專利名稱：：糖基化的il-7，制備及應用的制作方法糖基化的IL-7，制備及應用本發(fā)明涉及新的改進的白介素-7多肽，以及含有它的組合物及其制備和應用。更具體來說，本發(fā)明涉及具有改進的性質(zhì)的超糖基化的IL-7多肽，以及它們的生產(chǎn)和治療應用。本發(fā)明還公開了新的具有修飾的含有人工產(chǎn)生的糖基化位點的氨基酸序列的IL-7多肽，以及相應的核酸分子、載體和重組宿主或宿主細胞。本發(fā)明還涉及了使用這樣的多肽、細胞或核酸用來治愈性或預防性治療哺乳動物受試者，包括人類受試者。發(fā)明背景B和T淋巴細胞是免疫反應的主要效應細胞。這兩類細胞被認為最終都是從哺乳動物骨髓中的造血干細胞通過代表每種類別細胞的分化過程中不同的階段的祖細胞或前體細胞衍生而來的。成熟的T細胞主要在胸腺中發(fā)育，可能是由在T淋巴細胞發(fā)育的早期從骨髓遷移到胸腺的前體細胞發(fā)育而來的。淋巴樣細胞的發(fā)育依賴于各種基質(zhì)細胞產(chǎn)生的生長、存活和分化因子。有大量因子對成熟的外周B和T細胞有活性，包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、y-干擾素、BSF-2、神經(jīng)白細胞素、轉(zhuǎn)化生長因子P和IL-7。"白介素-7"或"IL-7"是指哺乳動物內(nèi)源分泌的糖蛋白，能夠誘導骨髓衍生的淋巴細胞祖細胞和前體細胞、包括被稱為前B細胞的特化的前體細胞的增殖。盡管最初是從骨髓細胞株的基質(zhì)成分衍生而來的，但IL-7也被胸腺基質(zhì)細胞、腸和其它上皮細胞、某些樹突狀細胞和濾泡樹突狀細胞、角質(zhì)細胞和基本上所有的淋巴樣組織所分泌。這種蛋白的另一種命名是"前B細胞生長因子"和"淋巴細胞生成素-1"。EP0314415(或US4,965,195)描述了哺乳動物白介素-7蛋白和相應的DNAs。人類IL-7的氨基酸序列包含三個推測的N-連接的糖基化位點，位于70、91和116位的Asn殘基上。hlL-7(人類IL-7)在COS細胞中的瞬時重組表達使得r-huIL-7(重組人類IL-7)可以被觀察到為表觀分子量大約為20、24和28kDa的三個蛋白條帶(Cosman等，LymphokineReceptorInteractions;1989;179:229-236)。hIL-7在BHK細胞中的穩(wěn)定重組表達也已經(jīng)被報道(Armitage等；TheJournalofImmunology;1990;144:938-941)。但是，天然存在的人類IL-7的糖基化狀態(tài)、特別是O-糖基化狀態(tài)還從來沒有被記錄或研究過，并且糖基化情況對IL-7性質(zhì)的影響也從來沒有被考慮過。此外，正如在EP0314415中描述的那樣，在大腸桿菌中產(chǎn)生的未糖基化的成熟的人類IL-7(r-hIL-7)，表現(xiàn)出17,387道爾頓的分子量，在體外在基于各種淋巴細胞種群的增殖的特定的生物分析中顯示出高的活性。其它的細胞因子和生長因子例如G-CSF、GM-CSF、IFN、HGF等，沒有糖基化時也表現(xiàn)出完整的治療活性。WO2004/018681公開了人類IL-7的一種活性構(gòu)象異構(gòu)體，包含了下列二硫橋1-4(C2國C92)、2-5(C34-C129)和3-6(C47國C141)，并公開了生產(chǎn)方法或研究其特征的方法及其應用。IL-7最初是作為細胞因子被公開的，其主要活性是誘導前體B細胞的增殖(NamenA.E.等;JournalofExperimentalmedicine;1988;167:988-1002)。最近已經(jīng)報道IL-7在T細胞發(fā)育的早期階段參與了胸腺細胞(T-細胞)的存活和增殖(SchlunsK.S.等；NatureImmunology;2000;l(5):426-432)。IL-7途徑對于淋巴細胞發(fā)育、特別是發(fā)育為胸腺細胞是重要的(Mae證M丄等；Int.Rev.Immunol.;1998;16:309-22-FryT丄等；Blood;2002;99:3892-904)。Fry及合作者還鑒定出IL-7在多因子作用中作為不依賴胸腺的T-細胞再生的潛在調(diào)節(jié)劑((FryT丄等.；Blood;2001;97(6):1525-1533)。IL-7有力地調(diào)節(jié)成熟的T細胞，并且除了對成熟T-細胞的這種效應之外，IL-7還可以影響抗原呈遞細胞的發(fā)育(MarquezC.等；J.Exp.Med.;1995;181:475-83)。IL-7對于CD4+禾卩CD8+亞類的記憶T細胞的再生也是重要的(KondrackR.M.等;J.Exp.Med.;2003;198:1797-806-KaechS.M.等；Nat.Immunol.;2003;4:1191-8)。因此，IL-7具有極大的治療潛力，可以用于刺激T細胞前體、分泌抗體的B細胞的增殖，用于刺激抗原驅(qū)動的T-細胞外周擴增，用于生產(chǎn)幼稚T細胞以及其它造血細胞類型。活性IL-7分子的一種特別有趣的治療應用是用于淋巴細胞減少的病人的免疫重建，這樣的病人包括癌癥治療病人、接受骨髓或干細胞移植的病人、表現(xiàn)出獲得性或遺傳免疫缺陷的病人、老年病人或任何具有低CD4計數(shù)的病人。由于IL-7具有產(chǎn)生新的幼稚CD4T-細胞以及擴增特定的庫以產(chǎn)生或增加特異性免疫反應(疫苗增強)的能力，它在這些方面還有其它的應用。鑒于其治療潛力，對于開發(fā)適合于有效的治療應用的生物活性或改進的IL-7多肽有相當大的興趣。就這點而言，在可以商業(yè)獲得的各種細胞因子和生長因子中，有些是低免疫原性的(例如a-干擾素"IFNa"，粒細胞集落刺激因子"G-CSF")，以便相應的藥物物質(zhì)不需要超過通常接受的重組蛋白常規(guī)水平的非常特定的多肽純度。相反，其它的生長因子具有更高的免疫原性(例如e-干擾素"e-IFN"，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子"GM-CSF'),或它們比活性對于生命來說非常重要(例如紅細胞生成素，"EPO")，以至于藥物物質(zhì)多肽的純度和分布情況必須被特別地研究并維持在狹窄的限度內(nèi)，以保護免受免疫原性的影響。IL-7是獨特的分子。由于其內(nèi)在的免疫增強性質(zhì)，用作治療藥劑的IL-7特別易于觸發(fā)抗IL-7的免疫原性(抗IL-7的結(jié)合或中和抗體)。這種免疫原性對于蛋白的長期治療活性是有害的?？笽L-7抗體可以修飾IL-7的藥物動力學，并中和其治療活性。有多種IL-7同工型參與觸發(fā)抗IL-7的免疫原性，其中包括改變的多肽序列(例如氧化、還原、脫酰胺基的或截短的形式)、共價的或非共價的IL-7多聚體、例如聚集的IL-7分子等。因此，關(guān)鍵的是確定更穩(wěn)定的、更不易于分子間聚集的、更少免疫原性的、但仍然具有生物學活性的IL-7多肽和藥物物質(zhì)。事實上，盡管大多數(shù)藥物的活性與AUC參數(shù)相關(guān)，但IL-7的活性與半衰期參數(shù)、更具體來說是平均存留時間相關(guān)。發(fā)明簡述本發(fā)明公開了新的、改進的IL-7多肽、藥物物質(zhì)和組合物。更具體來說，本發(fā)明公開了新的IL-7分子種類，它具有高程度的糖基化，寡糖分布情況移向較高的分子大小，碳水化合物基團上帶有增加的唾液酸化和巖藻糖基化，并具有較低的等電點。本發(fā)明顯示出這些新的寡糖分布情況給這些新的藥物物質(zhì)賦予了改進的化學和藥物學穩(wěn)定性，以及在體內(nèi)使用后延長的藥物動力學分布情況，其特征為增加的平均存留時間(MRT)，這允許以較低的頻率計劃劑量給藥。因此，本發(fā)明提供了新的高度糖基化或超糖基化的、具有改進的性質(zhì)的IL-7多肽。本發(fā)明還公開了新的具有修飾的氨基酸序列的IL-7多肽，其中包含了人工產(chǎn)生的糖基化位點，以及公開了相應的核酸分子、載體和重組宿主或宿主細胞。本發(fā)明還涉及使用這些多肽、細胞或核酸用于哺乳動物受試者、包括人類受試者的治療性或預防性治療。因此，本發(fā)明公幵了新的活性IL-7多肽、藥物物質(zhì)和藥物組合物，它們表現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性、對蛋白水解和聚集的減少的敏感性、利于體內(nèi)的長期活性以及減少的免疫原性，從而允許在哺乳動物受試者中產(chǎn)生改進的全面的或特異性免疫反應。本發(fā)明的一個目標在于超糖基化的IL-7組合物。本發(fā)明的另一個目標在于純化的超糖基化的IL-7多肽。這種超糖基化的IL-7多肽含有至少三個N-糖基化氨基酸殘基。本發(fā)明的另一個目標涉及使用超糖基化的IL-7用于制造由該超糖基化的IL-7和可藥用的賦形劑或載體組成的藥物，用于治療哺乳動物受試者。本發(fā)明的另一個目標涉及使用超糖基化的IL-7組合物用于制造藥物，以治療哺乳動物受試者。本發(fā)明的另一個目標是在受試者中引起或刺激免疫反應的方法，包括給受試者使用有效量的超糖基化的IL-7組合物。本發(fā)明的另一個目標是離體(ex-vivo)增強T細胞的擴增的方法，該方法包括將T細胞與超糖基化的IL-7多肽或組合物相接觸，從而增強T細胞的擴增。在具體的實施方案中，超糖基化的IL-7組合物是含有至少80%、優(yōu)選在80%和95%之間的IL-7多肽的組合物，所述多肽在至少三個不同的氨基酸殘基上被糖基化的。這些殘基可以是天然存在于IL-7多肽序列中，也/或可以是人工產(chǎn)生的糖基化位點。在另一個具體的實施方案中，超糖基化的IL-7組合物是含有至少80%、優(yōu)選在80%和95%之間的IL-7多肽的組合物，所述多肽在從三到八個不同的氨基酸殘基上被糖基化的，其中的糖基化位點包括一個O-和最多七個N-糖基化位點。這些殘基可以是天然存在于IL-7多肽序列中，也/或可以是人工產(chǎn)生的N-糖基化位點。在這方面，本發(fā)明的另一個目標涉及具有修飾的氨基酸序列的IL-7多肽，其中該序列含有至少一個人工產(chǎn)生的糖基化位點。根據(jù)特定的實施方案，本發(fā)明的IL-7多肽含有1、2、3或4個人工產(chǎn)生的糖基化位點，更優(yōu)選為l、2或3個；更優(yōu)選為1或2個。正如將被進一步公開的那樣，人工產(chǎn)生的糖基化位點優(yōu)選為N-連接的糖基化位點。本發(fā)明的IL-7多肽可以來自任何哺乳動物來源，特別是人類來源。此外，這樣的IL-7多肽可以包含成熟的IL-7多肽的序列，或者進一步含有其它的氨基酸殘基，例如分泌肽。此外，或者可選的，IL-7多肽優(yōu)選是包含下列三個二硫橋的特定的構(gòu)象異構(gòu)體Cys:1-4(Cys2-Cys92);2-5(Cys34-Cysl29);3-6(Cys47-Cys141)。這樣的修飾的IL-7多肽的具體的例子含有至少一個在后面的表1中公開的氨基酸修飾，或是它們的組合。本發(fā)明的另一個目標在于編碼上面討論的IL-7多肽的核酸分子。核酸分子可以是任何DNA或RNA分子，典型為cDNA分子。本發(fā)明的另一個目標在于編碼分泌信號、包含SEQIDNO:19的核酸分子。本發(fā)明的另一個目標在于含有上面定義的核酸分子的載體。載體可以是任何原核或真核載體，典型為真核載體，可以從質(zhì)粒、染色體外DNA、粘粒、病毒載體、人工染色體等中選擇。載體可以含有任何允許編碼的核酸在選定的宿主細胞中適當表達的調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、終止子、polyA、復制原點、同源區(qū)域、內(nèi)含子、基因的5'或3'非翻譯區(qū)域(UTR)等。上述的核酸和載體可以用于例如在各種感受態(tài)宿主細胞中生產(chǎn)重組的哺乳動物IL-7多肽，以及用于基因治療目的。本發(fā)明的另一個目標在于含有上面公開的核酸或載體的重組宿主細胞。這樣的重組細胞可以是原核的，也可以是、并且是更優(yōu)選的是真核的，例如酵母、昆蟲、植物或哺乳動物細胞，例如，更優(yōu)選情況下，被轉(zhuǎn)化以表達或過量表達例如來自人類來源的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或2-6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的重組宿主細胞。本發(fā)明的另一個目標在于含有上面描述的IL-7多肽、典型為超糖基化的IL-7多肽的藥物物質(zhì)。更優(yōu)選情況下，藥物物質(zhì)含有少于大約10%的無糖基化或單糖基化的IL-7多肽，和/或基本上不含有與產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)。本發(fā)明還涉及使用上述的藥物物質(zhì)來制造藥物("藥物產(chǎn)品")或藥物組合物。本發(fā)明還涉及含有有效量的上述IL-7多肽或組合物或藥物物質(zhì)以及一種或多種藥物相容載體或賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明還提供了能夠與上面定義的IL-7多肽發(fā)生特異性免疫反應的抗體及其片段或衍生物、產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞系、以及含有該抗體及其片段或衍生物的適合用于診斷、分析測試或治療的組合物。本發(fā)明的另一方面是從原核或真核宿主細胞生產(chǎn)上述的IL-7多肽的方法，以及檢測或測量這樣的IL-7多肽在樣品中的存在的方法，或?qū)悠范ㄐ缘姆椒?。在具體的情況下，生產(chǎn)上述的IL-7多肽的方法包括a)培養(yǎng)上述的重組宿主細胞，以及b)收集從該細胞產(chǎn)生的IL-7多肽。按照優(yōu)選實施方案，在允許有效的糖基化基序，特別是唾液酸殘基被加到IL-7多肽的條件下進行表達。在另一個優(yōu)選實施方案中，在維持細胞在指數(shù)生長末期的分批補料培養(yǎng)或灌注狀態(tài)下進行生產(chǎn)。這樣的條件提高了翻譯后修飾的質(zhì)量，有助于每個IL-7多肽的較高程度的唾液酸化。按照具體的實施方案，編碼核酸含有分泌信號和/或最適化的核酸序列，和/或宿主細胞是真核宿主細胞(例如哺乳動物或昆蟲或酵母細胞)。本發(fā)明的另一個目標涉及使用上面定義的或通過上述方法獲得的IL-7多肽或超糖基化的IL-7組合物，用于生產(chǎn)能夠在受試者中引起或調(diào)節(jié)免疫反應、特別是誘導延長的淋巴細胞生成刺激和/或放大免疫反應的藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用上面定義的或通過上述方法獲得的IL-7多肽，用于生產(chǎn)防止或治療與免疫缺陷有關(guān)的疾病的藥物組合物。正如將在下面討論的那樣，本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出了延長的血漿半衰期和平均存留時間，這有利于體內(nèi)受體相互作用和活性、和/或改進的穩(wěn)定性和/或較低的長期免疫原性，從而允許它們用于在哺乳動物受試者、特別是人類受試者中治療各種病理狀況。