專利名稱：糖基化相關(guān)的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖基化相關(guān)的材料和方法，其更具體地說涉及糖基化結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)，所述結(jié)構(gòu)耐受酶促降解，因而調(diào)節(jié)其一個或多個生物特性或整合它們的治療部分的生物特性。更具體地說，本發(fā)明涉及使活化的含氟糖底物(例如，3-氟唾液酸化合物)與糖接受體 (sugar acceptor)反應(yīng)以產(chǎn)生糖接受體與一種或多種所述唾液酸化合物的共價綴合物。
背景技術(shù)：
多數(shù)天然多肽含有糖部分，所述部分在一級多肽鏈的一些氨基酸殘基處共價連接至所述多肽。在本領(lǐng)域中，這些多肽一般稱為糖肽或糖蛋白。還已知，當(dāng)多肽存在于生物系統(tǒng)(例如，細胞或個體)時，任何給定多肽上的糖基化模式的性質(zhì)可影響其特性，所述特性包括蛋白酶抗性、細胞內(nèi)運輸、分泌、組織靶向、生物半衰期和抗原性。多肽的糖基化是翻譯后修飾的天然形式，其改變多肽的結(jié)構(gòu)和功能。在自然界中， 通過酶促的過程引入糖基化，導(dǎo)致不同類型糖基化多肽的位點特異性修飾。在N-連接的糖基化中，聚糖被連接至天冬酰胺側(cè)鏈的酰胺氮，而在0-連接的糖基化中，聚糖連接至絲氨酸和蘇氨酸側(cè)鏈的羥基氧。其他形式的糖基化包括糖胺聚糖(其連接至絲氨酸的羥基氧)、 糖脂(其中聚糖連接至神經(jīng)酰胺)、透明質(zhì)烷(其不連接至蛋白或脂質(zhì))和GPI錨(其通過聚糖連接將蛋白連接至脂質(zhì))。本領(lǐng)域中的普遍問題是糖基化通常加至真核細胞中的多肽，但很少加至經(jīng)常用于治療性多肽重組表達的原核宿主中所表達的多肽。原核宿主中產(chǎn)生的多肽中糖基化的缺乏可導(dǎo)致所述多肽被識別為外源物，或者意味著其具有其他不同于其天然形式的特性。還有一個問題是，在試圖在沒有天然糖基化的位置將糖基化改造進入多肽來調(diào)節(jié)肽特征時，發(fā)現(xiàn)其非常困難。因此，例如在多肽的表達可引起多肽的天然糖基化形式改變(例如，在細菌宿主中表達)或需要修飾多肽的糖基化形式以改進所述多肽的一個或多個特征(尤其是當(dāng)所述多肽是治療性蛋白時)的情況下，本領(lǐng)域中一直在嘗試引入或修飾多肽的糖基化形式。例如，參見US專利No =7226903中描述的干擾素β的修飾。連接至多肽的聚糖分子具有一系列直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)和不同長度的聚糖鏈，并且多肽上存在的特定聚糖分子影響所述多肽的特征。很多類型的聚糖分子包括末端唾液酸。這些在生理ρΗ下帶負電荷的9個碳原子的糖被認為參與配體-受體相互作用，所述相互作用可極大地影響特定的細胞-細胞、病原體-細胞或藥物-細胞的通訊。包含末端唾液酸殘基的聚糖鏈的一個特別的特征是其增加以所述唾液酸糖基化的治療性多肽的半衰期。通過這樣的觀察而得知包含無末端唾液酸殘基的聚糖被肝從循環(huán)中迅速地除去，因而降低治療性多肽的半衰期。氟取代的糖已被用作不可加工的底物用于結(jié)晶酶，例如CstII (Chiu等，Nat. Struct. Mol. Biol. (2004) 11，163-170)。在這種情況下，在含氟糖的糖苷連接處，含氟的糖已知對酶促加工有抗性。
2，3-二氟唾液酸衍生物已被合成，并且用作來自寄生蟲克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi) (Watts 等，J. Am. Chem. Soc. (2003) 125,7532-7533)和讓氏錐蟲(Trypanosoma rangeli) (Watts 等，Can. J. Chem. (2004)82,1581-1588)之唾液酸酶的滅活劑。該前期工作導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)這些唾液酸酶通過共價的唾液酸基酶中間體的參與而運作，并且確立例如該衍生物的化合物作為錐蟲唾液酸酶的時間依賴性的共價滅活劑而發(fā)揮作用。隨后，還已知在C-5具有羥基(而非天然的N-乙酰基基團)的2，3-二氟神經(jīng)氨酸衍生物也作為讓氏錐蟲(T. rangeli)唾液酸酶的共價滅活劑而發(fā)揮作用，但顯示出對原抑制劑(Watts等，J. Biol. Chem. (2006) 281，4149-4155)非常不同的動力學(xué)行為(k非活性和
