專利名稱：低度o-糖基化的fgf21的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制備成纖維細胞生長因子21 (FGF21)及其類似物的特殊方法，以及緊密相關的方面。
背景技術：
成纖維細胞生長因子是表達于發(fā)育中組織及成熟組織中的多肽。它們涉及到數(shù)個生理機制，包括例如代謝調節(jié)和細胞分化。存在具有超過20種成纖維細胞生長因子的一整個家族(FGF家族)。包括FGF19、FGF21和FGF23的三個FGF家族成員構成了ー個亞家族，該亞家族具有涉及代謝調節(jié)的內分泌因子的功能。
成纖維細胞生長因子21或FGF-21，這里簡稱為FGF21，優(yōu)先在肝臟內表達并且表現(xiàn)出激素樣的代謝作用。數(shù)十年來，已經(jīng)可能重組制備大范圍的肽和蛋白質，舉例來說在細菌(如大腸埃西氏菌)或酵母(如釀酒酵母)中制備。在酵母中表達的蛋白質經(jīng)常是被0-糖基化的。在藥用蛋白質中，通常應該避免0-糖基化。舉例來說，當在酵母中重組制備吋，人FGF21被高度0-糖基化。US 2002/0068325的權利要求I涉及了ー種在真菌中生產(chǎn)異源蛋白質的方法，該方法包括提供受體真菌細胞，其中在所述細胞中的質量控制機制被修飾，使得不完全折疊的異源蛋白質在內質網(wǎng)中不被降解；然后將多核苷酸表達構建體引入所述受體真菌細胞內。按照其權利要求8，所述受體細胞在包括選自PMT1、PMT2、PMT3、PMT4、PMT5和PMT6的基因的甘露糖基轉移酶基因進行了修飾。所述美國專利申請沒有涉及FGF。發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是克服或改善現(xiàn)有技術的至少ー項缺點，或是提供有用的選擇。本發(fā)明的另ー個方面涉及提供ー種有效制備FGF21及其類似物的方法。本發(fā)明的另ー個方面涉及提供一種制備具有低度0-糖基化或沒有0-糖基化的FGF21及其類似物的重組方法。本發(fā)明的另ー個方面涉及提供一種重組方法，在該方法中FGF21及其類似物的降解被降低。定義
天然人FGF21蛋白的序列可以從UNIPR0T數(shù)據(jù)庫中得到，登錄號為Q9NSA1。209個氨基酸的前體蛋白包括信號肽(氨基酸1-28)和成熟蛋白(氨基酸29-209)。該成熟人蛋白以SEQ ID NO: I (氨基酸1-181)包含于本文中，該信號肽如SEQ ID NO: 2 (氨基酸1_28)所
/Jn o本文中提到的術語FGF21的“類似物”，即FGF21類似物，是指ー種多肽，該多肽是或者可以是由天然人FGF21蛋白(特別是由SEQ ID NO: I)通過氨基酸序列的修飾所得出或衍生出來的。這樣的修飾、修改或改變可包括一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或添加。被取代、缺失和/或添加的氨基酸的數(shù)目總共優(yōu)選不超過10個，優(yōu)選不超過8個，更優(yōu)選不超過6個。舉例來說，氨基酸可以在C-末端、在N-末端或在氨基酸序列內部添加和/或缺失。優(yōu)選氨基酸在C-末端和/或N-末端，更優(yōu)選在N-末端添加和/或缺失。具有C-末端或N-末端氨基酸缺失的氨基酸序列也可被稱為截斷序列，正如本領域中已知的。同樣地，添加入序列內部的氨基酸可被稱為插入序列。術語FGF21類似物指的是具有降葡萄糖作用的化合物。所述降葡萄糖作用可如WO 2010/0841169，尤其是涉及3T3-L1脂肪細胞攝取葡萄糖的能力測定的實施例8中所描述的來檢測。優(yōu)選地，所述FGF21類似物與人FGF21具有至少90%的同一性，優(yōu)選具有至少95%同一性。該同一性可如W02010/084169，尤其是第10和11頁所描述的來檢測。這里，術語“PMT” (蛋白甘露糖轉移酶)指的是ー類酶，該類酶將第一個甘露糖連接在蛋白質中的絲氨酸或蘇氨酸殘基上，產(chǎn)生0-糖基化甘露糖樹。然而，并不是蛋白質中所有的絲氨酸或蘇氨酸殘基都被0-糖基化。PMT家族至少有6種酶(Pmtpl-6)。