圖1:質(zhì)粒ph-pgk.EP7-hlL-7:eflapA:"延伸因子1a"polyA序列；hghpA:"人類生長激素"polyA序列；SpA:合成的polyA序列；hph:潮霉素抗性；Amp:氨芐青霉素抗性；MARrabbit3珠蛋白推測的兔P珠蛋白(基質(zhì)結(jié)合區(qū))；pr.Tk:胸苷激酶啟動子；sv40enh.:sv40增強子；prpgk:磷酸甘油酯激酶啟動子；5'UTRintl:含有嵌合的內(nèi)含子(hB珠蛋白-免疫球蛋白)的5，非翻譯區(qū)；EP7-hlL7:上游含有EP7信號肽的最適化的人類IL-7cDNA。圖2:質(zhì)粒pBh-pgk.EP7-hlL-7:Bcl2:Bcl2cDNA;IRES:內(nèi)部核糖體插入位點圖3:在生物反應器中培養(yǎng)1天(D1)到10天(D10)的哺乳動物細胞中重組hlL-7的表達，細胞內(nèi)的與分泌的IL-7的Westen印跡比較圖4:在整個純化過程中rec-hlL-7糖基化形式的層析分級分離不同洗脫級份(B1-B10)中蛋白含量的SDSPAGE分析。IL-7糖基化形式在捕獲和HIC步驟中被分離。使用緩沖液梯度以按照它們輕微不同的物理化學性質(zhì)分別洗脫hIL-7的糖基化形式。對足夠級份的分級分離以及隨后的選擇允許富集全部三種糖基化的重組WL-7(3N-或2N-以及l(fā)O-糖基團)。MWM，蛋白分子量標準(10;15;20;25;37;50;75;100;150;250kDa);Bl-BlO，洗脫級份；Bl-B4，留下來用于進一步純化的洗脫級份；CT，從用同樣的最適化的hlL-7cDNA轉(zhuǎn)染的HEK293細胞株的培養(yǎng)物獲得的級份B1。圖5:純化的重組hlL-7在SDSPAGE上的分析。純化的重組hlL-7的樣品在還原條件下被上樣SDSPAGE。凝膠通過下列方法顯示A.考馬斯染色B.Western印跡MWM:分子量標準(10;15j20j25537;50j75s100j150;250kDa)。1道HG-37-147;2道HG-40隱104;3道HG-hlL-7;4道E.colihlL-7。圖6:純化的糖基化rec-hlL-7產(chǎn)物的SDS-PAGE表觀分子量的比較。M道=分子量標準，1道=Namen等在專利#US5328988中描述的純化產(chǎn)物(大約25KDa)的示意圖，2道-申請者純化的CHOrec-sIL-7產(chǎn)物，3道=申請者純化的CHOrec-hlL-7產(chǎn)物，4道=hlL-71N-和2N-糖基化形式作為表觀分子量比較的標準，5道=申請者純化的大腸桿菌rec-hlL-7產(chǎn)物(CYT99007)。圖7:純化的重組人類IL-7在脫糖基化后在還原條件下在SDSPAGE上的分析。純化的重組糖基化人類IL-7樣品用PNGaseF消化從2分鐘到24小時的動力學樣品上樣在凝膠上。另一個樣品(00/N)用PNGaseF+0-糖苷酶/(1-4)半乳糖苷酶/神經(jīng)氨酸酶/N-乙酰氨基葡糖苷酶消化24小時以上。糖基化人類IL-7和大腸桿菌人類IL-7作為對照上樣在凝膠上。然后將3N+10、2N+10、1N+10、IO糖基化形式和脫糖基化的人類IL7按照它們估計的MW在凝膠上分離，分別為33、27、24、18和17kDa。圖8:不同的純化的rec-hlL-7糖基化形式的質(zhì)譜分析。-23kDa(23179Da):Rec-hlL-7(CHOS，2N+3N)-25kDa(25127Da):Rec-hlL-7(CHOS，3N)圖9:純化的重組超糖基化的人類IL-7多肽的二維電泳分析。在等電聚焦(pH范圍3-10)之后，糖基化的形式在還原條件下在SDSPAGE上分離(考馬斯亮藍染色)。圖10:重組的hlL-7N-聚糖復雜性的質(zhì)譜分析。純化的糖基化的hlL-7樣品用內(nèi)切糖苷酶例如肽-N-糖苷酶(PNGaseF,Roche)進行酶法消化。酶法消化釋放的N-連接的寡糖、釋放的蛋白樣品從肽結(jié)構(gòu)上分離出來，通過MALDI-TOF質(zhì)譜進行分析。在國際數(shù)據(jù)庫中搜索相應每個峰的m/z值，這允許準確地鑒定hlL-7分子上的N-聚糖的名單。圖11:在重組hlL-7上使用特異性外源凝集素(外源凝集素印跡)研究O-聚糖的性質(zhì)。在分離蛋白樣品并與轉(zhuǎn)印到膜上之后，使用兩種外源凝集素(MAA，來自Maacfo'aamwre"Ws;PNA，來自^rac/u's/^pogea)中的任何一種來顯示產(chǎn)物。1道標準蛋白胎球蛋白，這是一種唾液酸化的蛋白；2道用唾液酸酶處理的胎球蛋白；道3:hlL-7;道4:用唾液酸酶處理的hlL-7。圖12:超糖基化的IL-7多肽的外源凝集素親和性(ELISA篩選)。夕卜源》疑集素(來自Z^yco/7er57'co"escw/e"/"m的LEA，來自7>Wcwwvw/g"re的WGA，來自L7e;cewro;ewj的UEA.L來自Maackiaamurensis的MAA，來自y4聽ra威iwcflwc/ato的ACA，來自/4rtocaT尸w51^ergn/o/,fl的AIA，來自v4gan'c"51Ws/7on^的ABA，來自尸Aaseo/iwv"/gan\s的PHA丄)包被的平板被用于結(jié)合同樣量的重組的純化的WL-7制備物。結(jié)合的IL-7的量依賴于外源凝集素與聚糖基團的特異性，通過與生物素偶聯(lián)的特異的抗hlL-7抗體(Ab)來顯示。外源凝集素-IL-7-Ab夾心結(jié)構(gòu)用鏈親和素-過氧化物酶結(jié)合物顯示。圖13:重組人類IL-7活性的生物分析。PB-1細胞生長的劑量反應性動力學被未糖基化的PhlL-7(在大腸桿菌中表達)或高度糖基化的r-hlL-7(在哺乳動物細胞中生產(chǎn))所誘導。圖14:重組人類IL-7活性的生物分析。在典型的生物分析中常規(guī)地獲得了劑量反應性的動力學數(shù)據(jù)和曲線PB-1細胞生長被未糖基化的r-hlL-7(在大腸桿菌中表達)、高度糖基化的或超糖基化的r-hlL-7(在哺乳動物細胞中生產(chǎn))所誘導。(數(shù)據(jù)點代表三次測定的平均值土SD)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及超糖基化的IL-7組合物、它們的生產(chǎn)以及在藥物工業(yè)中的應用。本發(fā)明第一次顯示了依賴于多肽的糖基化情況，IL-7的活性和/或性質(zhì)可以被增強。本發(fā)明還令人吃驚地公開了，與體外數(shù)據(jù)相反，在體內(nèi)，具有至少2個到優(yōu)選3個被占據(jù)的N-連接的糖基化位點和一個O-連接的糖基化位點以及最大化的寡糖基團的末端唾液酸化的IL-7，可以獲得最好的活性。本發(fā)明還公開了人工產(chǎn)生的超糖基化的IL-7多肽，它表現(xiàn)出延長的活性(從而允許減少的給藥頻率)，和/或降低的長期免疫原性。至于IL-7的應用，這樣的多肽和組合物代表了高度有價值和有用的活性分子，可用于在受試者、包括人類受試者中調(diào)節(jié)免疫反應。因此，本發(fā)明的第一個目標在于超糖基化的IL-7組合物。本發(fā)明的另一個目標涉及使用超糖基化的IL-7，用于制造由該超糖基化的IL-7和至少一種可藥用的載體或賦形劑組成的藥物，以治療哺乳動物受試者。本發(fā)明的另一個目標是在受試者中引起或刺激免疫反應的方法，包括給受試者使用有效量的超糖基化的IL-7組合物。本發(fā)明的另一個目標涉及使用超糖基化的(優(yōu)選高度唾液酸化的)IL-7組合物，用于制造在受試者中引起或剌激免疫反應的藥物。IL-7多肽在本發(fā)明的上下文中，"IL-7多肽"是指哺乳動物(例如人類、猿、牛、馬、貓或狗)的IL-7多肽。更優(yōu)選情況下，IL-7多肽是人類IL-7多肽，特別可用作治療藥物或疫苗。此外，特別是用于非人類靈長動物實驗或獸醫(yī)應用中時，IL-7多肽可以是任何其它的哺乳動物IL-7多肽，例如猿的IL-7多肽或狗的IL-7多肽。本發(fā)明的優(yōu)選的人類IL-7多肽包含在EP314415或WO2004/018681A2中描述的氨基酸序列，以及它們的任何天然變異體和類似物。人類IL-7的序列也可以從基因庫中獲得。典型的野生型蛋白含有152個氨基酸，并且也可以含有另外的N-末端甲硫氨酸殘基(SEQIDNO:l)。更優(yōu)選情況下，其變異體包括由天然多態(tài)性引起的天然的等位基因變異體，包括SNPs、剪接變異體等。在具體的實施方案中，術(shù)語IL-7多肽是指具有SEQIDNO:l的序列的多肽或其天然變異體。在另一個實施方案中，IL-7多肽是狗的IL-7多肽。在這一方面，本發(fā)明第一次公開了分離的IL-7多肽的序列，這代表了本發(fā)明的另一個目標。具體來說，本發(fā)明涉及含有在SEQIDNO:7中描述的氨基酸序列的IL-7多肽，以及其任何天然變異體、類似物或獨特的片段。術(shù)語"變異體"或"類似物"是指與SEQIDNO:7不同的多肽，具有一個或有限數(shù)量的氨基酸缺失、置換或添加。優(yōu)選情況下，這樣的變異體或類似物顯示出與SEQIDNO:7具有大于S5。/。、優(yōu)選大于90%、優(yōu)選大于95%、最優(yōu)選大于98%的一致性百分數(shù)。在本發(fā)明中使用的IL-7多肽優(yōu)選為重組的IL-7。本文中使用的術(shù)語"重組的"是指多肽是從重組表達系統(tǒng)獲得或衍生的，即來自被工程化而含有為IL-7多肽編碼的核酸分子的宿主細胞(例如微生物或昆蟲或植物或哺乳動物)的培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)基因植物或動物。"微生物的"是指在細菌表達系統(tǒng)中制造的重組蛋白。"哺乳動物的"是指在哺乳動物表達系統(tǒng)中制造的重組糖蛋白。正如將在下面討論的那樣，所有這些宿主細胞優(yōu)選將天然地或在轉(zhuǎn)基因后表達適合的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因。IL-7多肽也可以通過在體外或體內(nèi)使用適當?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶和/或唾液酸轉(zhuǎn)移酶分子、或通過接枝寡糖結(jié)構(gòu)來糖基化。人類IL-7多肽的一個具體例子是SEQIDNO:1中的多肽，含有二硫橋Cys2-Cys92、Cys34-Cys129和Cys47-Cys141。本發(fā)明的IL-7多肽也可以含有成熟的IL-7多肽的序列，或者進一步含有其它的氨基酸殘基，例如分泌肽。這樣的分泌肽的優(yōu)選的例子包括但不限于從含有EPO信號肽、SEAP信號肽、IgGic信號肽、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白/玻璃粘連蛋白信號肽、VIP/玻璃粘連蛋白信號肽和cytostatinbis信號肽的組中選擇的信號肽。這些信號肽的系列分別顯示在SEQIDNO13到18中。在具體的實施方案中，信號肽是由發(fā)明人在從EPO和IL-7信號肽衍生的序列之間制成的雜交體結(jié)構(gòu)。該信號肽被命名為EPy7或EP7，其序列被顯示在SEQIDNO:19中，代表了本發(fā)明的一個特定的目標。超糖基化的IL-7和組合物在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"超糖基化的IL-7"是指具有至少三個被占據(jù)的糖基化位點、即具有至少三個糖基化的氨基酸殘基的IL-7多肽。"糖基化位點"是指多肽中被糖基化的、即與糖結(jié)構(gòu)結(jié)合的任何氨基酸殘基或區(qū)域。這樣的位點典型為N-糖基化位點(即多肽中任何允許通過N-連接與糖結(jié)構(gòu)結(jié)合的氨基酸殘基或區(qū)域)和/或O-糖基化位點(即多肽中任何允許通過O-連接與糖結(jié)構(gòu)結(jié)合的氨基酸殘基或區(qū)域)。糖基化位點的共有序列在本
技術(shù)領域：
中是眾所周知的。例如，共有的N-糖基化位點典型具有下列結(jié)構(gòu)Asn-X-Ser/Thr,其中的X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。正如將在下文中公開的那樣，這樣的糖基化位點可以天然存在于IL-7多肽序列中，和/或人工添加或產(chǎn)生在該序列中。術(shù)語"超糖基化的IL-7組合物"是指其中至少80%的IL-7多肽具有至少三個被占據(jù)的糖基化位點、即具有至少三個糖基化的氨基酸殘基的IL-7組合物。優(yōu)選情況下，這樣的組合物含有至少80%的IL-7多肽，它們在至少三個N-糖基化位點以及可選的一個O-糖基化位點上被糖基化。最優(yōu)選情況下，這樣的組合物基本上不含未糖基化或單糖基化的IL-7多肽，因此含有最多20。/。的雙糖基化的IL-7多肽。在優(yōu)選實施方案中，超糖基化的IL-7組合物是指其中至少90%的IL-7多肽在三個N-糖基化位點以及可選的一個0-糖基化位點上被糖基化的IL-7組合物。最優(yōu)選情況下，這樣的組合物基本上不含未糖基化或單糖基化的IL-7多肽，因此含有最多10。/。的帶有或不帶有單-0-糖基化的雙-N-糖基化的IL-7多肽。IL-7的一級氨基酸序列含有三個推測的N-糖基化位點，它們是70、91和116位(相對于人類野生型序列而言，參見SEQIDNO:l)上的天冬酰胺(Asn)殘基。此外，本發(fā)明顯示出IL-7序列也含有一個0-糖基化位點，即IIO位上的蘇氨酸(Thr)殘基。在特定的實施方案中，本發(fā)明的超糖基化的IL-7多肽是具有上述三個被占據(jù)的N-糖基化位點以及帶有或不帶有一個被占據(jù)的O-糖基化位點的IL-7多肽，超糖基化的IL-7組合物是其中至少80%的IL-7多肽在上述的N-糖基化位點和可選的也在O-糖基化位點被糖基化的IL-7組合物。在具體的實施方案中，超糖基化的IL-7多肽可以含有其它人工添加或產(chǎn)生的糖基化位點。因此，本發(fā)明的超糖基化的IL-7多肽是具有至少三個被占據(jù)的N-糖基化位點和一個被占據(jù)的O-糖基化位點的IL-7多肽，這些位點或者是天然發(fā)生的，也可以是/或人工添加/產(chǎn)生的；超糖基化的IL-7組合物是其中至少80%的IL-7多肽在至少4個糖基化位點被糖基化的IL-7組合物，這些位點或者是天然發(fā)生的，也可以是/或人工添加/產(chǎn)生的。在這一方面，本發(fā)明現(xiàn)在公開了具有修飾的氨基酸序列的IL-7多肽，其中該序列含有至少一個人工產(chǎn)生的糖基化位點。按照具體的實施方案，本發(fā)明的IL-7多肽包含1、2、3或4個人工產(chǎn)生的糖基化位點，更優(yōu)選l、2或3個、更優(yōu)選1或2個糖基化位點。人工產(chǎn)生的糖基化位點優(yōu)選為N-連接的糖基化位點。共有的N-糖基化位點典型具有下面的結(jié)構(gòu)Asn-X-Ser/Thr，其中的X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。糖基化位點可以從裝配的合成的寡聚核苷酸通過化學方法、或者使用幾種技術(shù)包括誘變方法以及下面的本
技術(shù)領域：