k反應(yīng)性)?？傊嚯奶擒盏男揎?尤其是對其生物特性的修飾)仍然是本領(lǐng)域中具有挑戰(zhàn)性的問題和尚未被以滿意的方式解決的問題。發(fā)明概述廣義上，本發(fā)明的基礎(chǔ)是這樣的認識氟唾液酸化合物(例如，3-氟唾液酸化合物)可被用于與糖接受體形成綴合物，其調(diào)節(jié)所述綴合物或整合有所述綴合物的治療性部分(therapeutic moiety)的一個或多個生物特性。因此，使用這些方法所產(chǎn)生的修飾的糖基化結(jié)構(gòu)可被引入治療性部分(例如，多肽)或者是其一部分。因此，一方面，本發(fā)明涉及用于使活化的3-氟唾液酸化合物與糖接受體基團反應(yīng)的方法，其中所述3-氟唾液酸化合物并不像本領(lǐng)域中常規(guī)使用的那樣連接至CMP基團。該方法可酶促進行(例如使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶(sialyl transferase)、轉(zhuǎn)唾液酸酶(trans_sialidase)或使用來自糖化學(xué)領(lǐng)域的合成技術(shù))。唾液酸轉(zhuǎn)移酶被用于轉(zhuǎn)移唾液酸衍生物至接受體糖，使用天然或修飾的天然底物(S卩，CMP-唾液酸或其衍生物)作為所述酶的供體。反轉(zhuǎn)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(inverting sialyl transferase) PmSTl已被證明將3_氟-CMP唾液酸轉(zhuǎn)移至半乳糖基接受體，然而，該反應(yīng)使用二酶一鍋法(two-enzyme one-pot method)原位產(chǎn)生天然供體糖的3_氟類似物 (Harshal 等，J. Am. Chem. Soc. (2007) 129，10630-10631)。然而，使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶，從未將非天然的活化3-氟唾液酸轉(zhuǎn)移至糖接受體，且在此之前，尚未提出將3-氟唾液酸的特性整合進入多肽的糖基化結(jié)構(gòu)。因此，在第一個方面，本發(fā)明提供包括在糖接受體和3-氟唾液酸化合物之間形成共價綴合物的方法，所述方法包括將糖接受體與3-氟唾液酸化合物相接觸，該接觸步驟在適于使3-氟唾液酸化合物與糖接受體反應(yīng)并與其共價鍵合的條件下發(fā)生，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞嘧啶一磷酸(CMP，cytosine monophosphate)基團。在一個實施方案中，該方法包括將糖接受體、3-氟唾液酸化合物和能夠?qū)?-氟唾液酸化合物轉(zhuǎn)移至所述糖接受體的酶相接觸，該接觸步驟在適宜使3-氟唾液酸化合物轉(zhuǎn)移至糖接受體并取其共價鍵合的條件下發(fā)生。該酶可包括唾液酸轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)唾液酸酶。作為替代或補充，3-氟唾液酸化合物與糖接受體的共價鍵合還通過合成化學(xué)反應(yīng)來進行。一般來說，與3-氟唾液酸化合物之共價綴合物的形成調(diào)節(jié)糖接受體或包含所述糖接受體的治療性部分的生物特性，例如酶水解(例如，通過外-唾液酸酶 (exo-sialidase)或神經(jīng)氨酸苷酶)抗性、生物穩(wěn)定性或藥代動力學(xué)特性。優(yōu)選地，該方法作為體外無細胞方法而進行。在轉(zhuǎn)移反應(yīng)為酶促反應(yīng)的情況下，其可發(fā)生時伴有在3-氟唾液酸化合物和接受體糖基團之間異頭連接處的倒轉(zhuǎn)(inversion)。 與現(xiàn)有技術(shù)中基于CMP的方法不同，本發(fā)明的方法可使用一種酶進行。本發(fā)明還幫助克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，即已知的CMP 3-氟唾液酸化合物的少量已知例子被證明對唾液酸轉(zhuǎn)移酶非常穩(wěn)定，因而在合成氟唾液酸綴合物中并不實用。在一些實施方案中，該方法可包括修飾已存在于多肽上的糖基化結(jié)構(gòu)(例如，表達產(chǎn)生的或之前合成產(chǎn)生的糖基化結(jié)構(gòu))的步驟。在一個典型的情況下，其可包括從初始存在于多肽上的糖基化結(jié)構(gòu)中除去一個或多個末端糖基基團以形成接受體基團和/或用一個或多個3-氟唾液酸基團替代糖基化結(jié)構(gòu)的末端糖基基團的額外步驟。為了方便起見， 酶促地進行除去所述末端糖基基團的步驟，例如通過使用唾液酸酶來進行?；蛘撸F(xiàn)有的糖基化結(jié)構(gòu)可被進一步切割或改變(例如不僅除去末端糖基基團)以提供根據(jù)本發(fā)明可使用的糖接受體。此外，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可包含將多個3-氟唾液酸基團轉(zhuǎn)移至多肽的接受體基團。這樣做是為了提供額外保護，以使核心糖基化結(jié)構(gòu)免受降解。舉例來說， 通過重復(fù)連接連續(xù)的3-氟唾液酸基團或?qū)?-氟唾液酸基團寡聚物共價連接至接受體的方法，兩個、三個或更多個3-氟唾液酸基團可共價連接至接受體基團。在一些實施方案中， 3-氟唾液酸基團可綴合至多肽上存在的糖基化結(jié)構(gòu)的末端糖基殘基。優(yōu)選地，本申請中公開的方法使用通式(I)所示的3-氟唾液酸化合物
權(quán)利要求