它們被分為三個亞家族,姆一個亞家族以PmtIp、Pmt2p或Pmt4p來表示。這里，術語“敲除”指的是可讀框的缺失。所述缺失或者可以是可讀框的缺失，或者是可讀框被標記取代?！畼擞洝傅氖墙?jīng)典酵母遺傳學中使用的用于基因缺失以及取代另 一基因取代的基因，后者可根據(jù)其活性而被選擇出來，例如TRPl或KanMX4。在一個實施方式中，這里涉及的所有的氨基酸和氨基酸殘基都是可用核苷酸的三聯(lián)密碼(“密碼子”)編碼的氨基酸和氨基酸殘基，因此相應的FGF21類似物可經(jīng)重組制備。這里，術語“PMT1”指的是蛋白甘露糖基轉移酶I。這里，術語“PMT2”指的是蛋白甘露糖基轉移酶2。這里，術語“PMT4”指的是蛋白甘露糖基轉移酶4。這里，術語“PEP4”指的是蛋白肽酶A。這里，術語“YPS1”指的是YPSl-編碼的天冬氨酸蛋白酶酵母天冬酶1(也被稱為YAP3)。這里，術語“MKC7”指的是糖基-磷脂酰肌醇-關聯(lián)的天冬氨?；鞍酌?。這里，術語“TRP1”指的是磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶I。這里，術語“kanMX”指的是來自Tn903的基因，該基因賦予被轉化的酵母對氨基糖苷類抗生素G418的抵抗性。這里，術語“標記”指的是可根據(jù)基因產(chǎn)物的活性可被選擇出來的基因。發(fā)明簡述
簡要地說，本發(fā)明如權利要求和下面的條款所描述。FGF21及其類似物(例如具有N-末端氨基酸延伸的類似物)可在釀酒酵母中表達。這些N-末端氨基酸延伸可由多達約20個氨基酸，優(yōu)選多達約15個氨基酸構成，并且所有的氨基酸都是可由三聯(lián)密碼編碼并且重組制備的氨基酸。在本發(fā)明中，這就需要株系設計，在該株系設計中得到PMT2、PEP4和YPSl被破壞的株系。該株系可使用傳統(tǒng)的依賴于同源重組的技術來設計，從而允許在各自的位點上進行特異性整合。FGF21及其類似物(例如具有N-末端延伸或突變的類似物)被編碼在釀酒酵母表達載體上，該載體可在釀酒酵母中保持。為了將FGF21類似物導向分泌途徑，可在重組表達載體內提供包括信號肽的前原序列(例如MF-a前原前導序列)。該序列以正確的閱讀框與編碼FGF21類似物的DNA連接。該信號肽確保分泌到培養(yǎng)基。將ニ堿基氨基酸序列置于FGF21類似物序列的上游并鄰近該序列，以確保所述前原序列在分泌到培養(yǎng)基之前由FGF21類似物上剪切下來。所述剪切可能通過Kex2p活性來實現(xiàn)。該FGF21類似物可從培養(yǎng)基上獲得。令人驚訝的是，本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當使用野生型酵母時出現(xiàn)的0-糖基化的FGF21及其類似物的問題通過破壞表達株系中的PMT2而得以解決。通過從野生型酵母株系中缺失PMT2，F(xiàn)GF21及其類似物的0-糖基化得到降低。發(fā)明詳述
在野生型釀酒酵母株系中表達FGF21已經(jīng)被證明存在著FGF21及其類似物被高度0-糖基化的問題。本發(fā)明描述了通過在pmt2敲除的酵母株系中表達FGF21及其類似物來解決這個問題。這是ー種株系，其中編碼蛋白甘露糖基轉移酶2(Pmt2p)的宿主PMT2基因以不可逆的方式被去除。在野生型酵母中，編碼Pmt2p的基因可通過常規(guī)技術被破壞，該技術依賴于同源重組，允許野生型PMT2基因通過將缺失型等位基因整合于PMT2基因座來進行特異性取代，使用另ー個基因作為選擇標記。所述選擇標記是可根據(jù)其活性而被選擇出的基因，例如 TRP1、KanMX4或其它標記。隨后，F(xiàn)GF21及其類似物可由在該敲除酵母株系中的表達質粒所表達，導致0_糖基化降低。為了避免所表達蛋白被降解，將pmt2敲除和蛋白酶PEP4、YPS1 (YAP3)和MKC7(YPS2)基因敲除結合起來是有利的。通常，將DNA以適當方向以及正確的閱讀框內插入表達載體(例如質粒)內用于表達。然后將該載體通過標準技術引入宿主，該載體通常需要根據(jù)轉化的宿主細胞來選擇。