中現(xiàn)有的技術(shù)在IL-7—級氨基酸序列中的不同位置產(chǎn)生或添加。因為修飾的IL-7多肽將保留與IL-7受體結(jié)合的能力，糖基化位點最優(yōu)選產(chǎn)生在IL-7多肽序列的不改變IL-7與IL-7受體的結(jié)合能力的區(qū)域或結(jié)構(gòu)域中。最優(yōu)選情況下，位點被導入到多肽的a螺旋之外，優(yōu)選除了在甘氨酸殘基的最鄰近點之外。優(yōu)選情況下，它們被導入到最柔性的區(qū)域，避開更剛性和對多肽的三級結(jié)構(gòu)重要的區(qū)域。優(yōu)選情況下，糖基化位點的產(chǎn)生不影響任何參與二硫鍵的半胱氨酸殘基(例如Cys2、34、47、92、129和141)，也不影響任何參與IL-7多肽與其關(guān)聯(lián)的受體的相互作用的關(guān)鍵殘基(例如Ser19、Leu23和77、Tyr12、Val15、Gln22、Lys81和Glu84)，也不影響任何參與多肽活性的保守殘基(例如Argl33、Gln136、Glu137、Lys139和144、Thr140和Asn143)。糖基化位點典型地通過在對照IL-7多肽的一級序列中通過一個或幾個氨基酸殘基的突變、缺失或添加來產(chǎn)生，從而產(chǎn)生典型的共有糖基化位點。在具體的實施方案中，本發(fā)明涉及含有人類(或哺乳動物)IL-7多肽的IL-7多肽，該多肽含有一個或幾個從Lys28Asn-11e30Ser-I固Thr-Ue30Asn-Ser32Thr-Leu35Ser-Leu35Thr-Glu38Ser-Glu38Thr-Phe39Ser-Phe39Thr-Phe42Ser-Phe42Thr-Glu52Ser-Glu52Thr-Val82Asn國Glu84Thr-Glu84Ser-Lys97Asn-Arg99Thr-Arg99Ser-Alal02Asn-Leul04Thr-Leul04Ser-Leul04Asn-G固6Thr-Glul06Ser-Leul28Ser-Leul28Thr-11el45Asn-Metl47Thr-Metl47Ser-Metl47Asn-Thrl49Ser(或從其它哺乳動物IL-7多肽中對應的位置)中選擇的氨基酸修飾。本發(fā)明的(人類)IL-7多肽的具體例子包括在下面的表1中公開的氨基酸修飾表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>上面的氨基酸修飾產(chǎn)生N-糖基化位點而基本上不改變IL-7的結(jié)合親和性，從而產(chǎn)生了本發(fā)明的改進的IL-7多肽。術(shù)語"基本上不改變結(jié)合親和性"是指結(jié)合親和性沒有被改變，或者可能被減小，但不影響由與受體相互作用而產(chǎn)生的體內(nèi)效應。當在體外定量時，結(jié)合親和性可以被減少小于50°/。、優(yōu)選小于40%、優(yōu)選小于30°/。、優(yōu)選小于20%、優(yōu)選小于5%。上面的修飾也可以被組合以在本發(fā)明的IL-7多肽中產(chǎn)生幾個其它的糖基化位點。在這一方面，本發(fā)明涉及了具有通過添加了至少1個到4個其它的(N-連接)糖基化位點而修飾的(人類或哺乳動物)白介素-7的一級序列的任何生物活性的IL-7多肽。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是含有包含了一個或兩個其它的(N-連接的)糖基化位點的白介素-7的一級序列的生物活性IL-7多肽。本發(fā)明的最優(yōu)選的IL-7多肽是生物活性的，即它們能夠與白介素-7受體結(jié)合，在特定的生物分析中顯示出體外活性，和/或在體內(nèi)具有增加的平均存留時間(MRT)。在劑量/反應生物分析研究中進行了未糖基化的標準品與超糖基化的IL-7的活性的比較，其中ED50值對應的劑量等于最大活性的一半。超糖基化通常在生物分析中導致減小的活性，但沒有轉(zhuǎn)變成體內(nèi)活性的減小。在目前狀態(tài)下，擴展的動力學分布情況事實上將提高體內(nèi)活性。盡管ED50不反映IL-7的體內(nèi)活性，它允許在具有同樣的糖基化水平的不同樣品之間進行比較。在這種框架下，未糖基化的標準品的典型的ED50值范圍在0.5到2.0ngIL-7/ml之間，而超糖基化的ED50的值范圍在1.5到3.5ng超糖基化IL-7/ml之間。本發(fā)明的超糖基化IL-7多肽顯示出改進的穩(wěn)定性、體內(nèi)延長的半衰期和在哺乳動物宿主中延長的平均存留時間。術(shù)語"改進的穩(wěn)定性"、"延長的半衰期和平均存留時間"應該被理解為是與未糖基化的形式相比較。優(yōu)選情況下，半衰期的增加至少是大約3倍，優(yōu)選至少大約5到20倍。平均存留時間(MRT)是指在第一次用藥之后每個IL-7分子在病人血液中存留時間的平均值。優(yōu)選情況下，與未糖基化的形式的MRT相比，MRT的增加至少為大約2倍，或優(yōu)選至少大約4到10倍。例如，超糖基化的形式的血漿半衰期被顯示為在30到40小時的范圍內(nèi)，而未糖基化形式的血漿半衰期通常為5到8小時(兩種形式在相同的條件下被給藥，即在一次皮下注射中同時給藥)。平均存留時間(MRT)是大約40小時，而未糖基化的形式是大約10小時。應該理解，本發(fā)明也涵蓋了本發(fā)明的IL-7多肽的任何獨特片段，即任何含有上面公開的氨基酸修飾的片段，或任何含有上面公開的人工產(chǎn)生的糖基化位點的片段。這樣的片段典型地含有至少5個氨基酸殘基，典型地至少8、9、10、11、12或15個殘基，并可以含有多達20、30、40、50或更多的連續(xù)的氨基酸殘基。這樣的片段可以用作拮抗物或免疫原，以產(chǎn)生特異性抗體。此外，盡管上面的氨基酸位置是參照人類IL-7多肽序列給出的，應該理解本發(fā)明也涵蓋了具有通過在哺乳動物序列中基于對人類序列的序列比對進行同源突變而修飾的哺乳動物IL-7的一級序列的IL-7多肽。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及新的生物活性IL-7多肽，其中含有從包含下列修飾的組中選擇的一個或幾個氨基酸修飾.-Phe39Ser-Phe39Thr-Phe42Ser-Phe42Thr-Leul04Asn-G函6Thr-Glul06Ser-Leul28Ser-Leul28Thr-Metl47Asn及其組合，或其獨特的片段。本發(fā)明的最優(yōu)選的修飾的IL-7多肽被公開在下面的表2中表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>本發(fā)明的另一個具體的目標是含有上面公開的一級氨基酸序列的超糖基化的IL-7多肽。寡糖單位在本發(fā)明的超糖基化的IL-7多肽中結(jié)合到特定的糖基化位點上的寡糖單位的結(jié)構(gòu)和數(shù)量可以是變化的。它們可以是例如N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和/或唾液酸。更優(yōu)選情況下，超糖基化的IL-7多肽含有(或富集了)從下面選擇的N-連接的和/或O-連接的糖鏈a)哺乳動物類型的糖鏈，優(yōu)選為CHO細胞表達的類型；b)含有復雜的N-糖鏈(例如三天線(triantenary)或二天線(biantenary)結(jié)構(gòu))的糖鏈，更優(yōu)選含有高含量的甘露糖和乙酰葡糖胺分子和高含量的末端唾液酸殘基；c)含有O-糖鏈，沒有但優(yōu)選具有末端唾液酸殘基的糖鏈；d)被a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶或a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸化的糖鏈；和/或e)顯示出3到30個之間的唾液酸基-N-乙酰半乳糖胺的唾液酸化的糖鏈，優(yōu)選為7到23個。特別優(yōu)選的糖鏈含有三天線或二天線結(jié)構(gòu)，具有部分或完全的末端唾液酸化。另一個優(yōu)選的糖鏈含有三天線結(jié)構(gòu)和三或雙唾液酸化，和/或具有雙唾液酸化的二天線結(jié)構(gòu)。這樣的糖的例子被公開在表4中，包括基序#2420、2623、2785和3092。根據(jù)另一個具體的實施方案，本發(fā)明的超糖基化的白介素-7多肽具有低于6.5的平均等電點和超過27kDa，在28KDa和65KDa之間(7N+10糖基化的理論值)的平均表觀分子量，優(yōu)選在28KDa和35KDa之間(正如3N十IO糖基化所顯示的那樣)，這是通過凝膠電泳測定的(通過Western印跡印證)，所述分子量通過質(zhì)譜分析檢測為25kDa。在具體的實施方案中，本發(fā)明的超糖基化的IL-7多肽由哺乳動物糖基化突變體生產(chǎn)，該突變體穩(wěn)定地表達a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，并存在CMP-Neu5Ac水解酶活性缺陷，優(yōu)選為CHO糖基化突變體。這樣的糖基化典型包括N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和/或唾液酸。在另一個實施方案中，超糖基化的IL-7多肽通過重組技術(shù)在人類宿主細胞中產(chǎn)生，該宿主細胞可以從人類基質(zhì)或上皮細胞系、HEK-293(人類胚胎腎)、HER(人類胚胎視網(wǎng)膜)、HEK(人類表皮角質(zhì)細胞)、人類胸腺或人類皮質(zhì)上皮細胞系、人類骨髓或人類骨髓基質(zhì)細胞株中選擇。本發(fā)明的最優(yōu)選的超糖基化白介素-7多肽顯示出下列特點a)它們在重組生產(chǎn)細胞株中具有改進的分泌分布情況和生產(chǎn)率；和/或b)它們每個IL-7多肽含有高度的唾液酸殘基，導致降低了等電點值并改進了平均存留時間；禾口/或c)它們被保護免于分子間聚集；和/或d)它們對蛋白水解作用具有減少的易感性；禾P/或e)它們含有被掩蓋的抗原位點，反映出減小的免疫原性傾向，減小的對APC(抗原呈遞細胞)捕獲、被MHCII分子加工和呈遞的易損性(vulnerability);禾口/或f)它們具有增加的化學穩(wěn)定性；和/或g)它們與未糖基化的父本肽相比具有延長的體內(nèi)生物學半衰期(IL-7的長作用同工型)；和/或h)與未糖基化的父本蛋白相比，它們具有增加的體內(nèi)藥物活性，這主要是由于較好的平均存留時間(MRT);和/或i)它們允許較低頻率的給藥方案，從每星期3/4次降低到每星期兩次或一次，或?qū)ΩL效產(chǎn)品來說每兩星期一次；和/或j)它們顯示出改進的藥物動力學情況(減少的峰濃度和改進的平均存留時間)，和/或k)它們顯示出通過質(zhì)譜分析確定的平均分子量大于25KDa，或通過SDS-PAGE確定的平均分子量大于27KDa，平均等電點低于6.5。本發(fā)明的多肽可以是單體的形式，或者與選定的特定化合物結(jié)合或復合。在這一方面，在特定的實施方案中，IL-7構(gòu)象異構(gòu)體與肝細胞生長因子("HGF")結(jié)合形成異源二聚體。異源二聚體可以通過絡合作用化學獲得，或通過重組技術(shù)(即通過遺傳融合)獲得。在另一個特定實施方案中，IL-7多肽與IgG重鏈的Fc部分在功能上相連，典型是通過肽鉸鏈區(qū)。這樣的融合分子潛在地增加了體內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期。最優(yōu)選的IgG基團是人類IgGl或IgG4。在另一個特定的實施方案中，IL-7多肽與人類血清白蛋白("HSA")或HSA的一部分在功能上相連成為融合蛋白。這樣的融合分子潛在地增加了體內(nèi)穩(wěn)定性并延長了半衰期。本發(fā)明的另一個目標是超糖基化的IL-7組合物。這樣的組合物優(yōu)選含有至少80%、優(yōu)選在80%到95%之間的的IL-7多肽，所述多肽在至少三個不同的氨基酸殘基上被糖基化，糖基化位點可以是天然存在于IL-7多肽序列中(例如共有的N-連接和O-連接糖位點)，也可以/或是人工產(chǎn)生的糖基化位點，正如前面討論的那樣。按照具體的特定實施方案，本發(fā)明涉及的超糖基化的IL-7組合物包含a)大部分(〉80%，優(yōu)選大于卯％，最優(yōu)選大于大約95%)為白介素-7，它們在3個共有的N-連接糖位點(Asn70/91/116)上被糖基化，在l個O-連接糖位點(Thrl10)上被糖基化或未糖基化；優(yōu)選情況下，組合物含有少量(<20%，優(yōu)選少于大約10%)只在(與或不與1個O-連接糖位點相連的)2個共有的N-連接糖位點上被糖基化的白介素-7，和/或組合物基本上不含有單糖基化或未糖基化的蛋白；或b)大部分(〉80%，優(yōu)選大于卯％，最優(yōu)選大于大約95%)為生物活性白介素-7類似物，具有修飾的IL-7—級氨基酸序列，引入了另一個糖基化位點，總共在4個N-連接的糖位點上以及另外在或不在1個O-連接糖位點上(Thrl10)被糖基化；優(yōu)選情況下，組合物含有少量(<20%，優(yōu)選少于大約10%)同樣的類似物，所述類似物只在(與或不與1個0-連接糖位點相連的)3或2個N-連接糖位點上被糖基化，和/或組合物基本上不含有單或未糖基化的蛋白；或c)大部分(>80%，優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于大約95%)為白介素-7生物活性類似物，具有修飾的IL-7—級氨基酸序列，引入了另兩個糖基化位點，總共在5個N-連接的糖位點上以及另外在或不在1個O-連接糖位點上(Thrl10)被糖基化；優(yōu)選情況下，組合物含有少量(<20%，優(yōu)選少于大約10%)同樣的類似物，所述類似物只在與或不與1個O-連接糖位點相連的4、3或2個N-連接糖位點上被糖基化，和/或組合物基本上不含有單糖基化或未糖基化的蛋白；或d)大部分(>80%，優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于大約95%)為白介素-7生物活性類似物，具有修飾的IL-7—級氨基酸序列，引入了另三個糖基化位點，總共在6個N-連接的糖位點上以及另外在或不在1個O-連接糖位點上(Thrl10)被糖基化；優(yōu)選情況下，組合物含有少量(<20%，優(yōu)選少于大約10%)同樣的類似物，所述類似物只在與或不與1個O-連接糖位點相關(guān)的5、4、3或2個N-連接糖位點上被糖基化，和/或組合物基本上不含有單糖基化或未糖基化的蛋白；或e)大部分(〉80%，優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于大約95%)為白介素-7生物活性類似物，具有修飾的IL-7—級氨基酸序列，引入了另四個糖基化位點，總共在7個N-連接的糖位點上以及另外在或不在1個O-連接糖位點上(Thrl10)被糖基化；優(yōu)選情況下，組合物含有少量(<20%，優(yōu)選少于大約10%)同樣的類似物，所述類似物只在與或不與1個O-連接糖位點相關(guān)的6、5、4、3或2個N-連接糖位點上被糖基化，和/或組合物基本上不含有單糖基化或未糖基化的蛋白。本發(fā)明還涉及了含有上述的作為活性物質(zhì)的組合物的藥物組合物。核酸本發(fā)明的另一個目標在于編碼上面討論的IL-7多肽的核酸分子。核酸分子可以是任何DNA或RNA分子，典型為cDNA分子。本發(fā)明的具體的目標是含有SEQIDNO:2從79位到結(jié)束的核苷酸殘基的核酸，及其獨特的片段和互補鏈。本發(fā)明的另一個目標是含有SEQIDNO:4的核酸，及其任何獨特的片段、其變異體(與SEQIDNO:4具有至少90y。的一致性)、及其互補鏈。本發(fā)明的另一個目標是含有SEQIDNO:6的核酸，及其任何獨特的片段、其變異體(與SEQIDNO:6具有至少90y。的一致性)、及其互補鏈。本發(fā)明的具體的目標是含有SEQIDNO:6從79位到結(jié)束的核苷酸殘基的核酸，及其變異體(與SEQIDNO:6具有至少90Q/。