專利名稱：一種新型的蛋白質(zhì)糖基化接枝的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及蛋白改性的方法，特別涉及一種新型的蛋白質(zhì)糖基化 接枝的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)和多糖是共存于食品乳化體系中最重要的兩類生物大分子，是影響食品結(jié) 構(gòu)和質(zhì)構(gòu)的主要因素。蛋白質(zhì)因能在液液或氣液界面上形成吸附層來(lái)降低界面張力而多在 膠體體系中充當(dāng)乳化劑，多糖則由于其良好的增稠和持水特性而常用做穩(wěn)定劑，由此賦予 了體系不同于兩者單獨(dú)存在時(shí)的功能表現(xiàn)。共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)與多糖形成接枝物，既保 留了蛋白質(zhì)的表面活性又具有多糖的親水性能，與蛋白質(zhì)多糖弱相互作用形成的混合物對(duì) 比，對(duì)環(huán)境條件(溫度、PH值、離子強(qiáng)度等)具有較高的適應(yīng)性。通過(guò)自發(fā)的Maillard反應(yīng)使蛋白質(zhì)的ε -氨基基團(tuán)與多糖的還原性羰基末端結(jié) 合，可以得到具有優(yōu)越功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)糖基化接枝物。到目前為止，有效的制備方法依然 是干熱法，其原理是通過(guò)在較低的水分活度下蛋白質(zhì)中的氨基處于非聚集的反應(yīng)狀態(tài)，如 此以提供反應(yīng)基團(tuán)與多糖發(fā)生共價(jià)結(jié)合。但是干熱法具有反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，Maillard反應(yīng)程度 不可控制等自身的缺陷。在食品工業(yè)中，食品科學(xué)家們經(jīng)常希望反應(yīng)發(fā)生在自由的水相中， 而傳統(tǒng)的水溶液中發(fā)生Maillard反應(yīng)生成糖基化蛋白的同時(shí)也會(huì)使蛋白分子變性以及產(chǎn) 生蛋白聚集。因此，到目前為至，始終無(wú)法使多糖與蛋白的Maillard反應(yīng)在水溶液中有效 進(jìn)行。“大分子擁擠”(macromolecular crowding)是生命科學(xué)領(lǐng)域中全新的概念，近幾 年科學(xué)家強(qiáng)烈建議把“大分子擁擠”環(huán)境與PH、離子強(qiáng)度和溶液組成等因素一樣作為常規(guī)因 素來(lái)研究生物大分子。當(dāng)體系中存在有高濃度的生物大分子時(shí)，大分子之間的反應(yīng)遵循分 子排斥容積理論(excluded volume effect)，促進(jìn)反應(yīng)向溶質(zhì)總體積減小的方向，即朝結(jié) 合方向移動(dòng)；另外，大分子擁擠環(huán)境下蛋白分子構(gòu)型趨于穩(wěn)定，蛋白變性程度以及聚集程度 將會(huì)減輕。由此，本項(xiàng)目提出將多糖和蛋白質(zhì)作為生物大分子處于大分子擁擠環(huán)境中，蛋白 能夠處于非變性或少聚集的反應(yīng)狀態(tài)，與多糖的Maillard反應(yīng)也將在水溶液中向著形成 共價(jià)結(jié)合的反應(yīng)途徑進(jìn)行。本發(fā)明將生命科學(xué)中的“大分子擁擠”環(huán)境應(yīng)用于生成蛋白多 糖功能性大分子，根據(jù)大分子擁擠環(huán)境下的分子排斥容積理論，水溶液中的蛋白與多糖將 優(yōu)先向著結(jié)合的方向進(jìn)行，同時(shí)使得在此環(huán)境中蛋白發(fā)生聚集或變性的幾率大大降低，而 作為“擁擠試劑”的大分子，可以是惰性高聚物，也可以是同時(shí)參與反應(yīng)的多糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的蛋白質(zhì)糖基化接枝方法。本發(fā)明模擬生命科學(xué)領(lǐng) 域的大分子擁擠體系，體系中的擁擠試劑可以是惰性高聚物或葡聚糖。該法具有操作方便、 反應(yīng)時(shí)間短、性能穩(wěn)定、所得產(chǎn)物沒(méi)有產(chǎn)生褐變等優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)品具有良好的工業(yè)化、規(guī)?；?應(yīng)用前景，該方法克服了現(xiàn)有蛋白質(zhì)和糖接枝方法難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的缺陷。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種新型的蛋白質(zhì)糖基化接枝的方法，包括以下步驟(1)在擁擠試劑中加入緩沖溶液，攪拌，得到溶液；(2)將蛋白和葡聚糖加入步驟(1)得到的溶液中，攪拌2h后，加入NaN3,在5°C放 置24h，再在50 70°C攪拌12 48h后，迅速冷卻至低于25°C，得到糖基化蛋白產(chǎn)物；所述擁擠試劑的質(zhì)量份數(shù)為10 40份，蛋白的質(zhì)量份數(shù)為1 10份，蛋白與多糖的質(zhì)量比為1 3 1 6。