培育加以選擇。選擇白色菌落并用來接種含有100jig/ml氨千青霉素的3ml液體LB并在37。C過夜培育。使用QIApr印Spin微量制備試劑盒(Qiagen)按照制造商說明書提取質(zhì)粒DNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)開展對后續(xù)克隆的分析以及限制性酶作圖(Sambrook等，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)。對克隆測序，證實已克隆基因的身份與提交至鼠耳芥數(shù)據(jù)庫內(nèi)的序列(SEQIDNO:l)相同。推導(dǎo)的AtAGRl氨基酸序列示于SEQIDNO:2。AtAGRl基因隨后克隆至雙元載體并在超級啟動子(Supperpromoter)控制下表達(dá)(圖3)。超級啟動子是組成型的，然而是根偏好性的(美國專利號5,428,147和5，217，卯3)。實施例4擬南芥植物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因鼠耳芥(Col)植物通過浸入浸潤法(Bechtold等，1993，"InplantaAgrobacterium-mediatedgenetransferbyinfiltrationofadultArabidopsisthalianaplants,"C.R.Acad.Sci.ParisLifeSci.316:1194-1199)產(chǎn)生。雙元載體使用電穿孔法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌林C58C1或pMP卯內(nèi)。培育轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物，并將細(xì)菌重懸于浸入浸潤法培養(yǎng)基(1/2MS、5%蔗糖、0.5mg/mlMES，pH5.7并含有添加的200ppmSilwetL-77(LehleSeeds))。使用每種培養(yǎng)物以通過將花盆浸入重懸的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物內(nèi)各5分鐘而轉(zhuǎn)化3缽大約5周齡的ColO擬南芥植物。植物隨后在標(biāo)準(zhǔn)擬南芥條件(23。C白晝/20。C夜晚，18小時白晝和65%濕度)下培育至結(jié)種子。在平板上使用100nMPursuit(BASF)篩選T1種子。篩選轉(zhuǎn)化的植物Tl種子根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Xiong等，1999，PlantMolecularBiologyReporter17:159-170)消毒。種子在含有0.6%瓊脂并以1%蔗糖和2fig/ml苯菌靈(Sigma畫Aldrich)補(bǔ)充的1/4Murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS)(Sigma-Aldrich)上選擇。種子在平板上在4°C觀察4日。使種子在人工氣候室內(nèi)在空氣溫度22。C和光密度40micromols-1"12(白色光；PhilipsTL65W/25熒光燈管)以及16小時光照和8小時黑暗的日長度周期下萌發(fā)。轉(zhuǎn)化的幼苗在14日后進(jìn)行選擇并轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充0.6%瓊脂、1%蔗糖的%MS培養(yǎng)基上并且允許恢復(fù)5日至7曰。T2世代的種子用于在土壤內(nèi)和在體外的植物根分析。實施例5轉(zhuǎn)化的擬南芥植物的體外根分析對于轉(zhuǎn)化植物的體外根分析，使用尺度12cmxl2cm的正方形平板。對于每個平板，使用無選擇劑的52mlMS培養(yǎng)基(0.5xMS鹽、0.5%蔗糖、0.5g/LMES緩沖液、1%植物瓊脂)。允許平板在無菌臺內(nèi)干燥l小時以減少將來的固縮。種子等分試樣在玻璃瓶內(nèi)用乙醇消毒5分鐘，隨后除去乙醇并允許種子在無菌臺內(nèi)干燥l小時。種子使用VacuseedDevice(Lehle)點播在平板上。在實IH殳計中，每個平板含有野生型植物和AtAGRl轉(zhuǎn)基因植物。因此，每一林系總是與生長在同一平板中的對照比較以計算微環(huán)境變量。在種子點播于平板上后，平板用Ventwrap包裹并垂直地放置在擱架內(nèi)，在4°C黑暗中持續(xù)4日以層積處理種子。將平板轉(zhuǎn)移至C5Percival生長室并垂直放置14日。生長室條件是23。C白晝/21。C夜晚，以及16小時白天/8小時黑夜。為數(shù)據(jù)收集，使用高分辨率平板掃描儀。使用WinRhizo軟件包完成根分析。為體外分析，將根測量為萌發(fā)14日后主根的長度。這對應(yīng)于擬南芥生態(tài)型CW"附&Vi的4至6葉期。觀察到的任何差異可能指示根長度的生長速率差異，但還可以反映最終的根生長。這些實驗的結(jié)果還在基因水平上加以分析。為此，將全部植物根長度對全部轉(zhuǎn)基因林系進(jìn)行平均化并與野生型植物的平均值比較。靶向NOS終止子的轉(zhuǎn)基因的存在和事件的拷貝數(shù)在實時PCR中確定。