的一致性)、及其互補鏈。本發(fā)明也涵蓋了由這樣的序列(例如SEQIDNO:7)所編碼的多肽。上面使用的術(shù)語"變異體"對于核酸來說，更具體是指能夠在嚴緊條件下與參比序列雜交的核苷酸序列，和/或編碼與參比序列編碼的多肽具有同樣類型的活性的多肽的核苷酸序列。最優(yōu)選情況下，變異體與參比序列相比表現(xiàn)出至少在92%和99%之間(例如92%、93%、94%、95%、96°/。、97%、98%或99°/。的一致性。本發(fā)明的另一個具體的目標是含有下列序列的核酸CTGAATAACGAAACTAACSEQIDNO:8AACTTCACTAAGSEQIDNO:9GCCAACGGTACCSEQIDNO:10CTGAACGACAGCTGTSEQIDNO:11，或ATCTTGAACGGGSEQIDNO:12，或它們的組合本發(fā)明的核酸的具體例子含有在SEQIDNOs:8到12任何一個中顯示的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的在于含有上面定義的核酸分子的克隆和/或表達載體。載體可以是任何原核或真核載體，典型為真核載體，可以從質(zhì)粒、粘粒、病毒載體、人工染色體等中選擇。載體可以含有任何允許編碼核酸在選定的宿主細胞中適當表達的調(diào)控序列，例如啟動子、終止子、polyA、復制原點、整合區(qū)域(例如同源區(qū)域)、內(nèi)含子、UTR序列、標記物基因等。本發(fā)明的一個具體的目標是含有上面定義的核酸分子的表達載體，包括信號肽，可操作地連接到調(diào)控元件以允許該核酸在哺乳動物宿主或宿主細胞中表達。優(yōu)選的調(diào)控元件包括啟動子，它可以從病毒、細胞和合成啟動子中選擇，但不限于此，包括組成型的、組織特異性的或受調(diào)節(jié)的啟動子，特別是選自CMV啟動子、E1F啟動子和金屬硫蛋白啟動子的啟動子。其它可以被包含在本發(fā)明的載體中的調(diào)控元件包括但不限于Bcl-2基因、UTR序列和MAR序列。在優(yōu)選實施方案中，載體是游離的表達載體。上述的核酸和載體可以用于例如在各種感受態(tài)宿主或宿主細胞中生產(chǎn)重組哺乳動物IL-7多肽，以及用于基因治療目的。本發(fā)明的另一個目標在于含有上面公開的核酸或載體的重組宿主細胞。這樣的重組細胞可以是原核的，或更有選是真核的，例如酵母、昆蟲、植物或哺乳動物細胞。在優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞，優(yōu)選從PERC6、NSO細胞和BHK細胞中選擇，優(yōu)選為CHO細胞，或人類細胞系。載體、構(gòu)建物和重組細胞將在本申請的后面部分中更詳細地公開，但不限于此。藥物物質(zhì)和藥物組合物本發(fā)明的另一個目標在于含有所需產(chǎn)物，即上面描述的IL-7多肽、典型為超糖基化的IL-7多肽的藥物物質(zhì)。更優(yōu)選情況下，藥物物質(zhì)含有少于大約10%的未糖基化或單糖基化的工-7多肽，并且/或基本上不含與產(chǎn)物有關(guān)的雜質(zhì)。本發(fā)明還涉及使用上述的藥物物質(zhì)生產(chǎn)藥物("藥物產(chǎn)品")或藥物組合物。優(yōu)選的藥物物質(zhì)還基本上不含與處理相關(guān)的雜質(zhì)。在本發(fā)明中，術(shù)語"藥物物質(zhì)"是指適合用作藥物的活性要素的產(chǎn)品。本發(fā)明的"藥物物質(zhì)"在本質(zhì)上是復合產(chǎn)品，即作為其生產(chǎn)方法(例如重組DNA技術(shù))的結(jié)果。本發(fā)明現(xiàn)在揭示，為了產(chǎn)生有效的治療和疫苗增強效應，IL-7藥物物質(zhì)或藥物組合物應該含有超糖基化的IL-7多肽組合物作為主要的分子種類。本文中使用的術(shù)語"基本上不含"是指藥物物質(zhì)不含顯著量或有害量的與產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)和與處理方法相關(guān)的雜質(zhì)。更具體來說，藥物物質(zhì)將含有少于5%、更優(yōu)選少于、更優(yōu)選少于2%的與產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)和與處理方法相關(guān)的雜質(zhì)。最優(yōu)選的藥物物質(zhì)含有少于大約1%的與產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)和僅僅痕量的與處理方法相關(guān)的雜質(zhì)。與IL-7產(chǎn)品相關(guān)的物質(zhì)是指IL-7分子變異體，包括例如有活性或無活性的IL-7肽或多肽片段。與IL-7相關(guān)的雜質(zhì)包括例如含有單或雙二硫橋的人類IL-7多肽、截短的IL-7、脫酰胺的重組IL-7、含有IL-7的二聚體或多聚體蛋白、氧化型甲硫氨酸形式或其組合。無論其生物活性如何，這些IL-7分子變異體和IL-7相關(guān)的雜質(zhì)應該嚴格地最小化或從藥物物質(zhì)中丟棄。與處理方法相關(guān)的雜質(zhì)包括DNA、內(nèi)毒素、細胞碎片、病毒等。因此，優(yōu)選的藥物物質(zhì)是其中超糖基化IL-7組合物的總重量中含有重量百分比至少為95%、優(yōu)選至少98°/。、更優(yōu)選至少99.5%的本發(fā)明的超糖基化IL-7組合物的藥物物質(zhì)。本發(fā)明還涉及了藥物組合物，其含有有效量的上面描述的藥物物質(zhì)或超糖基化的IL-7組合物以及一種或多種藥物相容或可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。本發(fā)明顯示，含有上述超糖基化的IL-7組合物的藥物組合物明顯地增加了IL-7的疫苗性質(zhì)和它刺激抗原特異性免疫反應的能力。藥物相容的或生理可接受的載體、賦形劑或稀釋劑可以從中性到微酸性、等滲的、緩沖鹽溶液或懸浮液中選擇，更優(yōu)選從蔗糖、海藻糖和氨基酸中選擇。藥物相容的載體優(yōu)選被包含在適當?shù)木彌_液中以形成等滲溶液。適合的緩沖液優(yōu)選具有的pH范圍包括在4.5到7.5之間，優(yōu)選5.0到7.0，更有選大約5.5，優(yōu)選為從檸檬酸鈉緩沖液或乙酸銨緩沖液中選擇的有機酸鹽。藥物組合物可以采取懸浮液、溶液、凝膠、粉末、固體等形式。組合物優(yōu)選為液體形式。組合物可以含有穩(wěn)定劑，例如糖、氨基酸、蛋白、表面活性劑等。組合物可以含有任何鹽溶液，包括磷酸鹽、氯化物等。本發(fā)明的特定的藥物組合物，除了活性藥物物質(zhì)之外，還包含蛋白和/或表面活性劑。蛋白或任何其它高分子量的天然來源的分子的存在，減少了IL-7在宿主免疫系統(tǒng)中的暴露，從而避免了次級效應。更優(yōu)選情況下，蛋白在受試者中是無免疫原性的，例如任何人類來源的蛋白。蛋白的最優(yōu)選的例子是人類血清白蛋白。表面活性劑可以從已知的表面活性劑中選擇，例如聚山梨酸酯產(chǎn)物，優(yōu)選為Tween2()TM或TWeen80TM。本發(fā)明的具體的組合物含有人類血清白蛋白(優(yōu)選2到5mg/ml)或聚山梨酸酯(Tween20或80(典型為0.005%))或任何其它物質(zhì)例如表面活性物質(zhì)或氨基酸(例如精氨酸、谷氨酸、或精氨酸和谷氨酸的混合物)或糖(例如蔗糖、海藻糖、山梨醇)，能夠防止由于蛋白聚集和/或給藥組合物后藥物產(chǎn)品在注射位點處的局部持久存在而引起的IL-7的免疫原性。在這一方面，本發(fā)明的具體目標在于含有濃度為大約1mg/ml到50mg/ml、優(yōu)選為大約3mg/ml到20mg/ml的超糖基化的白介素-7組合物的藥物組合物。優(yōu)選情況下，例如在治療或預防傳染病的情況下，被給藥的糖基化的白介素-7的有效量在大約10到200pg/kg/星期之間，優(yōu)選在大約10到60pg/kg/星期之間。鑒于本發(fā)明的多肽和組合物的改進的性質(zhì)，在使用等價劑量以獲得可比較的治療效果的情況下，藥物組合物需要使用的頻率低于現(xiàn)有技術(shù)的組合物或產(chǎn)品的使用頻率。更具體來說，在典型的實施方案中，組合物的使用每星期3次、每星期2次、每星期1次、每兩星期1次、每月1次、疫苗接種前或疫苗接種之前和之后1次或2次。優(yōu)選的劑量方案包括每7、IO或14天給藥1次藥物組合物。優(yōu)選的給藥途徑是腸胃外途徑。腸胃外途徑優(yōu)選為腫瘤內(nèi)給藥、更有選為靜脈內(nèi)或皮下給藥。此外也包括動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。但是，應該理解，依賴于病人的健康狀態(tài)和反應性，任何其它適合的給藥途徑也可以被考慮。在具體的實施方案中，給藥途徑是口服途徑。與其它多肽激素相比，由于超糖基化的IL-7的異常的穩(wěn)定性，口服途徑對于該蛋白來說事實上是可以接受的。本發(fā)明的組合物優(yōu)選為固體形式，例如片劑或粉末或膠囊，也可以是液體形式，例如在適合的可藥用的載體中制備的糖漿或乳濁液。優(yōu)選載體本身在胃腸道和循環(huán)系統(tǒng)中是穩(wěn)定的，并表現(xiàn)出可接受的血漿半衰期。抗胃酸膠囊、例如含有超糖基化的IL-7多肽的微乳濁液或脂質(zhì)體配方的抗胃酸膠囊，是有優(yōu)勢的。藥物組合物可以含有其它的活性成分，例如免疫刺激劑，優(yōu)選從造血細胞生長因子、細胞因子、抗原性分子(或抗原)和可以組合、分別或順序使用的佐劑中選擇。這種另外的活性成分可以與IL-7—起配制，也可以分別配制，用于組合、分別或順續(xù)使用。在第一種情況下，活性成分被一起配制在同樣的容器中。在另一種優(yōu)選的情況下，它們被分別調(diào)制，即在不同的容器中。按照本實施方案，成分可以分開使用，例如同時或順續(xù)使用(例如在不同的注射位點或不同的時間點)，以產(chǎn)生最有效的生物效應。正如上面提到的那樣，可以重復給藥1次或2次活性成分。在這種情況下，本發(fā)明涉及藥物組合物，其含有上述的超糖基化的IL-7組合物和選自免疫剌激劑和抗原性分子的活性成分，以組合、分別或順序使用。佐劑優(yōu)選分開配制。造血細胞生長因子優(yōu)選從干細胞因子(SCF)、特別是可溶形式的SCF、G-CSF、GM-CSF、Flt-3配體、IL、15和IL-2中選擇。用于疫苗增強的細胞因子或趨化因子的典型例子包括誘導和/或刺激Thl-類型的免疫反應的細胞因子。細胞因子優(yōu)選從a.或v-干擾素、IL-2、IL-12、RANTES、B7-l、MIP-2和MIP-1a中選擇。應該理解，其它的因子例如NK細胞活化劑和/或NKT細胞活化劑、FGF7或FGF10、白介素和/或激素可以與IL-7結(jié)合使用，以提供其它的治療益處。本發(fā)明的特定組合物含有上述的超糖基化的IL-7組合物和干細胞因子、特別是其可溶形式、IL-15禾B/或Flt-3配體和/或FGF10。本發(fā)明的另一種特定組合物含有上述的超糖基化的IL-7組合物和從a.或Y-干擾素、IL-2、IL-12、RANTES和MIP-1a中選擇的細胞因子。本發(fā)明的另一種特定組合物含有上述的超糖基化的IL-7組合物、干細胞因子和細胞因子。正如上面指出的那樣，藥物組合物還可以含有一種或幾種抗原(或抗原性分子)，以組合、分別或順續(xù)使用?？乖梢允侨魏魏铣傻幕蛱烊坏碾摹⒅亟M蛋白、殺死的、失活的或減毒的病原產(chǎn)物、微生物、寄生物、脂類等，及其部分和其組合?？乖梢允峭暾牡鞍?、或其任何含有表位的片段或部分、特別是通過I類和II類MHC分子呈遞到免疫系統(tǒng)中的肽?？乖梢允侨魏尾《究乖?、細菌抗原、寄生蟲抗原、腫瘤抗原等?？乖木唧w例子包括從HIV、水痘帶狀皰疹病毒、流感病毒、EpsteinBarr病毒、I型或II型單純性皰疹病毒、人類巨細胞病毒、登革熱病毒、甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人類乳頭狀瘤病毒、結(jié)核分枝桿菌、弓形蟲和衣原體衍生的抗原。本發(fā)明的一個具體的目標涉及含有上述的超糖基化IL-7組合物和抗原性分子的組合物，以組合、分別或順序使用。組合物還可以包含一種或幾種上面公開的免疫刺激劑，以組合、分別或連續(xù)使用。本發(fā)明的另一個具體的目標涉及含有上述的超糖基化IL-7組合物的藥物組合物，其中該藥物組合物與一種或幾種抗原性分子同時、提前幾天或連續(xù)使用，以在受試者中獲得和/或刺激抗原特異性的免疫反應。本發(fā)明的另一個具體目的涉及在受試者中引起或增強抗原特異性免疫反應的方法，包括給受試者給藥該抗原(或其含有表位的片段)和上面描述的超糖基化的IL-7組合物。組合物可以與該抗原同時、提前幾天或順序給藥，更優(yōu)選在給藥該抗原之前使用，以在受試者中獲得和/或刺激抗原特異性的免疫反應。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物還含有佐劑。佐劑可以從任何促進或增加抗原的免疫原性并能夠誘導Thl類型的免疫反應的物質(zhì)、混合物、溶質(zhì)或組合物中選擇，例如CpG、QS21、ISCOM和單磷酰脂A。這樣的佐劑特別適合于在哺乳動物受試者、特別是人類中產(chǎn)生和/或放大針對抗原的特異性免疫反應。佐劑優(yōu)選與含有IL-7的組合物分開調(diào)制和使用，和/或在不同的位點注射，優(yōu)選與所需的抗原一起。本發(fā)明還涉及含有有效量的本發(fā)明的人類超糖基化IL-7組合物，與適合的稀釋劑、賦形劑或載體混合的藥物組合物，通過腸胃外給人類病人使用，以預防性或治療性剌激B或T淋巴細胞的發(fā)育和增殖，或用于增強免疫反應。本發(fā)明的藥物組合物誘導了延長的淋巴細胞生成刺激和/或放大的免疫反應。本發(fā)明的藥物組合物也可以用于人類病人以預防性或治療性剌激B或T淋巴細胞的發(fā)育和增殖，用于增強全面的和/或特異性免疫重建，或用于增強體液和/或細胞免疫反應。本發(fā)明的具體的藥物組合物被用于在免疫缺陷病人中阻止或減少機會性感染。本發(fā)明的另一個具體的藥物組合物被用于延長淋巴細胞生成刺激，和/或產(chǎn)生不僅針對主要表位、而且針對次主要或較少免疫原性的表位、對T細胞受體具有較低的親和性的表位的特異性免疫反應，這將允許在人類病人中擴展特異性免疫反應的總組成成分。本發(fā)明特別適合于在受試者中產(chǎn)生保護性或治愈性免疫反應，這些受試者例如免疫缺陷病人、癌癥病人、經(jīng)歷移植的病人、病毒或寄生蟲感染的病人、老年病人或任何具有低的CD4計數(shù)的病人等。本發(fā)明的IL-7多肽和組合物的具體和優(yōu)選的應用包括下列應用-以能夠有效誘導針對惡性細胞或感染因子的特異性免疫反應增強的量作為疫苗增強劑(該組合物的給藥在抗原給藥之前、之中或基本上同時使用)；以及-誘導無論何種來源的病人的免疫重建傳染、輻射、移植(BMT、SCT)或藥物；本發(fā)明的IL-7多肽和組合物可以單獨使用，也可以與其它活性成分組合使用，例如淋巴細胞生成因子，包括但不限于SCF、Flt3-L、a-IFN、Y-IFN、IL-2、IL國3、IL-4、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21。在使用組合療法時，各種成分可以同時、分別或順序使用，可以一起或分開調(diào)制。