然后，根據(jù)此處所披露的教導，經(jīng)本發(fā)明所使用的重組DNA所轉化的宿主細胞在本領域技術人員所知的合適的條件下培養(yǎng)足夠的時間，從而允許有待按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的FGF21及其類似物表達和分泌。本領域的技術人員能夠選擇培養(yǎng)基與合適的培養(yǎng)條件，從而在培養(yǎng)后自培養(yǎng)基獲得FGF21。有用的酵母質粒載體包括cPOT (Kjeldsen 等.Gene 170: 107-112，1996)和YEpl3、YEp24 (Rose 和 Broach, Methods in EnzymoI. 185: 234-279，1990)、以及 pG 質粒(Schena 等.Methods in Enzy-mol. 194: 289-398，1991)。轉化釀酒酵母的方法包括原生質球轉化、醋酸鋰轉化和電穿孔，參照Methods inEnzymoI. 194 (1991)。優(yōu)選地,轉化方法如本發(fā)明實施例所述。釀酒酵母的合適啟動子包括MF a I啟動子、半乳糖誘導型啟動子(例如GAL1、GAL7和GAL10啟動子)、糖酵解酶啟動子(包括TPIl和PGKl啟動子)、TRPl啟動子、CYCl啟動子、CUPl啟動子、PH05啟動子、ADHl啟動子和HSP啟動子。適合畢赤酵母屬(Pichia)使用的啟動子是AOXl (甲醇利用)啟動子。轉錄終止信號優(yōu)選為真核基因的3’側翼序列，該序列含有合適的轉錄終止和多聚腺苷化的信號。合適的3’側翼序列可以是例如天然連接到所用的表達控制序列(即相應于啟動子)的基因的3’側翼序列。用于提供所需FGF21或其類似物的分泌性表達的DNA構建體包含DNA序列，該序列包括通過酵母加工信號連接到多肽的前導序列。該前導序列含有用于蛋白質在內質網(wǎng)上轉運的信號肽(“前序列”)，并且可選擇地含有附加序列(“原序列”)，該附加序列在多肽被釋放至周圍的培養(yǎng)基之前，在酵母細胞內可或不可被剪切。有用的前導序列是釀酒酵母MF a lp、MF a I*、Yap3p、Barlp 和 Hspl50p 的信號肽和克魯維酵母(5 kluyveri)的 MF a信號肽和釀酒酵母MF a l、Yap3p、Prcp、HSpl50p以及克魯維酵母MF a的前原序列，以及WO92/11378, WO 90/10075和WO 95/34666所描述的合成前導序列。編碼所需FGF21或其類似物的DNA序列可以是基因組或cDNA來源的，例如按照標準技術(見，例如 Sambrook, J, Fritsch, EF and Maniatis, T in Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989),通過制備基因組或cDNA文庫，然后使用合成的寡核苷酸探針通過雜交來篩選出編碼全部或部分所述多肽的DNA序列來獲得。編碼FGF21或其類似物的DNA序列也可通過已建立的標準方法來合成制備，所述方法例如由Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869 中所描述的亞磷酰胺法，或由 Matthes 等在 EMBO Journal 3 (1984)，801-805中所描述的方法。該DNA序列也可使用特異性的引物通過聚合酶鏈反應來制備，例如 US 4，683，202 或由 Saiki 等在 Science 239 (1988)，487-491 中所述。在該pmt2敲除株系中FGF21或其類似物的表達與使用非pmt2敲除株系的表達水平相比，在表達水平上并沒有任何實質的量的改變，但是，如上面所述的，顯著地降低了 0-糖基化。在本發(fā)明的一個實施方式中，F(xiàn)GF21或其類似物的表達用YPS1、PEP4和PMT2敲除的酵母株系進行。在本發(fā)明的一個實施方式中，F(xiàn)GF21或其類似物的表達用YPS1、PEP4和MKC7敲除的酵母株系進行。在本發(fā)明的一個實施方式中，F(xiàn)GF21或其類似物的表達用YPS1、PEP4、MKC7和PMT2敲除的酵母株系進行。在本發(fā)明的一個實施方式中，F(xiàn)GF21類似物含有在17位和/或36位上的丙氨酸或組氨酸。因此，降解的程度被降低。如果是制備人FGF21，則本發(fā)明的方法在所獲得的0_糖基化FGF21和非0_糖基化FGF21的比值(重量/重量)低于約20%、優(yōu)選低于約10%、更優(yōu)選低于約5%、再更優(yōu)選低于約2%的條件下進行。類似地，在制備FGF21類似物吋，該條件也適用。本發(fā)明的優(yōu)選方面