用于該分析的NOS引物是正向引物5，-TCCCCGATCGTTCAAACATT畫3，(SEQIDNO:128)，反向引物5'國CCATCTCATAAATAACGTCATGCAT國3，(SEQIDNO:129)。反應(yīng)在96孔光學(xué)平板(AppliedBiosystems，4314320)內(nèi)運行，并且內(nèi)源性對照反應(yīng)和目的基因反應(yīng)在同一塊平板內(nèi)同時運行。制備用于兩種引物組的主混合物。用于鑒定法的主混合物和96孔平板應(yīng)當(dāng)保持在水上。計算用于52個的反應(yīng)，這適用于利用多通道加樣器的半個平板。使用Eurogentec試劑盒(目錄號RTSNRT032X-1)，并且j吏用制造商推薦方法準(zhǔn)備反應(yīng)物。使用GeneAmp5700運行反應(yīng)并收集數(shù)據(jù)。結(jié)果我們的結(jié)果顯示在平板內(nèi)評估的AtAGRl轉(zhuǎn)基因植物具有較長的根表型。圖4A顯示基于每抹系的在垂直平板內(nèi)所培育植物的結(jié)果。與野生型對照植物的才M目比，大部分篩選的AtAGRl轉(zhuǎn)基因抹系表現(xiàn)出較長的根表型。在抹系5、7、9、10和11內(nèi)更清楚地觀察到該表型。如圖4B內(nèi)所見，AtAGRl轉(zhuǎn)基因植物的基因水平分析證實AtAGRl植物表現(xiàn)增加的根長度表型，基于此分析，AGRl轉(zhuǎn)基因擬南芥植物表現(xiàn)29.3%的根長度增加。實施例6轉(zhuǎn)化的擬南芥植物的土壤根分析為土壤根分析，種子在4。C于水中吸漲2日并不加選擇而直接種植在土壤里。使用在底部具有飽和的泥炭球(Jiffy727)的Deepots(HummertD40)并填滿水飽和的Metromix。在種植后，花盆用塑料外罩覆蓋以防止變干。植物使用僅存在于培養(yǎng)基制備物內(nèi)的水進(jìn)行培育，因為在這些大花盆內(nèi)土壤中的水足夠用于3周生長并且促進(jìn)快速的根生長。在12日后移走花盆的塑料外罩并記錄形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。在第17日。收獲植物的地上部分，在65°C干燥2日并測量干重。為檢查根，將泥炭球推向花盆的頂部以移出作為一個整體的土壤和根。隨后在淺盤內(nèi)分開土壤與根并測量最大根長度。為確定根表型對轉(zhuǎn)基因植物地上部分的影響，測量葉叢的干重并與野生型植物進(jìn)行比較。結(jié)果如上所述也在土壤內(nèi)評估AtAGRl林系的根。結(jié)果表明當(dāng)植物在土壤內(nèi)培育時，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)較長的根表型(圖5和6)。通常，所分析的全部AtAGRl林系在基于土壤的鑒定法中表現(xiàn)增加的生長。抹系4、7、8、9、10和11顯示根長度的最大增加(圖5)。圖6顯示AtAGRl基因整體表現(xiàn)的ANOVA，表明AtAGRl轉(zhuǎn)基因植物比野生型對照明顯表現(xiàn)更好。測量葉叢干重，并且結(jié)果的ANOVA分析示于圖7。在轉(zhuǎn)基因植物與野生型對照之間未觀察到顯著差異。因此，葉叢生物量似乎不受AtAGRl基因過量表達(dá)的影響。實施例7鑒定AtAGRl的同系物本發(fā)明中所用的算法包括FASTA(具有統(tǒng)計顯著性估計的極其敏感的序列數(shù)據(jù)庫搜索工具；PearsonW.R.，1990，RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA.MethodsEnzymol.183:63-98);BLAST(具有統(tǒng)計顯著性估計的極其敏感的序列數(shù)據(jù)庫搜索工具。AltschulS.F.等,Basiclocalalignmentsearchtool,JournalofMolecularBiology215:403-10);PREDATOR(從單個序列和多重序列中高度精確地預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。Frishman，D.和Argos，P.，1997，75%sccuracyinproteinsecondarystructureprediction.Proteins,27:329-335);CLUSTALW(多重序列比對法；Thompson,J.D.等，1994,CLUSTALW(improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,NucleicAcidsResearch,22:4673-4680);TMAP(從多重比對的序列中預(yù)測跨膜區(qū)；Persson,B.和Argos，P.，1994，Predictionoftransmembranesegmentsinproteinsutilizingmultiplesequencealignments.J.Mol.Biol.237:182-192);ALOM2(從單個序列中預(yù)測跨膜區(qū)。Klein,P.