本發(fā)明的IL-7多肽和組合物可以用于各種領域，包括在動物健康領域增強疫苗的接種，以及最小化活性物質(zhì)給藥的次數(shù)。本發(fā)明還提供了治療病毒感染、例如HIV感染、病毒性肝炎、西尼羅河熱、登革熱感染的方法，該方法包括給感染的病人使用超糖基化的IL-7多肽組合物。在具體的實施方案中，超糖基化的IL-7組合物將與干擾素分子結(jié)合使用。干擾素分子可以是例如a-IFN(白細胞IFN)、e-IFN(成纖維細胞IFN)、Y-IFN(免疫IFN)、co-IFN或t-IFN(滋養(yǎng)母細胞因子)。本發(fā)明還提供了用于在免疫減弱的受試者中改善胸腺生成恢復的方法，該方法包括給免疫減弱的受試者使用超糖基化的IL-7多肽組合物。優(yōu)選情況下，超糖基化的IL-7多肽與角質(zhì)細胞生長因子、干細胞因子、gonadostimulin拮抗劑或生長激素結(jié)合使用。超糖基化的IL-7多肽也可以用在提供針對惡性細胞、病毒或細菌的治療性免疫的方法中，其中超糖基化的IL-7多肽將與抗原或抗原混合物、例如上面描述的那些結(jié)合使用。在這種情況下，超糖基化的IL-7多肽還可以與GM-CSF結(jié)合使用。本發(fā)明的另一個目標是離體增強T細胞的擴增的方法，該方法包括將T細胞與超糖基化的IL-7多肽或組合物相接觸，從而增強T細胞的增殖。該方法對于制備適合于通過過繼性免疫療法治療患有癌癥或病毒感染的病人的T細胞來說是特別有用的。過繼性免疫療法是離體方法，用于選擇性擴增靶向特定抗原(惡性腫瘤或病毒)的特定T細胞。該免疫治療技術(shù)通常包括從病人的全血中分離抗原特異性T淋巴細胞，使用IL-7多肽離體擴增這些T細胞，也可以選擇通過其它細胞因子離體活化這些T細胞，并給病人使用。其它的技術(shù)也是可能的。IL-7多肽改進了這些T細胞種群的存活，這進一步顯示了增強的細胞毒性活性。生產(chǎn)方法和工具本發(fā)明的另一方面是提供適合的構(gòu)建物和方法，以足夠用于藥物應用的數(shù)量和質(zhì)量生產(chǎn)上述的組合物、特別是上面的超糖基化的IL-7多肽、組合物和藥物物質(zhì)。具體來說，正如上面討論的那樣，本發(fā)明提供了可以在各種感受態(tài)宿主細胞中生產(chǎn)本發(fā)明的重組人類IL-7多肽、并用于基因治療目的的載體和重組宿主細胞。載體可以是質(zhì)粒、病毒、噬菌體、粘粒、游離體等。優(yōu)選的載體是病毒載體(例如重組腺病毒)和質(zhì)粒，它們可以基于可商業(yè)獲得的骨架生產(chǎn)，例如pBR、pcDNA、pUC、pET、pVITRO等。載體典型地含有控制或介導IL-7多肽的表達的調(diào)控元件或序列。調(diào)控序列可以從啟動子、增強子、沉默子、組織特異性信號、肽信號、內(nèi)含子、終止子、polyA序列、GC區(qū)域，或其組合等中選擇。這樣的調(diào)控元件或序列可以從哺乳動物、真菌、植物、細菌、酵母、噬菌體或病毒基因衍生，也可以從人工來源衍生。用于原核細胞表達(例如大腸桿菌)的有用的啟動子包括例如T7RNA聚合酶啟動子(pT7)、TAC啟動子(pTAC)、Trp啟動子、Lac啟動子、Tre啟動子、PhoA啟動子。適合用于在哺乳動物細胞中表達的啟動子包括病毒啟動子(例如CMV、LTR、RSV、SV40、TK、pCAG等)、看家基因啟動子(例如Elf、雞eTactine、泛素、INSM1等)、雜交啟動子(例如actine/珠蛋白等)等。載體可以含有一個以上的啟動子。啟動子可以是可誘導的或被調(diào)控的。例如，使用可誘導的或被調(diào)控的啟動子允許通過使培養(yǎng)物與生產(chǎn)階段分離對生產(chǎn)進行較好的控制?？烧T導的或被調(diào)控的啟動子可以在文獻中發(fā)現(xiàn)，例如四環(huán)素系統(tǒng)、Geneswitch系統(tǒng)、Ecdysone系統(tǒng)、Oestradiol系統(tǒng)、RU486系統(tǒng)、Cumate系統(tǒng)、金屬硫蛋白啟動子等。其它的系統(tǒng)基于電流或微波，例如聚焦超聲系統(tǒng)、AIR誘導的表達系統(tǒng)等。這些系統(tǒng)可以用于控制本發(fā)明的IL-7多肽的表達。IL-7可以與抗凋亡因子(例如iex、Bcl2、BclXL等)或周期蛋白(例如p21、p27等)共表達。為該IL-7和該抗凋亡因子編碼的cDNAs可以都位于同樣的啟動子下游，但是被IRES序列分開，它們各自也可以位于其自身的啟動子的下游。載體還可以含有復制原點和/或標記物基因，它們可以從常規(guī)的序列中選擇。擴增選擇性標記物例如DHFR基因可以被插入到載體的骨架中。載體還可以含有這些不同元件的各種組合，它們可以以不同的方式組織。本發(fā)明還提供了含有上面描述的核酸或載體的重組宿主細胞。宿主細胞可以從任何真核和原核細胞中選擇，典型地從哺乳動物細胞(特別是人類、嚙齒類、犬類)、細菌細胞(特別是大腸桿菌E.coli、短芽胞桿菌Bacillusbrevis、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis)、酵母細胞、植物細胞和昆蟲細胞中選擇。這些宿主細胞可以適應于無血清培養(yǎng)基。生產(chǎn)也可以在轉(zhuǎn)基因動物或植物中完成。優(yōu)選的重組宿主細胞從哺乳動物細胞中選擇，特別是人類細胞及其衍生物或突變株。適合的宿主細胞的具體例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎臟(BHK)細胞、人類胚胎腎臟(HEK-293)細胞、人類表皮角質(zhì)細胞(HEK)、人類基質(zhì)或表皮細胞、PERC6等。在這些哺乳動物細胞中，IL-7可以使用功能性信號肽序列生產(chǎn)為分泌蛋白。本發(fā)明的一個具體目標是包含含有SEQIDNO:2、4或6的核酸分子的真核宿主細胞。本發(fā)明的另一個目標涉及與上面描述的IL-7組合物或多肽具有免疫反應性的抗體。這樣的抗體可以按照常規(guī)的方法生產(chǎn)，包括免疫動物和收集血清(多克隆)或從脾臟細胞制備雜交瘤(單克隆)。可以通過已知的生物學和化學方法生產(chǎn)抗體的片段(例如Fab')或工程化衍生物(例如ScFv或雙功能抗體或微型抗體)。優(yōu)選的抗體與上面描述的超糖基化IL-7多肽具有特異的免疫反應性，即可以結(jié)合超糖基化的IL-7多肽，而基本上不結(jié)合未糖基化或單糖基化的多肽。盡管也可以觀察到與這些其它抗原的非特異性或低效率的結(jié)合，這樣的非特異性結(jié)合可以同與本發(fā)明的特定超糖基化的IL-7多肽的特異性結(jié)合區(qū)分開來?？贵w優(yōu)選為猿、鼠或人類來源的，或已經(jīng)被人源化。本發(fā)明還涉及了產(chǎn)生上面描述的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。這樣的抗體可用于檢測超糖基化的IL-7多肽，或在包含多個淋巴細胞因子的分析或?qū)嶒炛兄泻虸L-7的生物活性。含有這樣的單克隆抗體，適合用于診斷、測試或治療的組合物也是本發(fā)明的一個目標。本發(fā)明的另一個目標涉及可以在工業(yè)規(guī)模上用于生產(chǎn)藥物級的、基本上純的上述超糖基化IL-7多肽的方法。該方法產(chǎn)生高收率的適用于治療應用的的重組IL-7構(gòu)像異構(gòu)體。本發(fā)明還提供了新的控制含有IL-7組合物的方法，以確定上述的超糖基化IL-7多肽存在的量。在特定情況下，上面定義的生產(chǎn)超糖基化IL-7多肽或組合物的方法包括a)培養(yǎng)上述的重組宿主細胞，以及b)收集從該細胞產(chǎn)生的IL-7多肽。樣品可以被用于進行各種處理或調(diào)制，以增加IL-7的純度、移除細胞碎片或病毒顆粒等。這樣的處理的典型的例子包括離心、澄清和/或透析、超濾、納濾。從而可以使樣品富集IL-7多肽。為了增加方法的收率或效率，非常希望生產(chǎn)含有或富集了正確折疊和糖基化的IL-7多肽的樣品。超糖基化的IL-7多肽可以通過目前已知的、但尚未被用于組合生產(chǎn)超糖基化IL-7多肽的不同技術(shù)來進行純化。這些技術(shù)更優(yōu)選從疏水相互作用層析、離子交換層析、親和層析和凝膠過濾層析中選擇，可以單獨使用，也可以以不同的方式組合使用。這些方法允許除去宿主細胞DNA和其它會降低回收率的雜質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，步驟ii)包含疏水相互作用層析步驟。這樣的層析可以使用不同的支持物和形式進行，優(yōu)選使用HIC丁基。步驟ii)可以在任何支持物上進行，優(yōu)選使用適合的凝膠分批或在柱中進行。在優(yōu)選實施方案中，純化步驟包括將樣品上樣于填充有特定凝膠(例如Sephadex)的柱子中。在另一個優(yōu)選實施方案中，純化步驟包含精制步驟，包括將樣品上樣于填充有特定凝膠(Source15S)的柱子以濃縮回收的所需蛋白并除去可能的殘余蛋白污染物。在另一個特定實施方案中，純化步驟包括將樣品上樣于填充有特定凝膠的柱子，該凝膠含有固定在樹脂(例如硫酸葡聚糖或肝素)上的單克隆抗IL-7抗體。這些方法允許可重復地和有效地生產(chǎn)上面描述的基本上純的超糖基化IL-7多肽。這些方法是特別有利的，因為可以獲得的重組IL-7相對于IL-7總量來說具有至少95。/o重量比、優(yōu)選至少98%重量比、更優(yōu)選至少99%、甚至99.5%重量比的純度。上面描述的方法中的每一步都可以通過分析方法、包括SDS-PAGE分析來控制。最適化的IL-7的一級結(jié)構(gòu)可以通過確定基因和/或氨基酸序列、通過胰蛋白酶消化后進行肽作圖分析、通過用SDS-PAGE、孔徑排阻HPLC、質(zhì)譜分析例如MALDITOF或電噴射質(zhì)譜等測定分子量、通過例如反向HPLC測定疏水性、和/或通過例如陽離子交換層析HPLC或等電聚焦分析測定電荷來進行控制和定性。本發(fā)明的另一個實施方案涉及上述的IL-7生產(chǎn)方法，其中IL-7被重組宿主細胞的表達是可誘導的、被調(diào)控的或短暫的，以便細胞培養(yǎng)和IL-7表達在時間上可以被分開。更具體來說，在特定實施方案中，IL-7的表達在重組細胞的生長、擴增和/或培養(yǎng)期間可以被抑制或最小化，以允許生產(chǎn)大量的重組宿主細胞而不帶來任何IL-7介導的潛在毒性效應。然后，可以在細胞培養(yǎng)物(或其樣品)中誘導IL-7的表達，以允許有效合成和釋放重組IL-7。因此，本發(fā)明的一個目標還在于生產(chǎn)重組IL-7多肽的方法，包括培養(yǎng)上面公開的含有為該IL-7多肽編碼的核酸分子的重組宿主細胞和回收產(chǎn)生的重組IL-7多肽，其中該核酸分子為該IL-7多肽提供了被調(diào)控或可誘導的表達，以便該IL-7多肽的表達在重組細胞生長期間可以被抑制或最小化，在生產(chǎn)期中可以被誘導。核酸典型地含有可誘導的啟動子，它在存在或不存在包含或添加到培養(yǎng)基中的特定試劑的情況下可以被抑制或激活。該方法特別適合于生產(chǎn)上面公開的IL-7超糖基化構(gòu)象異構(gòu)體。在本
技術(shù)領域：
中已經(jīng)公開了多種被調(diào)控的或可誘導的表達系統(tǒng)，它們可以在哺乳動物宿主細胞中起作用，可以用于本發(fā)明。這包括四環(huán)素TetOn/Off系統(tǒng)、使用Mifepristone作為誘導劑和GAL4-Elb啟統(tǒng)(Invitrogen)、Ecdysone系統(tǒng)(用昆蟲類固醇激素的類似物松甾酮A或muristeroneA誘導)(Invitrogen)、金屬硫蛋白啟動子(用鋅誘導)、雌二醇系統(tǒng)、RU486系統(tǒng)、聚焦超聲系統(tǒng)、AIR(乙醛誘導的調(diào)控)誘導的表達系統(tǒng)、Cumate系統(tǒng)(Q-mate;Qbiogen)、Cre-Lox系統(tǒng)等。這些被調(diào)控或可誘導的表達系統(tǒng)可以用于各種細胞，例如HEK293、HEK293EBNA、HEK、T-REXTM-293、T-REXTM-HeLa、T-REXTM-CHO或T-REXTM-Jurkat細胞株，它們用被設計為誘導后表達IL-7的重組載體來轉(zhuǎn)化。此外，瞬時轉(zhuǎn)染可以被用于分離細胞擴增和IL-7生產(chǎn)。在這一點上，有效的基因投送載體被用于在其擴增后將IL-7編碼序列導入細胞中。更優(yōu)選，用于瞬時轉(zhuǎn)染的載體系統(tǒng)是病毒載體，例如重組腺病毒或游離的載體[例如pCEPH(Invitrogene)、pTT(IRB:DurocherY.等Nucl.Acids.Res.,2002,30(2))或使用MAR序列]。腺病毒(以及其它病毒載體例如AAVs)可以根據(jù)本
技術(shù)領域：
現(xiàn)有的技術(shù)來生產(chǎn)。典型來說，E1-缺陷的腺病毒在E1補充的細胞株中，例如HEK293、PERC6細胞等中生產(chǎn)。這樣的瞬時轉(zhuǎn)染方法可以在培養(yǎng)物中的各種哺乳動物細胞中進行，例如A549-、HeLa-、VERO-、BHK-或CHO-轉(zhuǎn)化細胞(正如在實施例A4中公開的那樣)。另一種適合于使用在本發(fā)明中的瞬時表達方法是例如在下面的文章中公開的方法DurocherY.等Nucl.Acids.Res.，2002，30(2)，表達在HEK293EBNA或HEK293細胞中。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的生產(chǎn)方法包括附加的步驟c)，即對包含在獲得的產(chǎn)物中的上述特定的超糖基化IL-7多肽進行定性和測量或定量。所需的超糖基化的IL-7多肽的物理和生物學性質(zhì)可以通過質(zhì)譜(MALDI-TOF或電噴射)、紅外波譜、核磁共振(NMR)、通過測量圓二色性、通過在特定的生物測試中評估IL-7的生物學活性、通過測量對針對該超糖基化IL-7多肽產(chǎn)生的特異性單克隆抗體的親和性、或肝素親和性HPLC來獲得。一旦定性之后，該構(gòu)象異構(gòu)體的定量可以通過ELISA、生物測試、該超糖基化IL-7多肽與IL-7受體的親和性和任何應用于分離的構(gòu)象異構(gòu)體的蛋白定量方法來進行。在這一方面，本發(fā)明還提供和涉及了鑒定和/或測量樣品中、特別是藥物制劑中的超糖基化IL-7多肽和/或相關(guān)雜質(zhì)的量的方法。這種定性方法可以在藥物批次的質(zhì)量控制中用于申報治療應用的蛋白的最初的性質(zhì)和質(zhì)量的研究。本發(fā)明第一次提出了含有IL-7的制劑的定性和控制方法，以確定本發(fā)明的超糖基化的IL-7多肽的存在和/或相對數(shù)量。優(yōu)選的方法使用二辛可寧酸(BCA)蛋白分析、SDS-PAGE、western印跡、孔徑排阻HPLC、反向HPLC、離子交換HPLC、疏水相互作用HPLC、氨基酸分析(AAA)、等電聚焦(IEF)、ELISA、UV吸收和/或生物分析方法。這些方法可以單獨使用，也可以以不同方式組合使用。