為了總結和補充上述內容，本發(fā)明特點如下所述
I.ー種在酵母中重組表達人FGF21及其類似物的方法，其中所用的酵母是pmt2敲除株系。2.按照條款I的方法，其中制備具有N-末端延伸的FGF21類似物。3.按照條款I的方法，其中所用的酵母是釀酒酵母。4.按照條款I或2的方法，其中所用的酵母是p印4敲除株系。5.按照前述任一條款的方法，其中所用的酵母是ypsl敲除株系。6.按照前述任一條款的方法，其中所用的酵母是mkc7敲除株系。7.按照前述任一條款的方法，其中所述酵母在外源DNA序列得到表達的條件下進行培養(yǎng)，并且回收所需的FGF21或其類似物。8.按照前述任一條款的方法，其中所述FGF21被分泌至培養(yǎng)基內。9.按照前述任一條款的方法，其中所述敲除pmt2的酵母株系使用TRPl標記或KanMX4標記、優(yōu)選TRPl標記來制備。
10.按照前述任一條款的方法，所述一方面產(chǎn)生的0-糖基化的FGF21或其類似物與另一方面產(chǎn)生的非0-糖基化的FGF21或其類似物的比值(重量/重量)低于約20%，優(yōu)選低于約10%，更優(yōu)選低于約5%，再更優(yōu)選低于約2%。11.按照前述任一條款的方法，其中所制備的FGF21類似物在R17和/或R36位上
發(fā)生了突變。12.按照前述任一條款的方法，其中所制備的FGF21類似物在R17和/或R36位上發(fā)生了突變，優(yōu)選獲得在酵母表達中的低降解。13.按照前述方法的任ー項方法所制備的人FGF21。14.本文所述的任意新的特征或特征的組合，尤其是在條款或權利要求中所描述 的特征。結合所述的ー個或多個條款以及實施方式，還可選擇地結合一個或多個下述的權利要求，得出進ー步的實施方式，本發(fā)明涉及所述條款、實施方式和權利要求的所有可能的組合。提供以下的實施例用于說明，而非限制。
實施例通用程序。所有的表達質粒都是cPOT型的，類似于EP 171，142中所描述的那些質粒。這些是基于的表達載體,其特征在于含有非洲栗酒裂埴酵母(Schizosaccharomyces pombe)的磷酸丙糖異構酶基因(POT)，用于在釀酒酵母中進行質粒選擇和穩(wěn)定化。該質粒還含有釀酒酵母磷酸丙糖異構酶的啟動子和終止子。這些序列與質粒pKFN1003(W0 90/10075所描述的)中的相應序列相似。為了便于克隆不同的融合蛋白，編碼MFa I前原前導序列的DNA序列被改變加入了 NcoI位點，被稱為MFa I*前原前導序列。這樣，NcoI-Xbal片段被編碼FGF21構建體或其類似物的構建體的NcoI-Xbal片段簡單地取代。這種NcoI-Xbal片段可按照標準技術使用合成的寡核苷酸以及PCR所合成。除了 a-前導序列(alpha-leader)以外，其它前導序列也可使用。酵母轉化株及其衍生物通過轉化宿主釀酒酵母來制備。該酵母株系在液體YPGGE (1%細菌用酵母抽提物，2%細菌用蛋白胨，2%半乳糖，2%甘油，1%こ醇)中生長至0. D.值在600nm為0. 6。離心得到IOOml的培養(yǎng)物，用IOml的水清洗，再次離心并重新懸浮于含有I. OM山梨糖醇、25mM Na2EDTA pH 8. 0和6. 7mg/ml ニ硫蘇糖醇的IOml溶液中。該懸浮液在30°C下孵育15分鐘，經(jīng)離心，細胞重新懸浮于含有I. 0 M山梨糖醇、IOmM Na2EDTA,