1.一種方法，其包括在糖接受體和3-氟唾液酸化合物之間形成共價綴合物，所述方法包括將所述糖接受體和3-氟唾液酸化合物相接觸，所述接觸步驟在適于使所述3-氟唾液酸化合物與所述糖接受體反應(yīng)并共價鍵合的條件下進行，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞嘧啶一磷酸(CMP)基團。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括將所述糖接受體、所述3-氟唾液酸化合物和能夠?qū)⑺?-氟唾液酸化合物轉(zhuǎn)移至所述糖接受體的酶相接觸，所述接觸步驟在適合轉(zhuǎn)移所述3-氟唾液酸化合物并使其共價鍵合至所述糖接受體的條件下進行。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述3-氟唾液酸化合物與所述糖接受體的共價鍵合是通過合成化學(xué)反應(yīng)進行的。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中與3-氟唾液酸化合物的共價綴合物的形成調(diào)節(jié)糖接受體或包含所述糖接受體的治療性部分的生物特性。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述生物特性是對酶水解的抵抗、生物穩(wěn)定性或藥代動力學(xué)特性。
6.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述方法是體外無細胞方法。
7.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述3-氟唾液酸化合物表示為以下通式(I)
8.權(quán)利要求7的方法，其中R1是甲磺酸酯/鹽、4-甲苯磺酸酯/鹽、三氟甲基磺酸酯/ 鹽、三氟甲基甲苯磺酸酯/鹽、咪唑磺酸酯/鹽或鹵素(F、Cl.Br, I)。
9.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)移反應(yīng)是酶促的，伴有在3-氟唾液酸化合物和糖接受體之間異頭連接處的倒轉(zhuǎn)。
10.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述糖接受體是糖基化結(jié)構(gòu)的一部分。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含單觸角結(jié)構(gòu)、雙觸角結(jié)構(gòu)、三觸角結(jié)構(gòu)或復(fù)合糖基化結(jié)構(gòu)。
12.權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的方法，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含天然的或合成的單糖、寡糖或多糖。
13.權(quán)利要求10至12中任一項的方法，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含N連接的或0連接的糖基團。
14.權(quán)利要求10至13中任一項的方法，其中所述方法還包括從糖基化結(jié)構(gòu)中除去末端糖基基團以形成糖接受體基團。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述末端糖基基團的除去是通過使用唾液酸酶酶促進行的。
16.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述方法包括將多個3-氟唾液酸化合物轉(zhuǎn)移至糖接受體。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述多個3-氟唾液酸化合物是作為寡聚體或通過重復(fù)所述綴合反應(yīng)而轉(zhuǎn)移的。
18.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述糖接受體存在于或用于連接至治療性部分，例如多肽。
19.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其還包括將所述綴合物連接至治療性部分。
20.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述方法包括將多個3-氟唾液酸基團轉(zhuǎn)移至多肽上存在的糖基化結(jié)構(gòu)的一個或多個末端糖基殘基。
21.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中用于轉(zhuǎn)移所述3-氟唾液酸基團的酶是唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
22.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中用于轉(zhuǎn)移所述3-氟唾液酸基團的酶是轉(zhuǎn)唾液酸酶。
23.權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的方法，其中所述酶是經(jīng)基因改造而提高轉(zhuǎn)移反應(yīng)速率和/或提高供體3-氟唾液酸分子之結(jié)合的唾液酸轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)唾液酸酶。