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)IL-7藥物物質(zhì)或藥物組合物的方法，該方法包括(i)培養(yǎng)編碼IL-7多肽的重組宿主細胞，(ii)分離該重組多肽以生產(chǎn)IL-7藥物物質(zhì)和(iii)調(diào)制該IL-7藥物物質(zhì)以生產(chǎn)適合于治療或疫苗應用的藥物組合物，該方法還包括在該藥物物質(zhì)或藥物組合物中鑒定、定性或測量上面定義的超糖基化IL-7多肽的數(shù)量和/或質(zhì)量的步驟，以及更優(yōu)選情況下，選擇含有超過大約90%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選98%的作為活性成分的該超糖基化IL-7多肽的藥物物質(zhì)或藥物組合物的步驟。定性步驟可以通過各種技術(shù)來進行，更優(yōu)選通過伴隨使用或不使用胰蛋白酶消化的與質(zhì)譜相關(guān)的方法、外源凝集素親和層析、氨基酸分析(AAA)、內(nèi)切和外切N-或O-聚糖酶消化(PNGaseA/F，0-糖苷酶，神經(jīng)氨酸酶)、熒光團輔助的糖電泳、MALDITOF或電噴射質(zhì)譜、用于二硫橋和/或構(gòu)象定性的特異性單克隆抗體分析。分子變異體和與產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)的鑒定優(yōu)選通過使用一種或幾種從下面的方法中選擇的方法來進行對于脫酰胺形式，采用二維電泳、等電聚焦和離子交換層析；對于多聚體形式，采用孔徑排阻層析和SDS-PAGE分析，以及對于截短形式，采用帶有或不帶酶法預消化的反向HPLC。該步驟特別適合于臨床或藥物組合物的質(zhì)量控制，其中只有含有超過大約95%、優(yōu)選超過大約96%、98%或99.5%的上述超糖基化IL-7多肽的組合物被保留。所有這些超糖基化的IL-7多肽顯示出低于6.5的平均等電點。本發(fā)明的另一個目標涉及使用通過上面描述的方法獲得的重組超糖基化IL-7多肽，用于生產(chǎn)預防或治療與免疫缺陷有關(guān)的疾病、特別是誘導延長的淋巴細胞生成刺激、引起和/或擴增免疫反應、特別是抗原特異性免疫反應的藥物組合物。本發(fā)明的另一個目標涉及使用超糖基化的IL-7多肽，用于在獸醫(yī)應用領域中在哺乳動物中用作實驗工具和藥物應用。本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將在下面的實施例中描述，這應該被當作是說明性的，不對本申請的范圍構(gòu)成限制。實施例實施例A.最適化的人類(h)和猿類(s)IL-7編碼序列在哺乳動物細胞中的構(gòu)建和表達Al.最適化的人類IL-7編碼核苷酸序列的構(gòu)建l丄肽信號的最適化-因為在5'末端連接了天然IL-7肽信號的IL-7cDNA片段的表達非常低，我們試驗了幾個信號肽序列。新的編碼人類IL-7的cDNA序列從裝配的合成寡聚核苷酸化學獲得。測試了幾個信號肽序列高度分泌蛋白的信號肽(SP)(Barash等；2002;BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications294:835-842):IL-7SPMFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASS(SEQIDNO:13)EPOSPMGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLG(SEQIDNO:14)SEAPSPMLLLLLLLGLRLQLSLG(SEQIDNO:15)IgGSPMETDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQIDNO:16)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白/玻璃粘連蛋白SPMKLVFLVLLFLGALGVALA(SEQIDNO:17)抑半胱氨蛋白酶蛋白bisSPMARPLCTLLLLMATLAVALA(SEQIDNO:18)EPO/IL-7的新雜合體SPMGVHECPAWLWLLLSLLSLVLLPVAS(SEQIDNO:19)獲得的cDNAs序列被插入到pTT5載體中(Durocher等；2002;Nucl.Ac.Res.;30)，用于在哺乳動物細胞例如HEK293細胞、CHO細胞中瞬時表達。為了確定信號肽的良好切割，每個獲得的蛋白的N-末端氨基酸被測定；hIL-7的完整性被維持。抑半胱氨蛋白酶蛋白、IgG、EPO和雜合體EP/7表現(xiàn)為是最好的信號肽序列。事實上，hlL-7的表達被增強了至少10倍。1.2.編碼人類IL-7的核苷酸序列的最適化為了維持EP〃ML-7的氨基酸序列，核酸序列進行了如下最適化-消除了人類稀有密碼子(使用圖形密碼子使用分析者軟件GraphicalCodonUsageAnalysersoftware)-通過增加除了信號肽序列之外的序列的"GC"含量并最小化連續(xù)的"CA"二核苷酸以增強mRNA的穩(wěn)定性(Kim等；1997;Gene;199)。序列被描述在SEQIDNO:2中。A2.最適化的編碼猿類IL-7的核苷酸序列的構(gòu)建正如在編碼人類IL-7的序列中描述的那樣，合成了EP/7-sIL-7最適化序列(SEQIDNO:3)。A3.編碼犬類IL-7的核苷酸序列的構(gòu)建犬類IL-7cDNA通過PCR從狗腎cDNA文庫(Biochain)中擴增，按照上述人類IL-7編碼序列中那樣進行克隆和測序，IL-7SP或EP/7SP-cIL-7序列被合成(SEQIDNO:6)。A4.哺乳動物表達(BHK細胞表達，或CHO細胞表達或HEK-293細胞表達)編碼IL-7的cDNA序列通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增(Mullis等；1987;MethodsinEnzymology;155:335-350)以產(chǎn)生限制性位點(Notl/Swal),用于克隆在表達載體中。設計了表達系統(tǒng)ph-pgk.EP7-hIL-7(圖1)或pBh-pgk.EP7-hIL-7(圖2)以表達從天然人類IL-7基因序列翻譯而預測的IL-7蛋白。在載體上攜帶的抗生素(在大腸桿菌中克隆使用氨芐青霉素，在哺乳動物細胞中表達使用潮霉素)抗性標記物基因的基礎上來篩選含有重組載體的細胞。該表達載體已經(jīng)被完全構(gòu)建在CYTHERIS中，開始于賦予系統(tǒng)氨芐青霉素抗性的pIC20H質(zhì)粒(ATCC)。它含有2個哺乳動物的生產(chǎn)單元1/一個用于表達IL-7編碼序列，該序列在pgk啟動子控制之下，帶有合成的polyA序列以避免轉(zhuǎn)錄通過pgk啟動子。2/—個用于表達潮霉素抗性，在"sv40增強子-tk啟動子"控制之下。下列序列被插入到該最初的載體中-"hph-eflapA，，HindlII/Sbfl片段，來自pVitro2.mcs(Invitrogen);-tk啟動子EcoRI/HindlIIPCR片段，來自pMEP4(Invitrogen);-sv40增強子BssHII/EcoRIPCR片段，來自pVitro2.mcs(Invitrogen);-MAR兔3珠蛋白推定的"基質(zhì)結(jié)合區(qū)域"，用于在染色質(zhì)的高度轉(zhuǎn)錄區(qū)域中更好地整合，來自pSG5(Stratagene)的EcoRV/Agel兔P珠蛋白內(nèi)含子2PCR片段；-SpA:StuI/BspEI片段，來自pCAT3對照(Promega);-Pgk啟動子Kpnl/BssHIIPCR片段，來自pQBI.pgk(Q-biogen);-5，UTRintl:HindIII嵌合內(nèi)含子片段，來自pCAT3-對照(Promega);-Notl/Swal或Notl/PmllIL-7編碼cDNA和突變體;-hghpA:Nrul/Swal合成序列，從M.Goodman(DeNoto等；1981;Nucl.Acid.Res.;9(51):3719-3730)描述的人類生長激素cDNA序列合成。載體的某些變異體使用除了pgk啟動子之外的其它IL-7啟動子來制備Efla、snRNAUl、肌動蛋白、泛素、CMV啟動子等，或其它選擇標記物新霉素等。含有SEQIDNO:2的哺乳動物(HEK-293、CHO或BHK)表達載體被稱為ph-pgk.EP7-hlL-7或pBh-pgk.EP7-hIL-7。使用ph-pgk.EP7-ML-7或pBh-pgk.EP7-hlL-7表達載體，人類IL-7在HEK-293或CHO轉(zhuǎn)染細胞中得到了穩(wěn)定的表達。在用NdeI線性化后，使用本領域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知的方法將表達載體ph-pgk.EP7-WL-7或pBh-pgk.EP7-hIL-7轉(zhuǎn)染到哺乳動物宿主細胞中。用于建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子的選擇性標記是潮霉素(Invitrogen)。A5.可誘導的哺乳動物表達(金屬硫蛋白啟動子"MT1"):在同樣的表達載體中，用參照PubMed中(NoX53530)(Carter等;1984;Proc.Natl.Acad.Sci.USA;81:7392-7396)的序列化學合成的BspEI/BssHII"小鼠MT1"序列代替了pgk啟動子。MT1是金屬依賴性轉(zhuǎn)錄因子啟動子。因此穩(wěn)定的克隆的表達是鋅依賴性的。A6.IL-7和Bcl2或BclXL(BHK細胞表達、或CHO細胞表達或HEK-293細胞表達)的晡乳動物共表達為了增加在哺乳動物宿主細胞培養(yǎng)物中的細胞存活率、從而最適化IL-7的生產(chǎn)量，通過將Bcl2cDNA序列插入到tk啟動子和hphcDNA之間制備了變異的表達質(zhì)粒，以便Bd2的抗凋亡活性可以在生物反應器生產(chǎn)中測試(Zhong等；1993;Proc.Natl.Acad.Sci.USA;90:4533-4537-Lee等；2000;JournalofcellScience;114(4):677-684)(參見圖2)。實施例B.編碼IL-7的核苷酸序列的超糖基化類似物在哺乳動物細胞中的構(gòu)建和表達Bl.超糖基化IL-7類似物的cDNA序列的構(gòu)建使用幾種技術(shù)包括誘變方法獲得了超糖基化的IL-7類似物。超糖基化的IL-7類似物(也稱為HG37~40-104-126和-147)是從裝配的合成的寡聚核苷酸化學構(gòu)建的。通過引入一個或多個所需的突變獲得了幾個類似物，這些突變產(chǎn)生了具有一個或多個附加的糖基化位點的IL-7類似物。因此，在用NotI和PmII限制性酶消化之后，含有一個或多個所需的附加的糖基化位點的全長cDNA序列被插入到Notl/Pmll限制性位點之間，以直接克隆到表達載體中(與圖1或2相同，但是含有適當?shù)腎L-7序列)。B2.超糖基化IL-7類似物的cDNA序列的表達超糖基化IL-7類似物的表達與上面A4到A6節(jié)中描述的那樣進行。實施例C.在生物反應器培養(yǎng)條件下生產(chǎn)重組WL-7實施例A4中獲得的最穩(wěn)定的陽性克隆通過幾次培養(yǎng)基和成分篩選之后適應于無血清懸浮培養(yǎng)，以便產(chǎn)生最適合在高細胞密度培養(yǎng)中生產(chǎn)和生長的克隆。在接種到100到2000L生物反應器中之前，在"波包(wavebag)"系統(tǒng)中進行了預培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)在帶有灌注系統(tǒng)或補料分批培養(yǎng)系統(tǒng)的100到2000升生物反應器中進行10到15天。細胞在添加了植物蛋白胨的低谷氨酰胺含量的培養(yǎng)基中被擴增到濃度為—千萬細胞/ml。在第一個擴增步驟中，培養(yǎng)溫度被調(diào)節(jié)到37°C以增加細胞密度。幾天之后，溫度被降低到大約28/32。C，以抑制細胞生長并允許較好的表達水平。此外，降低溫度降低了分泌途徑的速度、有利于被表達的IL-7更好地被糖基化、增加了被占據(jù)的位點。在培養(yǎng)結(jié)束之前幾天，通過在培養(yǎng)基中添加0.5-10mM丁酸鈉促進了IL-7的表達。在上面描述的條件之下，細胞內(nèi)和培養(yǎng)基中的IL-7表達都被檢測(圖3)。為了生產(chǎn)高分子量的IL-7糖基化形式，在培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)基中維持3g/L葡萄糖和3mM谷氨酰胺，以及好的供氧。人們也檢測氨基酸消耗，并在培養(yǎng)基中補加消耗掉的氨基酸。一旦細胞存活率降低到90%以下，就收獲細胞培養(yǎng)物。實施例D.在HEK-293和CHO細胞中表達的重組人類IL-7產(chǎn)物的純化收集粗細胞培養(yǎng)基，將完整細胞和細胞碎片離心沉淀。此外，這也可以通過在澄清艙或模塊例如MustangXT艙(PaIl)、SartoclearP(Sartorius)、Millistak+Opticap(Millipore)或中空纖維艙(AXHcrossflowIO(GE))或等價物上進行深部過濾來達到。被離心的培養(yǎng)基使用膜截留分子量為10kDa的Centrasette盒式裝置(PallLifeSciences)濃縮大約10倍以減少上清液體積。任何具有同樣孔徑的其它過濾/濃縮系統(tǒng)也可以使用。將濃縮的上清液離心，調(diào)節(jié)到pH7.5，上樣用pH7.5的50mM磷酸鈉平衡的QSepharoseFastFlow(GeneralElectricHealthcare)柱。然后在流出液中回收蛋白。在該負層析步驟中，各種污染物包括DNA被消除。該步驟的一個替代方法是在同樣條件下使用被證實的MustangQ膜盒(Pall)，以獲得更好的收率和/或稍微更快的過程。該步驟的另一種替代方法是在強陰離子交換樹脂(QCeramicHyperD(Biosepra),CaptoQ(GE))或膜(SartobindQ,Sartorius)上捕獲蛋白。在這個預純化步驟之后，在強陽離子交換樹脂上進行捕獲步驟。將在上一步驟結(jié)束時收集到的流出物上樣至用載樣緩沖液(pH7.5的50mM磷酸鈉)平衡的FractogelEMDS03-(Merck)柱，然后用pH7.5的50mM磷酸鈉清洗。使用溶解在pH7.5的50mM磷酸鈉中的線性NaCl梯度(15個柱體積)進行洗脫。將有活性的級份合并，在室溫下在pH3.5中失活30分鐘以消除病毒。該方法的一個替代方法是在步驟末尾時用多層納濾代替該病毒失活步驟。在病毒失活后，用緩沖液(pH7的200mM磷酸鈉，3M硫酸銨)將合并的蛋白級份稀釋2倍，將pH調(diào)整到7。然后，將蛋白溶液上樣至用載樣緩沖液(pH7的50mM磷酸鈉+1.5M硫酸銨)平衡的疏水相互作用(HIC)丁基Toy(Dpearl650-M(Tosoh)柱。在用載樣緩沖液清洗后，用25倍柱體積的溶解在pH7的50mM磷酸鈉中從1.5M到0M的硫酸銨鹽梯度洗脫IL-7。替代的HIC樹脂例如己基Toyopearl650-M(Tosoh)、丁基/辛基Sepharose4FastFlow(GeneralElectricHealthcare)可以被用于該步驟。另一種用于放大生產(chǎn)目的的HIC替代方法是使用另一種基質(zhì)例如MEPHyperCel(PallBiosepra)以獲得相似的結(jié)果。上述捕獲步驟和疏水相互作用層析的組合允許根據(jù)本身固有的生理-化學性質(zhì)最適地分離不同糖基化的IL-7同種型(圖4中顯示的從B1到B10)。洗脫級份的適當選擇(從B1至I」B4級份)導致富集3N-連接而不導致lO-糖基化的hIL-7實體。這樣的糖基化形式分離的一個例子被顯示在圖4中。