0.IM朽1樣酸鈉，pH 5. 8和2mg Glucanex 200G (Novozyms)的IOml溶液中。該懸浮液在30°C下孵育30分鐘，細胞經(jīng)離心收集，在IOml的I. 2M山梨糖醇和IOml的CAS (I. OM山梨醇糖、IOmM CaCI2UOmM Tris HCI，pH 7.5)中清洗，然后重新懸浮于2ml的CAS中。為了轉化，Iml的CAS懸浮細胞與約0. Img的質粒DNA混合，置于室溫下15分鐘。加入Iml的(20%聚こニ醇4000、IOmM CaCI2, UOmM Tris HCI、pH 7. 5)，混合物于室溫下再放置30分鐘。將混合物離心，并將沉淀重新懸浮于0. Iml的SOS (I. 2 M山梨醇糖、33% v/v YPD,6. 7mM CaCI2),在30°C下孵育2小吋。隨后離心懸浮液并將沉淀重新懸浮于0. 5ml的I. 2M的山梨醇糖中。然后，在52°C下將6ml的含有I. 2M山梨糖醇加2. 5%瓊脂的上層瓊脂(Sherman等的 SC培養(yǎng)基，(1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory)加入，然后懸浮液傾倒在含有相同瓊脂固化的、含有山梨糖醇的培養(yǎng)基的平板的頂部。實施例I
ME1487 中的 pmtl: :KanMX4、pmt2: : KanMX4 和 pmt4: : KanMX4 基因破壞PMT2基因缺失且基因型為 Mat a his3Dl leu2D0 lys2D0 ura3D0 yal023c: : kanMX4 的酵母株系 BY4741_pmt2 購自 Euroscarf 缺失株系保藏中心(Euroscarf deletion straincollection)。在該酵母株系中，編碼PMT2可讀框的DNA片段被KanMX4顯性選擇標記所替換，所述標記賦予對抗生素G418/遺傳霉素(Wach等，Yeast 10 (1994) 1793-1808)的抗性?；蚪MDNA由BY4741分離出，被用作標準PCR反應的模板，反應使用合成的寡核苷酸 oILLa-0056: CCGTTTCGTGTACTGTTTA 和 oILLa-0079: GGCTAAAGGGTTCAAGAAAT,目的是為了擴增含有Apmt2: :KanMX4缺失等位基因盒的合成DNA片段。該DNA片段直接用于轉化 含有表達FGF21 的cPOT質粒的ME1487: MATa, tpi::LEU2 p印4-3 leu2 ura3 ypsl: :URA3(Egel-Mitani 等.Enzyme and Microbial Technology 26 (2000), 671-677)。酵母的轉化通過醋酸鋰/單鏈載體DNA/聚こニ醇法(Methods in Enzymology: 350, 87 - 96)來進行。轉化后，該酵母細胞鋪板于YEro (1%酵母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)瓊脂上，在30°C下孵育過夜，隨后在選擇性的YEH)瓊脂+200mg/L G418上進行影印鋪板。分離進一歩于30°C孵育3天以后出現(xiàn)的酵母菌落，然后進行PCR分析，該分析核實了將pmt2: :KanMX4等位基因正確整合入PMT2基因座，這樣就證實了野生型等位基因被缺失等位基因取代。所產(chǎn)生的株系 yDNP-255 是 MATa，tpil: :LEU2 p印4-3 leu2 ura3 ypsl: :URA3pmt2: :kanMX4。yDPN-255 含有表達 FGF21 的 cPOT 質粒。類似地，破壞PMTl和PMT4基因座，產(chǎn)生了以下株系yDNP_257: MAT a，tpiI::LEU2 pep4_3 leu2 ura3 ypsl::URA3 pmtl::kanMX4 和 yDNP-260: MAT a ,tpil: :LEU2 pep4_3 leu2 ura3 ypsl: :URA3 pmt4: :kanMX4。這二者均含有表達 FGF21 的cPOT質粒。實施例2
NNY574 中的 pmt2: : TRPl-FA 基因破壞