24.權(quán)利要求10至23中任一項的方法，其包括將糖基化結(jié)構(gòu)引入多肽中位點的初始步馬聚ο
25.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含聚(亞烷基二醇)分子。
26.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述多肽表示為下式 多肽-AA-L1-Gly其中AA是所述多肽的末端或內(nèi)部氨基酸殘基；L1是共價連接至所述氨基酸AA的任選的接頭基團；Gly表示糖接受體基團，其任選地是糖基化結(jié)構(gòu)的一部分。
27.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述綴合反應(yīng)改變所述多肽的穩(wěn)定性、生物半衰期、清除特性、水溶性和/或免疫學(xué)特征。
28.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述方法是為了提高多肽的糖基化對唾液酸酶水解的抗性。
29.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述多肽是紅細胞生成素、干擾素、白細胞介素、趨化因子、淋巴因子、細胞因子、胰島素、單克隆抗體或其片段、重組抗體或其片段、凝血因子、集落刺激因子、生長激素、纖溶酶原激活物、病毒來源的肽、生殖激素或治療性酶。
30.一種可通過前述權(quán)利要求中任一項的方法獲得的綴合物。
31.一種包含糖基化結(jié)構(gòu)之治療性部分的綴合物，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)共價鍵合至一個或多個3-氟唾液酸基團，其中所述3-氟唾液酸基團形成所述糖基化結(jié)構(gòu)的末端糖基基團。
32.權(quán)利要求31的綴合物，其中所述治療性部分是多肽并且所述糖基化結(jié)構(gòu)在糖基化位點處和/或通過所述多肽的氨基酸殘基連接至所述多肽，任選地通過接頭基團連接至所述多肽。
33.一種糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含一個或多個3-氟唾液酸基團并且其中所述3-氟唾液酸基團共價鍵合至所述糖基化結(jié)構(gòu)的一個或多個末端糖基基團。
34.權(quán)利要求33的糖基化結(jié)構(gòu)，其包含至少一個3-氟唾液酸基團和另外兩個糖單元。
35.一種包含一個或多個末端3-氟唾液酸基團的糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)表示為下式
36.權(quán)利要求35的糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含單觸角結(jié)構(gòu)、雙觸角結(jié)構(gòu)、三觸角結(jié)構(gòu)或復(fù)合糖基化結(jié)構(gòu)。
37.權(quán)利要求35或權(quán)利要求36的糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含天然的或合成的單糖、寡糖或多糖。
38.權(quán)利要求35至37中任一項的糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含N連接的或0 連接的糖基團。
39.權(quán)利要求33至38中任一項的糖基化結(jié)構(gòu)和治療性部分的綴合物，其中的所述糖基化結(jié)構(gòu)共價鍵合至一個或多個3-氟唾液酸基團，其中所述3-氟唾液酸基團形成所述糖基化結(jié)構(gòu)的末端糖基基團。
40.根據(jù)權(quán)利要求31、32或39中任一項的綴合物，其用于醫(yī)學(xué)處理方法中。
41.綴合物，其用于根據(jù)權(quán)利要求40的處理方法，其中所述處理是治療或診斷。
42.根據(jù)權(quán)利要求31、32或39中任一項的綴合物在制備用于治療病癥的藥物中的用途，所述病癥對施用所述治療性部分有響應(yīng)。
43.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求31、32或39中任一項的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
描述了糖基化技術(shù)，且更具體地說，生產(chǎn)糖基化結(jié)構(gòu)的技術(shù)，所述結(jié)構(gòu)耐受酶促降解，因而調(diào)節(jié)其一個或多個生物特性或整合了它們的治療性部分的生物特性，且特別是使活化的含氟糖底物(例如，3-氟唾液酸化合物)與糖接受體反應(yīng)以產(chǎn)生糖接受體與一種或多種唾液酸化合物的共價綴合物的技術(shù)。
文檔編號A61K47/48GK102481377SQ201080031987
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者安德魯·格雷厄姆·沃茨, 特倫斯·坎特納, 阿曼達·芭芭拉·麥肯齊 申請人:巴斯大學(xué)