高度糖基化的IL-7級份被合并，并上樣至用低鹽緩沖液(pH6的20mM乙酸鈉)平衡的G25Sephadex(GeneralElectricHealthcare)柱。該步驟的替代方法是使用截留分子量5或10KDa的TFF膜(Qvickstartmembranes,(GE),CentramateTFF(Pall))透濾高鹽蛋白合并液。從G25步驟獲得的蛋白級份被上樣至用上樣緩沖液(pH6的20mM乙酸鈉)平衡的Source15S(GeneralElectricHealthcare)柱。該精制步驟導致蛋白濃縮和消除殘留的污染物。用乙酸鈉載樣緩沖液沖洗柱子，然后用15倍柱體積的溶解在pH6的20mM乙酸鈉中的從0到1M的NaCl鹽梯度洗脫IL-7蛋白。被洗脫的級份通過SDS-PAGE分離，用考馬斯亮藍或硝酸銀染色。只有含有IL-7的級份被合并，以釋放出最終的純化的IL-7蛋白批次產(chǎn)品。如果之前沒有進行病毒失活，純化方法還可以包含另外的兩種過濾的組合，以確保最佳的病毒清除。病毒清除可以通過使用預過濾裝置(Planova75,AsahiKaseiMedical)過濾、然后通過納米孔徑的纖維素膜(Planova20N,AsahiKaseiMedical)或通過其它的病毒移除膜(Virosart,Sartorius;DV20,Millipore)過濾來完成。純化的大腸桿菌、糖基化和超糖基化的hIL-7的SDS-PAGE被顯示在圖5中。凝膠中的遷移說明的蛋白的糖基化水平。事實上，這里試驗的超糖基化形式(HG-37-147和HG-40-104)比全糖基化的hIL-7具有更高的分子量。實施例E.糖蛋白的糖分析重組人類IL-7的生產(chǎn)在基于CHO細胞的表達系統(tǒng)中進行，這是因為但不限于下面的原因。CHO細胞是目前最有效和最常用的用于生產(chǎn)重組人類治療性糖蛋白的宿主。此外，有大量詳細的工作報道，CHO細胞、包括表達唾液酸基-a-l-6轉(zhuǎn)移酶的遺傳修飾的CHO細胞，能夠以與在人類細胞中觀察到的在量上相同的方式對重組蛋白進行糖基化。這種具體的特點對于重組糖蛋白在注射到人類病人中時減少潛在的免疫原性是非常重要的。從轉(zhuǎn)染的CHO細胞獲得的富集了特定糖基化形式(3N或3N+2N，帶有或不帶有1個O-聚糖基團)的純化的重組人類IL-7產(chǎn)物或級份通過Western印跡進行分析，以證實與大腸桿菌來源的重組人類IL-7相比的糖基化狀態(tài)。CH0產(chǎn)生的純化的IL-7的不同糖基化形式使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行差異定性。糖蛋白實體的表觀分子量范圍在20KDa和35KDa之間，主要帶位于大約27KDa(在SDS-PAGE上觀察到的，參見圖5和圖6)，最可能對應于帶有或不帶有l(wèi)個0-聚糖基團的3個N-糖基化的形式。這種特點被純化的產(chǎn)物的酶法脫糖基化所特異性闡明(參見圖7)。CHO產(chǎn)生的純化的IL-7的這些糖基化形式(3N或3N+2N，帶有或不帶有l(wèi)個O-聚糖基團)使用質(zhì)譜進行了差異定性，得到的帶有或不帶有1個O-聚糖基團的3N-糖基化形式的分子質(zhì)量大于25KDa，帶有或不帶有1個O-聚糖基團的2N-糖基化形式的分子質(zhì)量大于23KDa(參見圖8)。此外，上述的糖基化形式的平均等電點為5.8，反映出高唾液酸化情況(參見圖9)。作為對照，對未糖基化的大腸桿菌來源的WL-7進行了同樣的分析，得出的蛋白的表觀分子量為大約18KDa，哺乳動物細胞來源的超糖基化的hlL-7表面出的表觀分子量在27到37KDa之間。通過完全酶法脫糖基化然后層析分離并用質(zhì)譜分析產(chǎn)生的寡糖，對純化的CHO來源的WL-7的總糖基化復雜性和總N-聚糖不均勻性進行了評估。純化的糖基化的h-IL-7樣品用內(nèi)切糖苷酶例如肽-N-糖苷酶F(PNGaseF,Roche)進行酶法消化。釋放出的N-連接的寡糖使用graphiteCarbograph200-300jil柱子(Alltech)從肽結(jié)構(gòu)上分離并分揀，然后進行MALDI-TOF質(zhì)譜分析(VoyagerSpec,AppliedBiosystems)。對應于MS譜圖的每個峰的m/z值允許鑒定完整ML-7分子的N-聚糖通用結(jié)構(gòu)。為了特異性檢測含有唾液酸的聚糖，在質(zhì)譜分析之前進行PNGase產(chǎn)生的寡糖的羧甲基化(如同在PowellAK&HarveyDJ,Rap.Com.MassSpec.1996中報道的那樣)。對從純化的CHO來源的hIL-7產(chǎn)生的譜圖進行的分析顯示出N-聚糖的質(zhì)量范圍從1340Da直到最大3516Da(參見圖10)。根據(jù)譜圖，可以確定下面的聚糖結(jié)構(gòu)(參見表3):表3m/z信號觀察到的分子離子的指派1338Hex3HexNAc4+Na+1448Hex4(dHex)HexNAc4+Na+1485Hex3(dHex)HexNAc4+Na+1647Hex4(dHex)HexNAc4+Na+1809Hex5(dHex)HexNAc4+Na+1824Hex3(dHex2)HexNAc5+Na+1970Hex5(dHex)HexNAc4(Sulph)2+2Na+2012Hex5(dHex)HexNAc5+Na+2157NeuAcCarboxyHex4(dHex)HexNAc5+Na+2182NeuAcHex5(dHex)HexNAc4Sulph+Na+2318NeuAcCarboxyHex5(dHex)HexNAc5+Na+2421Hex3(dHex)HexNAc8(Sulph)+Na+2536NeuAcCarboxyHex6HexNAc6+Na+2624NeuAc2CarboxyHex5(dHex)HexNAc5+Na+2786NeuAc2CarboxyHex6(dHex)HexNAc5+Na+2843NeuAc2CarboxyHex6HexNAc6+Na+3092NeuAc3CarboxyHex6(dHex)HexNAc5+Na+3153NeuAc3CarboxyHex6HexNAc6+Na+Hex:己糖(半乳糖或甘露糖)，HexNAc:N-乙酰己糖胺(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)，dHex:脫氧己糖(果糖)，Sulph:硫酸基團，NeuAc:N-乙酰神經(jīng)氨酸。考慮到i)觀察到的寡糖基團的相應質(zhì)量，ii)每個單糖的質(zhì)量和iii)目前已經(jīng)了解的聚糖生物合成途徑的法則，可以具有高度可能性地推斷下列高復雜性的N-聚糖結(jié)構(gòu)。表4:在CHO來源的ML-7(但不限于此)上定性的復雜的二和三天線哺乳動物N-聚糖O甘露糖d/V-乙酰葡萄糖胺半乳糖Oa1-3-果糖△唾液酸200680026503.X說明書第53/61頁糖基化復雜性也通過確定在純化的CHO來源的hlL-7的所有聚糖(如果可用的話，N-和O-聚糖)上發(fā)現(xiàn)的不同單糖的摩爾比率來評估。純化的糖基化h-IL-7樣品的所有聚糖通過甲醇分解反應進行化學處理，以便水解糖之間的所有糖苷連接。使用偶聯(lián)的氣相色譜-質(zhì)譜自動質(zhì)量裝置(Finnigan)將釋放的單糖從肽結(jié)構(gòu)上分離并分揀。參照已知的內(nèi)標和經(jīng)典的哺乳動物N-聚糖的3甘露糖含量確定摩爾比率。這樣的分析對CHO來源的hlL-7給出了下列摩爾比率表5<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>CHO來源的ML-7的位點特異性N-聚糖模式不均勻性通過內(nèi)切蛋白酶消化、然后對產(chǎn)生的肽進行分級和質(zhì)譜分析來測試。純化的樣品用胰蛋白酶或其它內(nèi)切蛋白酶進行消化，以產(chǎn)生對應于表達的IL-7的每個N-糖基化位點的糖肽。每個糖肽進行N-末端微量測序，通過當用反向HPLC進行分析時它的特定持留時間來鑒定。因此將每個糖肽從其它糖肽中純化出來。糖肽帶有的N-聚糖的不均勻性通過MALDI-TOFMS(QStar,AppliedBiosystems)進行分析。對應于MS譜圖的每個峰的m/z值允許鑒定hlL-7的指定位點的N-聚糖形式。O-糖基化通過使用O-聚糖特異性外源凝集素(外源凝集素印跡，參見圖11)來分析。純化的CHO來源的hlL-7樣品通過SDS-PAGE分析進行分離，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。固定化的蛋白用(但不限于)過氧化物酶標記的PNA(花生凝集素)和/或MAA(Maackiaamurensis凝集素)探測并染色以可視化。聚糖的不均勻性和組成也通過使用外源凝集素與純化的CHO來源的hlL-7的親和性來確定?！盗袑-和O-聚糖結(jié)構(gòu)具有親和性的外源凝集素被選擇用于包被96孔微孔板。同樣量的重組純化的IL-7制備物被保溫在外源凝集素包被的微孔板孔中。在該步驟中，根據(jù)給定的外源凝集素與IL-7的聚糖修飾的親和性，不同量的IL-7與外源凝集素保持結(jié)合。通過與生物素連接的IL-7特異性抗體保溫來進行顯示。外源凝集素-IL-7-抗體三明治用鏈親和素-過氧化物酶共軛物來顯示。使用了8種不同的外源凝集素對IL-7純化樣品迸行了定性。每種外源凝集素特異性識別糖基團。聚糖基元和結(jié)構(gòu)特異性被顯示在表6中。表6:被外源凝集素識別的糖基團的模式概述和它們的聚糖基元和結(jié)構(gòu)特異性的清單。LEA是來自番茄(Lyc叩ersiconesculentum)的外源凝集素，WGA來自小麥(Triticumvulgare)，UEA.I來自Ulexeuropeus,MAA來自Maackiaamurensis,ACA來自尾穗莧(Amaranthuscaudatus)，AIA來自Artocarpusintergrifolia，ABA來自雙孢蘑燕(Agaricusbisporus)，PHA丄來自菜豆(Phaseolusvulgaris).表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>結(jié)果顯示在圖12中。外源凝集素清楚地證實了不同的親和性，提供了溶液中的純化IL-7蛋白的可獲取的聚糖裝飾的通用結(jié)構(gòu)的信息。因此，ACA、ABA和AIA對Gal和GalNAc具有親和性。所有三種外源凝集素的陽性反應表明了帶有這些單糖的N-和O-聚糖結(jié)構(gòu)的存在。用ABA獲得的特異性信號表明了0-聚糖結(jié)構(gòu)的存在。ACA與AIA相比以及在較小程度上與ABA相比有較弱的信號。這表明O-聚糖被擴增，僅有很少的GalNAc作為末端殘基。LEA對GalNAc具有親和性，表明了N-聚糖結(jié)構(gòu)的存在。在試驗的GlcNAc-特異性外源凝集素中(數(shù)據(jù)未顯示)，只有對N-乙酰乳糖胺具有親和性的那些顯示出陽性信號。由于與N-連接的聚糖的核心結(jié)構(gòu)具有低的結(jié)合親和性，WGA顯示出弱的信號。高度復雜的N-聚糖屏蔽了核心結(jié)構(gòu)，使得外源凝集素的親和性難以操作。UEA.I對于分支果糖的存在具有特異性活性。結(jié)合相當弱，表明N-聚糖不完全的但是有效的果糖基化。MAA對末端唾液酸具有親和性。MAA信號強烈，表明在N和O-聚糖上都有效地唾液酸化。PHA丄對N-聚糖的復雜分支結(jié)構(gòu)具有親和性并顯示出強的信號，證實了MAA的結(jié)果。PHA-L信號表明大的三或四天線N-聚糖的存在。在CHO來源的hlL-7(在可用時)上定性的大多數(shù)典型的哺乳動物O-聚糖□半乳糖I[~(~}-THR—O7V-乙酰半乳糖胺^X△唾液酸總的來看，這些分析表明使用的基于CHO細胞的表達系統(tǒng)產(chǎn)生了人類IL-7復雜的(三天線)N-連接寡糖，如同在下面的圖中描述的那樣，在它們的位于70、91和116位的ASN殘基處形成分支，具有高度的部分到完全唾液酸化，最多達10個唾液酸殘基。此外，CHO來源的IL-7在T110位上含有O-聚糖。因此，盡管帶有復雜的唾液酸化的N-聚糖和O-聚糖，IL-7純化的批次產(chǎn)品仍然含有完全和部分糖基化蛋白的混合物。實施例F:藥物物質(zhì)到藥物產(chǎn)品重組CHO細胞表達的hlL-7的配方、儲存和長期穩(wěn)定性。藥物物質(zhì)的最佳配方的搜索通過組合基質(zhì)研究進行，以評估不同的脅迫條件(溫度、緩沖液、pH、張力調(diào)節(jié)劑濃度、攪拌、強烈照明)對純化的蛋白的長期穩(wěn)定性的影響。高度復雜的純化重組人類IL-7被顯示在乙酸和琥珀酸緩沖液中，在5到50mM的濃度范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。適當?shù)膒H從pH=5.0到7.0之間選擇，理想的儲存溫度在-20。C至lj+4。C之間。糖和低濃度表面活性劑(聚山梨酸酯聚合物)可以被添加到制備物中以防止非共價的可溶性聚集。在這樣的條件下，IL-7可以在+4°C(以液體形式)下，濃度范圍從0.5到8.0mg/ml，優(yōu)選從2.0到4.0mg/ml，儲存超過12個月。液體形式的藥物組合物具有改進的穩(wěn)定性分布情況。實施例G.哺乳動物細胞來源的重組人類IL-7在特異性生物學分析中的增殖活性分析哺乳動物細胞來源的重組人類IL-7的生物學活性在特異性生物分析中被評估，使用來自CBA/C57BL小鼠的骨髓細胞衍生的鼠類前B細胞株P(guān)B-1(GermanCellBankDSMZ，DeutscheSammlungvonMikrooganismenundZellkulturen),它的生長嚴格依賴于IL-7(Mire-Sluisetal.;2000;J,Immunol.Methods;236:71-76)。這些細胞被維持在商業(yè)化的含有IL-7的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在進行生物分析之前實行IL-7饑餓。生物分析用被測試的IL-7樣品進行，平行地使用已知的大腸桿菌來源的IL-7陽性對照和缺乏IL-7的陰性對照。來自對照或樣品的IL-7被加入到饑餓的細胞培養(yǎng)物中，誘導劑量依賴性的細胞增殖的重新起始，在此期間放射性標記的胸腺嘧啶(3H-Tdr，Amersham)被分裂的細胞攝入。標記的量是跳動的，在液閃P計數(shù)器(Wallack)中測量，單位為每分鐘的計數(shù)(cpm)。此外，生物分析也可以使用反映細胞的整體代謝的染料標記物、例如MTT染料(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑，被線粒體氧化還原活性所還原)或MTS染料(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)來進行。陽性對照和被測試樣品的連續(xù)稀釋允許使用cpm數(shù)量相對于被測試的樣品/對照的量進行作圖。圖13顯示了典型的生物學分析測試中常規(guī)獲得的劑量反應性動力學數(shù)據(jù)和曲線PB-l細胞的生長被未糖基化的r-hlL-7(在大腸桿菌中表達)或高度糖基化的r-ML-7(在哺乳動物細胞中生產(chǎn))所誘導。(數(shù)據(jù)點表示三次測定的平均值士SD)。圖14顯示了典型的生物學分析測試中常規(guī)獲得的劑量反應性動力學數(shù)據(jù)和曲線PB-1細胞的生長被未糖基化的r-ML-7(在大腸桿菌中表達)、高度糖基化或超糖基化的r-ML-7(在哺乳動物細胞中生產(chǎn))所誘導。