等，Predictionofproteinfunctionfromsequenceproperties:Adiscriminateanalysisofadatabase.Biochim.Biophys.Acta787:221-226(1984)。由Dr.K.Nakai提供版本2);PROSEARCH(PROSITE蛋白質(zhì)序列模式檢測。Kolakowski等，1992，ProSearch:fastsearchingofproteinsequenceswithregularexpressionpatternsrelatedtoproteinstructureandfunction.Biotedmiques13，919-921);BLIMPS(對非空位性區(qū)段的數(shù)據(jù)庫的相似性搜索。Wallace和Henikoff，1992);PATMAT(用于序列、模式和區(qū)段詢問和數(shù)據(jù)庫的搜索和提取程序，CABIOS8:249-254。由BillAlford編制)。在公共數(shù)據(jù)庫和專利數(shù)據(jù)庫內(nèi)找到了AtAGRl基因的同系物。評估這些同系物以確定與AtAGRl的關(guān)聯(lián)水平。使用來自算法BLAST家族的tblastn程序以〗更將AtAGRl蛋白質(zhì)序列與在全部六種可讀框下所翻譯的專利作物數(shù)據(jù)庫比較。在每種作物文庫內(nèi)均找到了具有顯著同源性的序列。與AtAGRl相比，在每種序列氨基酸水平上的序列同一性百分?jǐn)?shù)示于表1的第5列中。實施例8通過過量表達(dá)JG/W基因而改造大豆植物大豆的種子用70%乙醇在室溫(連續(xù)振搖)表面消毒4分鐘，隨后由補(bǔ)加0.05%(v/v)Tween的20%(v/v)CLOROX(連續(xù)振搖)表面消毒20分鐘。隨后種子用蒸餾水淋洗4次并在室溫放置在培養(yǎng)臟內(nèi)的潤濕無菌濾紙上6至39小時。剝掉種皮，并將子葉與胚軸分離。檢查胚軸以確保未損傷分生組織。將切碎的胚軸收集到半開口的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)并且在密封的培養(yǎng)皿內(nèi)空氣干燥至含濕量小于20%(鮮重)直至進(jìn)一步利用。如此制備根瘤農(nóng)桿菌培養(yǎng)物，即從含有適宜選擇劑的LB固體培養(yǎng)基中挑取單菌落，隨后在液體LB培養(yǎng)基內(nèi)培育該單菌落至600nm光密度0.8。隨后，將細(xì)菌培養(yǎng)物在7000轉(zhuǎn)/分鐘在室溫沉淀7分鐘并重懸于補(bǔ)充100nM乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基內(nèi)。使用前，細(xì)菌培養(yǎng)物在這種預(yù)先誘導(dǎo)的培養(yǎng)基內(nèi)室溫溫育2小時。含濕量大約15%的大豆合子性種子的胚軸在室溫以預(yù)先誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)物浸滲2小時。將胚從浸滲作用培養(yǎng)物內(nèi)取出并轉(zhuǎn)移至含有補(bǔ)充2%蔗糖的固體MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)并在黑暗下室溫溫育2日?；蛘撸瑢⑴叻胖糜谂囵B(yǎng)皿內(nèi)潤濕(液體MS培養(yǎng)基)的無菌濾紙表面并在如上所述的相同條件下溫育。在此段時間后，將胚轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充500mg/L羧千西林或300mg/L頭孢噻肟的固體MS培養(yǎng)基或液體MS培養(yǎng)基以殺死農(nóng)桿菌。液體培養(yǎng)基用來濕潤無菌濾紙。胚在4周期間在25。C于150ftmo1m、ec"和12小時的光周期下溫育。一旦幼苗產(chǎn)生根，將它們轉(zhuǎn)移到無菌Metro-Mix土壤內(nèi)。在轉(zhuǎn)移植物至土:t裒前，洗掉體外植物的培養(yǎng)基。植物在塑料罩下保持l周以促進(jìn)適應(yīng)過程。隨后，將植物轉(zhuǎn)移至生長室，在那里植物在25°C于150jimo1m、ec"和12小時的光周期下溫育約80日。對轉(zhuǎn)基因植物篩選其改良的根生長和/或脅迫耐受性，證實轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予增加的根生長、脅迫耐受性和/或增加的水利用效率。實施例9通過過量表達(dá)」GiW基因而改造歐洲油菜/卡諾拉油菜植物本文中所述的植物轉(zhuǎn)化方法適用于蕓莒屬作物和其它作物?？ㄖZ拉油菜的種子用70。/。乙醇在室溫(連續(xù)振搖)表面消毒4分鐘，隨后由補(bǔ)加0.05%(v/v)Tween的20%(v/v)CLOROX(連續(xù)振搖)表面消毒20分鐘。隨后種子用蒸餾水淋洗4次并在室溫放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的潤濕無菌濾紙上18小時。隨后去除種皮，并且種子在半開口的無菌培養(yǎng)i內(nèi)空氣干燥過夜。在此期間，種子喪失其大約85%的水含量。隨后種子在室溫貯存于密封的培養(yǎng)亞內(nèi)直至進(jìn)一步利用。