如 Horecka 和 Jigami 所述(Horecka 和 Jigami Yeast 15 (1999) 1769-1774;ihe trpl—FA designer deletion for PCR-Dased gene functional analysis inSaccharomyces cerevisiae. Yeast 15, 1769-1774),將營養(yǎng)缺陷型標記 trpl-FA 缺失引入釀酒酵母bagground株系，以促進經(jīng)典的ー步敲除相關基因的實現(xiàn)。從TRPl基因座上缺失的片段正對應于在許多酵母載體內攜帯的被稱為TRPl-FA的盒，并且該片段由以下組分構成來自5’-非翻譯區(qū)的141個bp、隨后是TRPl可讀框，隨后是來自3’-非翻譯區(qū)的50個bp。為了引入trpl-FA缺失，目標株系用PCR片段轉化，該片段含有融合的來自TRPl-FA區(qū)域的更上游和下游的5’-和3’-非翻譯區(qū)，以實現(xiàn)經(jīng)典的一歩TRPl-FA的缺失。TRPl-FA區(qū)域的缺失通過PCR得到驗證。然后該株系通過用含有所述TRPl-FA盒的DNA片段轉化，然后進行TRPl-FA標記表現(xiàn)型的選擇，實現(xiàn)了 PMT2基因的缺失，其中TRPl-FA盒的側翼具有pmt2的5’ -非翻譯區(qū)和pmt2的3’ -非翻譯區(qū)。將pmt2: :TRPl-FA等位基因重組于PMT2基因座內導致野生型PMT2基因被pmt2: :TRPl-FA等位基因所取代。所分離的酵母細胞通過經(jīng)典的酵母遺傳學方法進行表征。正確的整合通過PCR得到了確認。
實施例3
使用蛋白質印跡分析，檢測與野生型株系相比較pmtl、pmt2和PMpmt4敲除對FGF21表達的影響。來自于分泌FGF21的培養(yǎng)的酵母株系的培養(yǎng)基樣本在Mes-SDS緩沖液中的4-12%的BisTris SDS PAGE上電泳。將凝膠中的蛋白質轉移到硝化纖維素上，然后用多克隆FGF21抗體羊 FGF21 (Santa Cruz sc-16842)和驢抗羊 IgG-HRP 第二抗體(Santa Cruz sc-2020)進行免疫染色。使用化學熒光檢測法進行檢測。結果顯示，在野生型株系中，F(xiàn)GF21作為雙帶移動。當PMT4被缺失時對其沒有影響。當PMTl被缺失時對其有一些影響，但是當PMT2被缺失后，F(xiàn)GF21作為單帶移動且0-糖基化顯著降低。實施例4
從宿主上缺失PMT2基因可用于在釀酒酵母中分泌性地表達FGF21類似物。在FGF21類似物中，氨基酸可被修改或改變、取代、缺失，和/或一個或多個氨基酸可添加、或者是其組合。當在PMT2基因缺失的釀酒酵母宿主中表達FGF21類似物吋，0-糖基化顯著降低。這 可通過對分泌FGF21或FGF21類似物的釀酒酵母株系的培養(yǎng)的生長培養(yǎng)基進行蛋白質印跡分析觀察到，如實施例3所描述的。當由野生型株系分泌吋，F(xiàn)GF21及其類似物作為雙帶移動。當由pmt2敲除的釀酒酵母宿主表達時，該情況發(fā)生變化。人FGF21和FGF21類似物會作為單帶移動。為了進行FGF21類似物的表達，將所需的序列插入cPot表達載體，然后轉化進入上面實施例3所描述的pmt2敲除的株系中。得到了含有以下突變、插入和/或延伸的FGF21類似物
1)-1G, K56R, K59R, K69R, K122R
2)-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, K56R, K59R, K69R, D102E, N121Q, K122R, M168L
3)-14E, -13E, -12A, -HE, -10A, -9G, -8G, ~lk, -6G, -5G, -4S, -3G, -2G,-IS, K56R, K59R, K69R, K122R
4)-15E, -14E, -13S, -12A, -11A, -10S, -9G, -8A, ~lk, -6A, -5G, -4S, -3A,-2A, -1A, K56R, K59R, K69R, K122R)
5)K56R, K59R, K69R, K122R)