(數(shù)據(jù)點表示三次測定的平均值土SD)。對于每個樣品來說被考慮的重要參數(shù)是ED50，即給出最大活性的一半時的濃度(ng/ml)。較高的ED50意味著較低的活性。IL-7批次之間的活性比較通過分析劑量反應曲線參數(shù)例如斜率系數(shù)、最大活性來闡明。從所有曲線參數(shù)中，ED50濃度(單位為ng/ml)將參數(shù)的偏差合并在一起。ED50對應于在體外誘導一半可能的最大誘導活性所必需的IL-7劑量。在這一點上，高生物活性的分子對應于低ED50值，而較高的ED50濃度典型地來自于體外生物活性較低的IL-7制備物。然而，在本發(fā)明中，體外活性的差異并不必然代表同樣的體內(nèi)活性的差異。實施例H.超糖基化的IL-7多肽在靈長類動物中免疫原性的體內(nèi)評估在CHO細胞系中表達(實施例A2、A6和B)并按照實施例D純化的猿類超糖基化IL-7(sIL-7)，在重復地在正常靈長類動物中使用sIL-7后，在體內(nèi)評估潛在的免疫原性的出現(xiàn)。未經(jīng)免疫的年輕成年Cynomolgus猴(Macacafasdcularis)(n=4)被引入研究，并以100pg/kg/注射的劑量水平接受超糖基化的sIL-7。被處理的動物在連續(xù)5周的時間中接受總共6次IL-7的皮下注射。動物在兩個月的期間接受臨床觀察。在研究過程中的不同的時間點收集血液樣本在使用sIL-7前的第一天，在第37天和研究結(jié)束時。所有的動物在研究中存活，對于sIL-7治療沒有負面反應。sIl-7的使用是局部良好耐受的。當在目的在于檢測結(jié)合抗體的特異性ELISA中通過干涉迸行測試時，在所有被處理的動物的血清中沒有檢測到抗IL-7抗體。與此相比，大腸桿菌來源的重組IL-7盡管被生產(chǎn)為高度純化的藥物產(chǎn)品，在同樣的規(guī)程中將在血清中誘導高滴度的IL-7結(jié)合抗體的產(chǎn)生，范圍從1:400到1:5000。實施例I.超糖基化的IL-7多肽在靈長類中的體內(nèi)生物學活性在CHO細胞系中表達(實施例Al、A6和B)并按照實施例D純化的人類超糖基化IL-7(hIL-7),在體內(nèi)進行評估以確定hIL-7在正常靈長類中的藥物動力學和藥效學情況。未經(jīng)免疫的年輕成年Cynomolgus猴(Macacafascicularis)被引入研究并分為兩組未處理的11=2，ML-7100pg/kg/注射n=2。被處理的動物接受單次IL-7的皮下注射。動物在45天的期間接受臨床觀察。在研究過程中的不同的時間點收集血液樣本在第l(注射后0、3、6、9禾口12小時)、2、3、4、7、21禾口45天。hIL-7的使用具有良好的耐受性，在注射位點沒有局部反應。在恒河猴中單次皮下注射hlL-7后，從前72個小時建立了hlL-7的藥物動力學形式和參數(shù)血漿分布情況在峰值吸收之后顯示出雙指數(shù)遞減。在血漿中觀察到的產(chǎn)物半衰期在30/40小時的范圍內(nèi)。該半衰期與在同樣條件下使用大腸桿菌來源的重組IL-8(5到8小時)觀察到的半衰期相比有顯著的增加。這反映出血液中超糖基化的IL-7多肽的提高的體內(nèi)穩(wěn)定性。平均存留時間(MRT)是40小時，比較而言大腸桿菌產(chǎn)物是大約10小時。達到最大濃度的時間是180分鐘?？偟膩碚f，藥物動力學研究顯示出本發(fā)明的超糖基化的IL-7多肽顯示了改進的和延長的藥物動力學分布情況，這導致了改進的藥效學效應。以100pg/kg單次注射ML-7誘導了外周CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞數(shù)量的顯著增加，與基線預處理值相比分別改變了200%和170%。外周血中表達特異性IL-7受體ct鏈(CD127)的淋巴細胞T細胞(CD4和CD8)的數(shù)量早在注射后6小時時就暫時減少。在注射后48小時，外周血中表達CD127的淋巴細胞T細胞重新出現(xiàn)，在注射后僅僅7天就返回到基線值。在單次皮下注射大腸桿菌來源的重組IL-7之后，完全恢復表達CD127的淋巴細胞T細胞的基線值在注射后4天發(fā)生。與大腸桿菌來源的重組IL-7相比，超糖基化的IL-7多肽的受體占有率動力學更長，反映出正如下面所顯示的超糖基化的IL-7多肽在靈長類動物中的較長的半衰期。這些結(jié)果與以前的結(jié)果一致，顯示出盡管IL-7的IV給藥導致了較好的生物可用性，這并沒有轉(zhuǎn)化成改進的藥物動力學效應，事實上，通過皮下注射獲得的延長的投送形式比通過IV注射獲得的急性投送形式更為有效。這里蛋白的超糖基化誘導了延長的動力學分布情況，這轉(zhuǎn)過來轉(zhuǎn)化成改進的藥效學活性。鑒于這種擴展的分布情況，也希望獲得改進的臨床耐受性，因為藥物的副作用通常與峰值濃度有關(guān)。權(quán)利要求1.純化的哺乳動物超糖基化IL-7多肽，其中該超糖基化的IL-7多肽含有至少3個N-糖基化氨基酸殘基。2.超糖基化的IL-7組合物，其中該組合物含有至少80%的在至少3個不同的氨基酸殘基上被N-糖基化的IL-7多肽。3.權(quán)利要求2中的組合物，其中該組合物含有80%到95%之間的在至少3個不同的氨基酸殘基上被N-糖基化的IL-7多肽。4.權(quán)利要求2或3中的超糖基化的IL-7組合物，含有至少80%的IL-7多肽，該多肽在3個到最多達8個不同的氨基酸殘基上被糖基化、包括1個O-和最多達7個N-糖基化位點。5.權(quán)利要求4中的組合物，其中該組合物含有80%到95%之間的IL-7多肽，該多肽在3個到最多達8個不同的氨基酸殘基上被糖基化、包括l個0-和最多達7個N-糖基化位點。6.權(quán)利要求2到5任何一個中的超糖基化IL-7組合物，其中的IL-7多肽是人類IL-7多肽。7.權(quán)利要求2到6任何一個中的超糖基化IL-7組合物，其中的糖基化位點是在IL-7多肽序列中天然存在和/或人工產(chǎn)生的。8.權(quán)利要求2到7任何一個中的超糖基化IL-7組合物，其中的IL-7多肽是人類IL-7多肽，以及其中的糖基化位點選自70、91和116位的Asn殘基，110位的Thr，以及表1中和優(yōu)選在表2中列出的任何人工產(chǎn)生的糖基化位點，或其組合。9.權(quán)利要求2到7任何一個中的超糖基化IL-7組合物，其中該IL-7多肽含有或富集選自下面的N-連接的糖鏈a)哺乳動物類型的糖鏈，優(yōu)選為CHO細胞表達的類型；b)含有復雜的N-糖鏈(例如三天線或二天線結(jié)構(gòu))、更優(yōu)選含有大量甘露糖和乙酰葡萄糖胺分子和大量末端唾液酸殘基的糖鏈；c)被a-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶或a-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸化的糖鏈；和/或d)顯示出3到30個、優(yōu)選7到23個唾液酸基-N-乙酰半乳糖胺的唾液酸化的糖鏈。10.權(quán)利要求9中的超糖基化的IL-7組合物，其中該IL-7多肽還含有或還富集具有末端唾液酸殘基的O-連接的糖鏈。11.權(quán)利要求9中的超糖基化的IL-7組合物，其中的糖鏈含有帶有部分或完全末端唾液酸化的四天線到二天線結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選含有三或二唾液酸化的三天線結(jié)構(gòu)，和/或帶有二唾液酸化的二天線結(jié)構(gòu)。12.權(quán)利要求2到11任何一個中的超糖基化IL-7組合物，其中該IL-7多肽的平均等電點低于6.5，用質(zhì)譜分析確定的平均表觀分子量大于25KDa，或用SDS凝膠電泳確定的平均分子量大于27KDa.13.權(quán)利要求2到12任何一個中的超糖基化IL-7組合物，其中該IL-7超糖基化多肽顯示在哺乳動物宿主中延長的體內(nèi)半衰期和平均存留時間。14.具有修飾的氨基酸序列的IL-7多肽，其中該序列含有至少1個人工產(chǎn)生的糖基化位點。15.權(quán)利要求14中的多肽，其中該多肽含有l(wèi)、2、3或4個，更優(yōu)選l、2或3個，甚至更優(yōu)選1或2個人工產(chǎn)生的糖基化位點。16.權(quán)利要求14或15中的多肽，其中該多肽含有的人類IL-7多肽的序列含有選自下面的一個或幾個氨基酸修飾Lys28Asn-11e30Ser-Ue30Thr-I固Asn-Ser32Thr-Leu35Ser-Leu35Thr-Glu38Ser-Glu38Thr-Phe39Ser-Phe39Thr-Phe42Ser-Phe42Thr-Glu52Ser-Glu52Thr-Val82Asn-Glu84Thr-Glu84Ser-Lys97Asn-Arg99Thr-Arg99Ser-Alal02Asn-Leul04Thr-Leul04Ser-Leul04Asn-Glul06Thr-Glul06Ser-Leul28Ser-Leul28Thr-11el45Asn-Metl47Thr-Metl47Ser-Metl47Asn-Thrl49Ser，或者含有至少5個氨基酸殘基，典型至少8、9、10、11、12或15個殘基的其不同的片段。17.為權(quán)利要求14-15任何一個中的IL-7多肽編碼的核酸分子。18.為含有SEQIDNO:19的多肽編碼的核酸分子。19.含有SEQIDNO:2或4的序列或其互補鏈的核酸分子。20.含有SEQIDN0:6的序列的核酸分子。21.含有權(quán)利要求17到20任何一個中的核酸分子的載體。22.含有權(quán)利要求21中的載體的重組宿主或宿主細胞。23.權(quán)利要求22中的重組宿主或宿主細胞，其中該宿主或宿主細胞天然地或在轉(zhuǎn)基因后表達或過量表達適合的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因，優(yōu)選為a-2-6唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因。24.生產(chǎn)在權(quán)利要求l到16任何一個中定義的IL-7多肽的方法，包括a)培養(yǎng)含有編碼IL-7多肽的重組核酸分子的重組宿主細胞，和b)收集該細胞生產(chǎn)的IL-7多肽，其中培養(yǎng)以補料分批或流加的方式進行，從而產(chǎn)生超糖基化的IL-7多肽。25.含有權(quán)利要求2到16任何一個中的IL-7多肽組合物的藥物物質(zhì)，其中該藥物物質(zhì)含有少于大約10。/。的未糖基化或單糖基化的IL-7多肽和/或基本上不含與產(chǎn)物有關(guān)的雜質(zhì)。26.與前面在權(quán)利要求1到16任何一個中定義的IL-7多肽具有特異性免疫反應的抗體，及其片段或衍生物。27.含有權(quán)利要求26中的抗體的藥物組合物。28.權(quán)利要求26中的抗體在生產(chǎn)用于治療哺乳動物受試者中的淋巴增殖性紊亂或自身免疫疾病的藥物中的應用。29.藥物組合物，含有有效量的權(quán)利要求25中的藥物物質(zhì)和一種或多種藥物可相容的載體或賦形劑。30.權(quán)利要求29中的藥物組合物，其中該組合物每星期給藥3次，每星期給藥2次，每星期給藥l次，每兩星期給藥l次，每月給藥1次，在疫苗接種之前或疫苗接種前后給藥1次或2次。31.權(quán)利要求2到13任何一個中的超糖基化IL-7多肽組合物在生產(chǎn)用于在受試者中引起或調(diào)節(jié)免疫反應的藥物中的應用。32.權(quán)利要求31中的應用，其中的藥物用于誘導延長的淋巴細胞生成刺激和/或免疫反應的放大。33.權(quán)利要求31中的應用，其中的藥物用于治療病毒感染，例如添加物+50ng/ml活化素A。18-24小時后除去培養(yǎng)基并更換成RPMI+IXB27添加物+50ng/mlBMP-4，其中不含活化素A。在含BMP-4的培養(yǎng)基中總共培養(yǎng)4天后除去培養(yǎng)基并更換成不含活化素或BMP的RPMI+IXB27添加物+50ng/mlIGF-1。每2-3天除去用過的培養(yǎng)基并更換成新鮮的不含活化素或BMP的RPMI+IXB27添加物+50ng/mlIGF-1。對細胞計數(shù)并通過FACS分析心肌鈣蛋白I的表達，其過程如下FACS分析一吸出培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基。各孔用5ml不含鈣/鎂的PBS沖洗。在各孔加入lml0.25%胰蛋白酶/500mMEDTA溶液，并將細胞在37"C孵育5分鐘。將用胰蛋白酶分離的細胞轉(zhuǎn)移到15ml的圓錐管中并再在37"C孵育15-20分鐘。用移液管研磨細胞直到獲得單細胞懸液。加入2ml含20%FBS的培養(yǎng)基(含20%FBS的KnockoutDMEM)終止胰蛋白酶消化。通過計數(shù)估算細胞濃度，每次染色(EMA、同種型、cTnl、cTnl+EMA;都含在15ml圓錐管中)使用約500,000個細胞。將含有細胞的試管400xg離心5分鐘。吸出培養(yǎng)基并將細胞團重懸于1ml染色緩沖液(PBS+2%熱滅活的胎牛血清和0.1%疊氮化鈉)。為進行EMA染色，在細胞中加入EMA使其終濃度為5微克/毫升。將這些樣品在黑暗中于冰上培育15分鐘，然后按上文所述離心。將經(jīng)EMA處理的樣品重懸于1mlPBS并在光下暴露10分鐘。在EMA處理的樣品中加入1ml4。/。低聚甲醛并在黑暗中室溫培育15分鐘。將未加入EMA但隨后用抗體染色的樣品按上文所述離心，重懸于500微升PBS，然后加入500微升4%低聚甲醛，然后在黑暗中室溫培育15分鐘。將所有樣品按上文所述離心并重懸于100微升PBS。然后在所有樣品中加入900微升冰冷的100%甲醇并在冰上培育30分鐘。在所有樣品中加入1ml染色緩沖液(PBS+2%熱滅活的胎牛血清和每0.5><106個細胞0.2微克大鼠抗小鼠Fc片段(BD))并按上文所述離心。吸出上清液并將細胞以約500,000細胞/100微升的密度重懸于封閉緩沖液(PBS+20%正常山羊血清和0.1%疊氮化鈉)。將樣品在4'C培育10-15分鐘。對于各染色樣品，取100微升等份細胞加入單獨的12x75mm聚苯乙烯管。在要染色的各份樣品中加入20微升心肌鈣蛋白I抗體(光譜診斷公司)或同種型對照(各管中抗體的最終含量為1.2微克)。將樣品在4"培育30分鐘。加入4ml染色緩沖液，然后按上文所述離心樣品。除去第二次的洗滌上清液后將樣品重懸于50微升用PBS配制的含0.25微克第二抗體的5%正常山羊血清溶液，在黑暗中于4。C培育30分鐘，再用4ml染色緩沖液全文摘要本發(fā)明涉及新的和改進的白介素-7多肽，以及含有它們的組合物、它們的制劑和應用。更具體來說，本發(fā)明涉及了具有改進的性質(zhì)的超糖基化的IL-7多肽，以及它們的生產(chǎn)和治療性應用。本發(fā)明還公開了具有修飾的氨基酸序列、含有人工產(chǎn)生的糖基化位點的新的IL-7多肽，以及相應的核酸分子、載體和重組宿主細胞。本發(fā)明還涉及了使用這樣的多肽、細胞或核酸，用于治療性或預防性治療哺乳動物受試者，包括人類受試者。文檔編號C12N15/19GK101228275SQ200680026503公開日2008年7月23日申請日期2006年7月19日優(yōu)先權(quán)日2005年7月20日發(fā)明者依安娜·朗塞,安娜·格雷瓜爾,布里吉特·阿蘇利納,科里納·布雷克,米歇爾·莫雷爾申請人:敘塞理斯