所述蛋白為大豆酸沉蛋白、大豆分離蛋白、乳清蛋白、β _乳球蛋白或小麥面筋蛋 白。所述擁擠試劑為高分子惰性聚合物或多糖。所述擁擠試劑為高分子惰性聚合物，例如；Ficoll 70或PEG2000。所述擁擠試劑為多糖，例如Dextran70、Dextran 10 或 Dextran 40。所述緩沖溶液是pH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液一種新型的蛋白質(zhì)糖基化接枝的方法，包括以下步驟(1)將蛋白和擁擠試劑溶解于緩沖溶液，攪拌2h后，加入NaN3,(2)在5°C放置24h，再在50 70°C攪拌12 48h后，迅速冷卻至低于25°C，得到 糖基化蛋白產(chǎn)物；蛋白與擁擠試劑的質(zhì)量比為1 3 1 6。所述蛋白為大豆酸沉蛋白、大豆分離蛋白、乳清蛋白、β _乳球蛋白或小麥面筋蛋 白。所述擁擠試劑為多糖。例如Dextran70、Dextran 10 或 Dextran 40。所述緩沖溶液是pH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述的方法制備的糖基化蛋白產(chǎn)物。所述的糖基化蛋白產(chǎn)物在制備改性蛋白或食品添加劑中的應(yīng)用。所述的糖基化蛋白產(chǎn)物可以不純化或者利用凝膠過(guò)濾色譜純化除去未反應(yīng)的蛋 白和葡聚糖以及惰性高聚物。本發(fā)明原理如下通過(guò)自發(fā)的Maillard反應(yīng)使蛋白質(zhì)的ε -氨基基團(tuán)與多糖的還原性羰基末端結(jié) 合，可以得到具有優(yōu)越功能性質(zhì)的蛋白糖基化共價(jià)接枝物。因此在反應(yīng)過(guò)程中選用反應(yīng)接 枝程度作為檢測(cè)指標(biāo)。接枝度采用OPA法即鄰苯二甲醛方法測(cè)定反應(yīng)液中自由氨基的含 量，反映出接枝改性的程度，其原理是依據(jù)OPA與蛋白質(zhì)中的自由氨基在β-巰基乙醇的存 在下，生成的化合物在340nm處有吸收，據(jù)此利用分光光度法可計(jì)算出反應(yīng)液中的自由氨 基含量，以反應(yīng)接枝改性的程度。本發(fā)明采用“大分子擁擠環(huán)境”作為生成糖基化蛋白的反應(yīng)體系，通過(guò)將生命科學(xué) 領(lǐng)域中擁擠理論對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的科學(xué)現(xiàn)象進(jìn)一步應(yīng)用于蛋白質(zhì)糖基化接枝物的制備。 大分子擁擠環(huán)境能夠使蛋白分子在水溶液中同樣處于非聚集或者較少聚集的反應(yīng)狀態(tài)，同 時(shí)，促進(jìn)蛋白與多糖的反應(yīng)向著共價(jià)結(jié)合的方向進(jìn)行。本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果
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(1)在本發(fā)明中，大豆蛋白與多糖的共價(jià)接枝，不需要任何化學(xué)試劑作為催化劑， 僅在水相溶液中在溫和的溫度下進(jìn)行，模擬生命科學(xué)領(lǐng)域中的“大分子擁擠環(huán)境”進(jìn)行蛋白 質(zhì)的糖基化反應(yīng)；反應(yīng)速度較快，產(chǎn)物顏色呈乳白色；(2)水相反應(yīng)中可以自由攪拌反應(yīng)，克服了干熱反應(yīng)中反應(yīng)不均勻的缺點(diǎn)，最大程 度地多糖和蛋白質(zhì)充分接觸；(3)與其他接枝改性方法相比，本發(fā)明具有規(guī)?；膽?yīng)用前景，工業(yè)可操作性強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 準(zhǔn)確稱取0. 5g大豆蛋白、1. 5g葡聚糖，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉 緩沖溶液，室溫?cái)嚢?h后，加入3滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，在5°C放置24h，恒溫60°C，攪 拌速度為500r/min條件下攪拌30h。反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，冷凍干燥，得 到糖基化蛋白產(chǎn)物。對(duì)比實(shí)施例1-1 準(zhǔn)確稱取0. 5g大豆蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，室 溫?cái)嚢?h后，加入3滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，在5°C放置24h，恒溫60 V，攪拌速度為500r/ min條件下攪拌30h。反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，冷凍干燥。