DNA構(gòu)建體和胚浸滲如實施例10內(nèi)所描述。原代轉(zhuǎn)基因植物(To)的樣品通過PCR進(jìn)行分析以證實T-DNA的存在。這些結(jié)果由Southern雜交證實，其中DNA在l%瓊脂糖凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到帶陽性電荷的尼龍膜(RocheDiagnostics)上。使用PCRDIG探針合成試劑盒(RocheDiagnostics)來通過PCR制備地高辛標(biāo)記的探針并如制造商推薦加以使用。對轉(zhuǎn)基因植物篩選其改良的根生長和/或脅迫耐受性，證實轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予增加的根生長、脅迫耐受性和/或增加的水利用效率。實施例10通過過量表達(dá)v4GJW基因而改造玉米植物用Ishida等1996.NatureBiotch14745-50所述的方法開展以目的基因轉(zhuǎn)化玉米(ZeamaysL.)。將不成熟的胚與攜帶"超級雙元"載體的根瘤農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，并且通過器官發(fā)生法恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植物。該方法提供2.5%至20。/。之間的轉(zhuǎn)化效率。對轉(zhuǎn)基因植物篩選其改良的根生長和/或脅迫耐受性，證實轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予增加的根生長、脅迫耐受性和/或增加的水利用效率。實施例11通過過量表達(dá)乂G7W基因而改造稻植物以目的基因?qū)Φ镜霓D(zhuǎn)化可以通過利用原生質(zhì)體或粒子轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)實施。原生質(zhì)體介導(dǎo)性轉(zhuǎn)化已經(jīng)描述用于日本型和印度型稻(Zhang等，PlantCellRep7:379-384(1988);Shimamoto等Nature338:274-277(1989);Datta等Biotechnology8:736-740(1990))。4吏用粒子轟擊法，兩種類型的稻也是可常規(guī)轉(zhuǎn)化的(Christou等Biotechnology9:957-962(1991))。對轉(zhuǎn)基因植物篩選其改良的生長和/或脅迫耐受性，證實轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予增加的^^生長、脅迫耐受性和/或增加的水利用效率。實施例12同源基因和異源基因的鑒定基因序列可以用來鑒定來自cDNA文庫或基因組文庫的同源基因或異源基因。同源基因(例如全長cDNA克隆)可以使用例如cDNA文庫通過核酸雜交得以分離。根據(jù)目的基因的豐度，將100,000直至l，OOO，OOO個重組噬菌體鋪板并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。用堿變性后，將DNA固定在尼龍膜上，例如通過紫外線交聯(lián)進(jìn)行固定。雜交在高嚴(yán)格性條件下實施。在水溶液內(nèi)，雜交和洗滌在1MNaCl離子強(qiáng)度和68°C溫度上開展。雜交探針例如通過放射性(32p)切口轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法(HighPrime,Roche,Mannheim,德國)產(chǎn)生。信號通過放射自顯影法檢測。條件和洗滌條件，以與如上所述方法類似的方式加以鑒定。對于水溶液雜交，離子強(qiáng)度通常保持在lMNaCl上，而同時溫度漸進(jìn)性地從68。C降低至420C。分離僅在明顯的結(jié)構(gòu)域(例如10-20個氨基酸)內(nèi)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列可以通過使用合成性放射標(biāo)記的寡核苷酸探針實施。放射標(biāo)記的寡核苷酸探針通過用T4多核苷酸激酶使兩個互補(bǔ)的寡核苷酸的5'末端磷酸化而制備。將互補(bǔ)的寡核苷酸復(fù)性并連接以形成連環(huán)體。雙鏈的連環(huán)體隨后通過例如切口轉(zhuǎn)錄進(jìn)行放射標(biāo)記。通常在低嚴(yán)格性條件，使用高寡核苷酸濃度實施雜交.寡核苷酸雜交溶液6xSSC0.01M辨酸鈉lmMEDTA(pH8)0.5%SDS100jig/ml變性鮭精DNA0.1%脫脂乳雜交期間，溫度逐步降低到比估計的寡核苷酸Tm低5-10。C或降低至室溫，隨后實施洗滌步驟和放射自顯影。以低嚴(yán)格性開展洗滌，如使用4xSSC的3個洗滌步驟。更詳細(xì)的內(nèi)容由Sambrook，J.等，1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress或Ausubel，F(xiàn).M.等，1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"JohnWiley&Sons描述。