6)-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, K56R, K59R, K69R, K122R)
7)-IG
來自分泌以上化合物的酵母培養(yǎng)物的上清液經(jīng)如實施例3所述的蛋白質印跡進行分祈。觀察到僅有用多克隆FGF21抗體顯示的單帶出現(xiàn)在蛋白質印跡上，而不是像野生型釀酒酵母中的FGF21的雙帶，證實了在表達株系中缺失pmt2的效果。用于以上化合物的命名法在WO 2010/084169(特別是第6_11頁)中所描述。實施例5
采用應用LC/MSD TOF工具(Agilent)進行的LC-MS分析，檢測酵母上清液中所分泌的肽的分子量，該分析按照制造者所推薦的設置。使用附隨的軟件進行TIC色譜的去卷積。從去卷積化的光譜里獲得全長的以及0-糖基化的種類的豐度，將其應用于估計全長肽占全長的以及被0-糖基化的FGF21總和的百分數(shù)。本文所引用的所有參考文獻(包括出版物、專利申請和專利)在此通過全文參照被加入，如同每ー篇參考文獻被獨立而具體指明通過參考而引入并且在此被全文提出(法律所允許的最大程度)。本文中弓I述和加入專利文獻僅用于方便的目的，并不反映任何有關于這些專利文獻的有效性、可專利性和/或可實施性的意見。在本文中提及參考文獻并非承認它們構成現(xiàn)有技木。本文所用的所有的標題和副標題僅僅是為了方便，不應解釋為對本發(fā)明的任意限制。
本文中任意的和所有的實施例或示例性語言(例如“例如”)的使用，除非另有聲明，僅僅為了更好地說明本發(fā)明而非對本發(fā)明范圍的限制。說明書中的語言不應被解釋為表明任意非要求保護的元素為實施本發(fā)明所必需的。這里，“包含”ー詞被廣泛解釋為“包括”、“含有”或“由…組成”的含義(參閱EPOguidelines C，III, 4. 13)。本發(fā)明包括被適用法律所允許的引述于權利要求和隨附條款的主題的所有修改和等同物。
權利要求
1.ー種在酵母中重組表達FGF21及其類似物的方法，其中所使用的酵母為pmt2敲除株系。
2.如權利要求I所述的方法，其中制備具有N-末端延伸的FGF21類似物。
3.如權利要求I所述的方法，其中所使用的酵母為釀酒酵母。
4.如權利要求I或2所述的方法，其中所使用的酵母為pep4敲除株系。
5.如前述權利要求任一項所述的方法，其中所使用的酵母為ypsl敲除株系。
6.如前述權利要求任一項所述的方法，其中所使用的酵母為mkc7敲除株系。
7.如前述權利要求任一項所述的方法，其中所述酵母在外源DNA序列得到表達的條件下進行培養(yǎng)，并且回收所需的FGF21或其類似物。
8.如前述權利要求任一項所述的方法，其中所述FGF21被分泌至培養(yǎng)基中。
9.如前述權利要求任一項所述的方法，其中所述敲除pmt2的酵母株系使用TRPl標記或KanMX4標記、優(yōu)選使用TRPl標記制備。
10.如前述權利要求任一項所述的方法，其中一方面O-糖基化的FGF21或其衍生物與另ー方面的非0-糖基化的FGF21或其類似物的比值(重量/重量)低于約20%，優(yōu)選低于約10%，更優(yōu)選低于約5%，再更優(yōu)選低于約2%。
11.如任一項所述的方法，其中所制備的FGF21類似物在R17和/或R36位上發(fā)生了突變。
12.如前述方法權利要求任一項所述的方法所制備的FGF21。
13.本發(fā)明所描述的任意新的特征或特征的組合，尤其是在說明書條款或權利要求書中所描述的特征。
全文摘要
FGF21在釀酒酵母pmt2敲除株系中的表達顯著地減少了O-糖基化，但并不降低表達水平。在mkc7敲除株系中的表達可降低FGF21及其類似物的降解。在位點R17和R36上的點突變可降低FGF21及其類似物在酵母內表達時的降解。
文檔編號C12P21/00GK102791730SQ201180006741
公開日2012年11月21日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權日2010年1月22日
發(fā)明者I.勞特魯普-拉森, R.斯拉比 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司