對(duì)比實(shí)施例1-2 準(zhǔn)確稱取0. Olg大豆蛋白、0. 03g葡聚糖，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸 鈉緩沖溶液，室溫?cái)嚢?h后，加入3滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，在5°C放置24h，恒溫60°C， 攪拌速度為500r/min條件下攪拌30h。反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，冷凍干燥。采用鄰苯二甲醛方法測(cè)定所得糖基化大豆蛋白的接枝度。實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例 1結(jié)合物的性能對(duì)比結(jié)果如表1所示表 1 從表1可以看出，本發(fā)明實(shí)施例1中以葡聚糖既作為擁擠試劑又作為反應(yīng)多糖所 得糖基化蛋白接枝度高，顏色白色，對(duì)比實(shí)施例1-2中由于體系反應(yīng)體濃度太低，沒(méi)有使多 糖與蛋白有效結(jié)合，接枝度較低，反應(yīng)效果不明顯；大豆蛋白進(jìn)行同樣條件下的熱處理(對(duì) 比實(shí)施例1-1)后說(shuō)明蛋白質(zhì)本身無(wú)法發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。實(shí)施例2 將lgPEG2000做為擁擠試劑置于反應(yīng)裝置中，加入IOmL 0. 01mol/L pH 7. 0的磷 酸鈉緩沖溶液，攪拌2h，使之充分水化溶解，0. 2g大豆蛋白和0. 6g葡聚糖加入該含有擁擠 試劑的溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，加入NaN3 (0. 02 % w/w)防腐，在5°C放置24h后，50°C攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至24°C，得到糖基化蛋白產(chǎn)物，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜純化除去未反 應(yīng)的蛋白和葡聚糖以及惰性高聚物PEG2000。對(duì)比實(shí)施例2-1:將Ig PEG2000做為擁擠試劑置于反應(yīng)裝置中，加入IOmL 0. 01mol/L pH 7. 0的磷 酸鈉緩沖溶液，攪拌2h，使之充分水化溶解，0. 2g大豆蛋白加入該含有擁擠試劑的溶液中， 充分?jǐn)嚢?h后，加入NaN3 (0. 02% w/w)防腐，在5°C放置24h后，50°C攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束后 迅速冷卻至24°C，得到糖基化蛋白產(chǎn)物，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜純化除去未反應(yīng)的蛋白和葡聚 糖以及惰性高聚物PEG2000。對(duì)比實(shí)施例2-2:反應(yīng)裝置加入IOmL 0. 01mol/L pH 7. 0的磷酸鈉緩沖溶液，攪拌2h，0. 2g大豆蛋 白和0. 6g葡聚糖加入到該溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，加入NaN3(C). 02% w/w)防腐，在5°C放置 24h后，50°C攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至24°C，得到糖基化蛋白產(chǎn)物，通過(guò)凝膠過(guò)濾色 譜純化除去未反應(yīng)的蛋白和葡聚糖。表2 從表2實(shí)施例2和對(duì)比實(shí)施例結(jié)合物的性能對(duì)比可以看出，本發(fā)明實(shí)施例2在以 PEG2000為擁擠試劑所得糖基化蛋白接枝度較高，顏色白色，對(duì)比實(shí)施例2-2中由于體系中 沒(méi)有添加惰性擁擠試劑，沒(méi)有形成大分子擁擠環(huán)境，沒(méi)有使多糖與蛋白有效結(jié)合，接枝度較 低，反應(yīng)效果不明顯；大豆蛋白進(jìn)行同樣條件下的熱處理(對(duì)比實(shí)施例2-1)后說(shuō)明蛋白質(zhì) 本身無(wú)法發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。實(shí)施例3 準(zhǔn)確稱取0. 6g大豆蛋白、3. 6g葡聚糖，溶解于20mL 0. 01mol/L pH 7. 5的磷酸鈉 緩沖溶液，室溫?cái)嚢?h后，加入3滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，在5°C放置24h，恒溫70°C，攪 拌速度為500r/min條件下攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，冷凍干燥。實(shí)施例4 將1. 5gPEG2000做為擁擠試劑置于反應(yīng)裝置中，加入IOmL 0. 