實施例13通過用抗體篩選表達(dá)文庫而鑒定同源基因cDNA克隆可以用來產(chǎn)生重組蛋白，例如在大腸桿菌(例如QiagenQIA表達(dá)pQE系統(tǒng))內(nèi)。重組蛋白隨后通常經(jīng)M-NTA親和層析(Qiagen)得以親和純化。重組蛋白隨后用來(例如通過^f吏用用于兔免疫的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù))產(chǎn)生特異性抗體。如Gu等，1994，BioTechniques17:257-262所述，抗體使用以重組抗原飽和的M-NTA柱得到親和純化。這種抗體可以用來篩選表達(dá)cDNA文庫以便通過免疫篩選法鑒定同源基因或異源基因(Sambrook，J.等，1989,"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress或Ausubd，F(xiàn).M.等，1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"JohnWiley&Sons)。實施例14體內(nèi)誘變微生物的體內(nèi)誘變可以通過在遺傳信息完整性的維持能力受到破壞的大腸桿菌或其它生物(例如芽孢桿菌或酵母如釀酒酵母)內(nèi)傳代質(zhì)粒而實施。常見增變菌林在用于DNA修復(fù)系統(tǒng)的基因(例如mutHLS、mutD、mutT等，見Rupp，W.D，，1996，DNArepairmechanisms,在EscherichiacoliandSalmonella的第2277-2294頁，ASM:Washington.)內(nèi)具有突變。此類菌林是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。此類菌抹的用途例如在Greener,A.和Callahan,M.，1994，Strategies7:32-34內(nèi)得到說朋。突變的DNA分子至植物的轉(zhuǎn)移優(yōu)選地在選擇并在微生物內(nèi)檢驗后完成。轉(zhuǎn)基因植物根據(jù)本文件的實施例部分內(nèi)的多種實施例產(chǎn)生。實施例15體外分析轉(zhuǎn)基因生物內(nèi)擬南芥基因的功能酶的活性及動力學(xué)參數(shù)的測定在本領(lǐng)域內(nèi)已充分建立。測定任意給定變異酶的活性的實驗必須適合于野生型酶的特定活性，這完全在本領(lǐng)域4支術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。關(guān)于酶的一般綜述以及有關(guān)結(jié)構(gòu)、動力學(xué)、原理、方法、應(yīng)用的具體細(xì)節(jié)及測定眾多酶活性的實例可以在如下參考文獻(xiàn)內(nèi)找到Dixon,M.和Webb,E.C.，1979，Enzymes.Longmans:London;Fersht，1985，EnzymeStructureandMechanism.Freeman:NewYork;Walsh,1979，EnzymaticReactionMechanisms.Freeman:SanFrancisco;Price,N.C.，Stevens,L，1982,FundamentalsofEnzymology.OxfordUniv.Press:Oxford;Boyer，P.D.編輯,1983，TheEnzymes,第3版AcademicPress:NewYork;Bisswanger,H.，1994，Enzymkinetik,第2版VCH:Weinheim(ISBN3527300325);編者Bergmeyer,H.U.，Bergmeyer，J.,Grafil，M.，1983-1986，MethodsofEnzymaticAnalysis,第3版,第I畫XII巻，VerlagChemie:Weinheim和Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,1987，第A9巻，Enzymes.VCH:Weinheim,第352-363頁。與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的活性可以通過數(shù)種充分建立的方法測量，如DNA帶遷移鑒定法(也稱凝膠阻滯鑒定法)。此類蛋白質(zhì)對其它分子表達(dá)的影響可以使用報道基因鑒定法(如在Kolmar，H.等，1995，EMBOJ.14:3895-3卯4及其引用的參考文獻(xiàn)內(nèi)所述的報道基因鑒定法)測量。報道基因檢測系統(tǒng)是眾所周知的并且建立了用于使用酶如p-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白或數(shù)種其它物質(zhì)在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用。測定膜轉(zhuǎn)運蛋白的活性可以才艮據(jù)如Gennis，R.B.，1989，Pores,ChannelsandTransporters,inBiomembranes,MolecularStructureandFunction,第85-137頁，199-234和第270-322頁，Springer:Heidelberg內(nèi)所述的技術(shù)開展。