01mol/L pH 6. 0的 磷酸鈉緩沖溶液，攪拌2h，使之充分水化溶解，0. 5g大豆蛋白和2. 5g葡聚糖加入該含有擁 擠試劑的溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，加入NaN3(C). 02% w/w)防腐，在5°C放置24h后，60°C攪 拌36h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至20°C，得到糖基化蛋白產(chǎn)物，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜純化除去未 反應(yīng)的蛋白和葡聚糖以及惰性高聚物PEG2000。實(shí)施例5 將1. 5g Ficol 170做為擁擠試劑置于反應(yīng)裝置中，加入IOmL 0. 01mol/L pH 5. 5 的磷酸鈉緩沖溶液，攪拌2h，使之充分水化溶解，0. 5g大豆蛋白和3. Og葡聚糖加入該含有擁擠試劑的溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，加入NaN3 (0. 02 % w/w)防腐，在5°C放置24h后，70 V 攪拌12h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至19°C，得到糖基化蛋白產(chǎn)物，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜純化除去 未反應(yīng)的蛋白和葡聚糖以及Ficoll70。
權(quán)利要求
一種新型的蛋白質(zhì)糖基化接枝的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)在擁擠試劑中加入緩沖溶液，攪拌，得到溶液；(2)將蛋白和葡聚糖加入步驟(1)得到的溶液中，攪拌2h后，加入NaN3，在5℃放置24h，再在50～70℃攪拌12～48h后，迅速冷卻至低于25℃，得到糖基化蛋白產(chǎn)物；所述擁擠試劑的質(zhì)量份數(shù)為10～40份，蛋白的質(zhì)量份數(shù)為1～10份，蛋白與多糖的質(zhì)量比為1∶3～1∶6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白為大豆酸沉蛋白、大豆分離蛋 白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麥面筋蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述擁擠試劑為高分子惰性聚合物或多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖溶液是ρΗ5. 0 8. 0的磷酸鹽 緩沖液。
5.一種新型的蛋白質(zhì)糖基化接枝的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將蛋白和擁擠試劑溶解于緩沖溶液，攪拌2h后，加入NaN3,(2)在5°C放置24h，再在50 70°C攪拌12 48h后，迅速冷卻至低于25°C，得到糖基 化蛋白產(chǎn)物；蛋白與擁擠試劑的質(zhì)量比為1 3 1 6。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白為大豆酸沉蛋白、大豆分離蛋 白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麥面筋蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述擁擠試劑為多糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述緩沖溶液是ρΗ5.0 8.0的磷酸鹽 緩沖液。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的方法制備的糖基化蛋白產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求9所述的糖基化蛋白產(chǎn)物在制備改性蛋白或食品添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型的蛋白質(zhì)糖基化接枝方法，包括如下步驟(1)在擁擠試劑中加入緩沖溶液，攪拌，得到溶液；(2)將蛋白和葡聚糖加入步驟(1)得到的溶液中，攪拌2h后，加入NaN3，在5℃放置24h，再在50～70℃攪拌12～48h后，迅速冷卻至低于25℃，得到糖基化蛋白產(chǎn)物；本發(fā)明操作方便，反應(yīng)效率高，接枝物其水溶性、乳化性、抗氧化性等功能性質(zhì)有很大的提高，產(chǎn)品具有工業(yè)化、規(guī)?；膽?yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08H1/00GK101906213SQ20101023745
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者卓秀英, 楊曉泉, 齊軍茹 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)