實施例16純化來自轉(zhuǎn)化生物的所需產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的多種方法開展回收來自以本文中描述的核酸序列所轉(zhuǎn)化的植物材料、真菌、藻類、纖毛蟲、谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞或其它細(xì)菌細(xì)胞中或來自以上所述培養(yǎng)物的上清液中的所需產(chǎn)物。如果所需產(chǎn)物不從細(xì)胞中分泌，則細(xì)胞可以從培養(yǎng)物中通過低速離心收獲，并且細(xì)胞可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如機(jī)械力或超聲破碎法被裂解。植物的器官可以機(jī)械地與其它的組織或器官分開。勻漿后，細(xì)胞殘片通過離心除去，并且保留含有可溶性蛋白的上清液部分用于進(jìn)一步純化所需的化合物。若產(chǎn)物從所需要的細(xì)胞內(nèi)分泌，則細(xì)胞從培養(yǎng)物內(nèi)通過低速離心去除，并且保留上清液部分用于進(jìn)一步純化。將來自兩種純化方法之一的上清液部分用合適的樹脂進(jìn)行色語處理，在所述層析中所需要的分子滯留在色譜樹脂上而樣品內(nèi)的眾多雜質(zhì)未滯留在色i普樹脂上，或者雜質(zhì)被樹脂滯留，而樣品未被樹脂滯留。此類色譜步驟可以根據(jù)需要使用相同色鐠樹脂或不同層析樹脂重復(fù)進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將善于選擇適宜的色譜樹脂以及選擇它們對特定待純化分子的最有效應(yīng)用。純化的產(chǎn)物可以經(jīng)過濾或超濾進(jìn)行濃縮，并貯存在使產(chǎn)物最穩(wěn)定的溫度下。存在本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種純化方法并且前面的純化方法并不意味是限制性的。此類純化技術(shù)在例如Bailey,J.E.和Ollis，1986，D.F.BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-Hill:NewYork中描述。此夕卜,分離的化合物的鑒定和純度可以通過本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行評定。這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括高效液相色語(HPLC)、光譜法、染色方法、薄層層析法、NIRS、酶測定法或微生物學(xué)法。此類分析方法在Patek等，1994，Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等,1996，Biotekhnologiya11:27-32;和Schmidt等,1998,BioprocessEngineer.19:67-70;Ulmann'sEncyclopediaofIndustrailChemistry,1996，第A27巻，VCH:Wdnheim，第89-卯頁，第521-540頁，第540-547頁，第559-566頁，575-581和第581-587頁；Michal,G.，1999，BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWileyandSons;Fallon,A.等,1987,ApplicationsofHPLCinBiochemistryin:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,第17巻內(nèi)綜述實施例17鹽耐受性篩選在MS平板上的鹽試驗將幼苗轉(zhuǎn)移至浸泡在1/2MS內(nèi)濾紙上并于耐受性篩選前夜放置在補(bǔ)加2ng/ml苯菌靈的1/2MS0.6。/。瓊脂表面。對于耐受性篩選，將濾紙連同幼苗移動到培養(yǎng)亞中成疊浸泡在50mMNaCl內(nèi)的無菌濾紙上。2小時后，將濾紙連同幼苗移動到培養(yǎng)亞中成疊浸泡在200mMNaCl內(nèi)的無菌濾紙上。2小時后，將濾紙連同幼苗移動到培養(yǎng)皿中成疊浸泡在600mMNaCl內(nèi)的無菌濾紙上。10小時后，將幼苗移動到含有補(bǔ)加2ng/ml苯菌靈的1/2MS0.6。/。瓊脂的培養(yǎng)i內(nèi)。在5日后對幼苗評分，表明轉(zhuǎn)基因賦予鹽耐受性。對鹽耐受性的土壤試驗待測試的植物種子進(jìn)行消毒(100。/。漂白劑，0.1%TritonX5分鐘2次并用ddH20淋洗5次)。種子鋪在無選擇劑的培養(yǎng)基(1/2MS、0.6%植物瓊脂、0.5g/LMES、1%蔗糖、2fig/ml苯菌靈)上。允許種子萌發(fā)大約10日。在4-5葉期，轉(zhuǎn)基因植物栽種到5.5cm直徑的花盆內(nèi)，其中所述的花盆以土壤(Metromix360,Scotts)疏松填滿并用1g/L20-20-20肥料(PetersProfessional,Scotts)潤濕。允許植物生長(22。C,持續(xù)光照)大約7日，根據(jù)需要澆水。當(dāng)植物即將抽薹時，從淺盤中移走水并開始試驗。為了開始試驗，將3升100mMNaCl和1/8MS添加到花盆下的淺盤內(nèi)。向含有對照植物的淺盤添加3升1/8MS。10日后，對NaCl處理的植物和對照植物澆水。再過10日，對植物照相。實施例18干早耐受性篩選將T1和T2幼苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)亞中干燥無菌的濾紙上并允許在80%RH(相對濕度)下，在Sanyo生長箱MLR-350H，micromols^2(白色光；PhilipsTL65W/25熒光燈管)內(nèi)干燥2小時。RH隨后降低至60。/。，并JU吏幼苗再干燥8小時。幼苗隨后移動并置于補(bǔ)充2jig/ml苯菌靈的1/2MS0.6%瓊脂平板上并在5日后評分。對轉(zhuǎn)基因植物篩選改良的干旱耐受性，證實轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予干旱耐受性。實施例19水凍耐受性篩選將幼苗移至含有補(bǔ)充2%蔗糖和2jig/ml苯菌靈的1/2MS0.6%瓊脂的培養(yǎng)亞內(nèi)。4日后，將幼苗在+4。C溫育1小時并隨后用碎水覆蓋。隨后將幼苗放置在EnviromentalSpecialistES2000人工環(huán)境室內(nèi)并以-1.0。C為起點溫育3.5小時，每小時降低-l。C。幼苗隨后在-5.0。C溫育24小時并隨后允許在+5。C融化12小時。傾去水并且在5日后對幼苗評分。對轉(zhuǎn)基因植物篩選改良的寒冷耐受性，證實轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予寒冷耐受性。權(quán)利要求1.以分離的核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中核酸包含選自以下的多核苷酸a)多核苷酸，其具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述的序列；b)多核苷酸，其編碼具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多肽；c)多核苷酸，其與具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性；d)編碼多肽的多核苷酸，其中所述的多肽與具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多肽具有至少70％序列同一性；和e)在嚴(yán)格條件下與以上a)至d)的任意多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸。2.權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中多核苷酸在植物內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致與植物的野生型品種相比，在正常條件或脅迫條件下產(chǎn)量增加。3.權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中多核苷酸在植物內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致與植物的野生型品種相比，環(huán)境脅迫耐受性增加。4.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中多核苷酸在植物內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致與植物的野生型品種相比，在正常條件或脅迫條件下根生長增加。5.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中植物是單子葉植物。6.權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中植物是雙子葉植物。7.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中植物選自玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、黍、甘蔗、大豆、花生、棉花、歐洲油菜、卡諾拉油菜、木薯、辣椒、向日葵、萬壽菊、茄科植物、馬鈴薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬植物、油棕櫚、椰子、多年生禾草和飼料作物。8.權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)基因作物植物，其中植物是完整植物、植物2細(xì)胞、植物部分或植物種子。9.由權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因作物植物產(chǎn)生的作物植物種子，其中種子包含分離的核酸。10.權(quán)利要求9所述的種子，其中與野生型品種的種子相比，所述種子對正常條件或脅迫條件下增加的產(chǎn)量是不分離的。11.權(quán)利要求9所述的種子，其中與野生型品種的種子相比，所述種子對增加的環(huán)境脅迫耐受性是不分離的。12.權(quán)利要求9所述的種子，其中與野生型品種的種子相比，所述種子對正常條件或脅迫條件下增加的根生長是不分離的。13.產(chǎn)生含有所分離的編碼多肽的核酸的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括步驟用包含核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且從植物細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)多肽的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述核酸包含選自如下的多核苷酸a)多核苷酸，其具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述的序列；b)多核苷酸，其編碼具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多肽；c)多核苷酸，其與具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性；d)編碼多肽的多核苷酸，其中所述的多肽與具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多肽具有至少70%序列同一性；和e)在嚴(yán)格條件下與以上a)至d)的任意多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸。14.權(quán)利要求13所述的方法，其中多核苷酸在植物內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致與植物的野生型品種相比，在正常條件或脅迫條件下產(chǎn)量增加。15.權(quán)利要求13所述的方法，其中多核苷酸在植物內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致與植物的野生型品種相比，環(huán)境脅迫耐受性增加。16.權(quán)利要求13所述的方法，其中多核苷酸在植物內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致與植物的野生型品種相比，在正常條件或脅迫條件下根生長增加。17.權(quán)利要求13所述的方法，其中作物植物是單子葉植物。18.權(quán)利要求13所述的方法，其中作物植物是雙子葉植物。19.權(quán)利要求13所述的方法，其中作物植物選自玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、高粱、黍、甘蔗、大豆、花生、棉花、歐洲油茱、卡諾拉油菜、木薯、辣椒、向日葵、萬壽菊、茄科植物、馬鈴薯、煙草、茄子、番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬植物、油棕櫚、椰子、多年生禾草和飼料作物。20.權(quán)利要求13所述的方法，其中核酸包含具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多核苷酸。21.權(quán)利要求13所述的方法，其中核酸包含如下多核苷酸，其中所述的多核苷酸與具有如在表l第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。22.權(quán)利要求13所述的方法，其中核酸包含編碼如下多肽的多核苷酸，其中所述多肽具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述的序列。23.權(quán)利要求13所述的方法，其中核酸包含編碼如下多肽的多核苷酸，其中所述多肽與具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO內(nèi)所述序列的多肽具有至少70%序列同一性。24.權(quán)利要求13所述的方法，其中核酸與一種或多種調(diào)節(jié)序列有效連接。25.權(quán)利要求24所述的方法，其中調(diào)節(jié)序列是啟動子。26.權(quán)利要求25所述的方法，其中啟動子是組織特異性的。27.權(quán)利要求25所述的方法，其中啟動子是受發(fā)育調(diào)節(jié)的。全文摘要轉(zhuǎn)基因作物植物由編碼膜轉(zhuǎn)運蛋白樣多肽(MTP)的核酸轉(zhuǎn)化，其中與植物的野生型品種相比，核酸序列在作物植物內(nèi)的表達(dá)引起植物增加的根生長和/或增加的產(chǎn)量和/或增加的環(huán)境脅迫耐受性。本發(fā)明還提供農(nóng)業(yè)產(chǎn)物，包括轉(zhuǎn)基因作物植物所產(chǎn)生的種子。文檔編號C12N15/82GK101228279SQ200680026665公開日2008年7月23日申請日期2006年7月13日優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日發(fā)明者B·麥克爾西,D·艾倫,E·R·加爾,J·黑特爾,R·薩里亞-米蘭申請人:巴斯福植物科學(xué)有限公司